ВИРУСЫ ГРИППА ТИПА А

Вирус гриппа человека выделен в 1933 г. Смитом, Эндрюсом и Лейдлоу путем заражения хорьков смывами носоглотки больного гриппом Вильсона Смита (отсюда название первого штамма WS).

Морфология. Вирус имеет сферическую форму, диа­метр вирусной частицы 80—120 нм (см. рис. 7, а). В пре­паратах свежевыделенных от больного вирусов встречают­ся нитевидные формы значительной длины. Вирус содержит липопротеидную оболочку, покрытую шипи-ками длиной около 10 нм. Шипики образованы двумя гликопротеидами — гемагглютинином и нейраминидазой. Шип гемагглютинина образован тремя молекулами белка, шип нейраминидазы образован четырьмя молекулами белка (рис. 43).

Внутренним компонентом вирионов является нуклео-капсид спиральной симметрии с диаметром около 9 нм. Он уложен в виде двойной спирали с диаметром 50—60 нм с односпиральной петлей на конце.

В соответствии с 8 фрагментами генома имеется 8 фрагментов нуклеокапсида. В составе вирионов между фрагментами существует слабая связь.

Химический состав и физико-химические свойства.Вирус содержит по массе 1—2%РНК, 50—70% белков, 18—37% липидов, 5—9% углеводов. Липиды содержатся в липопротеидной оболочке, углеводы — в составе гликопротеидов. И липиды и углеводы имеют клеточное проис­хождение.

Рис. 43. Строение вириона гриппа (схема). а—мономер гемагглютинина: 1—малая субъединица гемагглютинина; 2— большая субъединица гемагглютинина; 3— место нарезания гемагглютинина-. предшественника; 4— С-конец малой гемагглютинирующей субъединицы, погруженный в липиды; 5— N-конец большой гемагглютинирующей субъеди­ницы, взаимодействующий с рецепторами клетки; б— антигенная детерминанта;

6 — тример гемагглютинина; в — мономер нейраминидазы; 7— гидрофильный участок нейраминидазы; 8 — стержень нейраминидазы; 9 — гидрофобный участок нейраминидазы; г — тетрамер нейраминидазы; 10 — нейраминидаза в составе вириона; 11—гемагглютинин в составе вириона; 12—липидный бислой наружной оболочки вириона; 13 — слой матриксного белка; 14 — рибонуклеопротеид.

Молекулярная масса вирусной частицы 250- 10⁶, плавучая плотность в сахарозе 1,19 г/см³. Фрагменты нуклеокапсида имеют длину от 50 до 130 нм; плавучая плотность нуклеокапсида в хлориде цезия 1,34—1,35 г/см³.

Геном. Геном представлен 8 фрагментами однонит­чатой линейной «минус-нитевой» РНК. Молекулярная масса отдельных фрагментов от 0,2- 10⁶ до 1- 10⁶, общая молекулярная масса 5- 10⁶. Каждый фрагмент, за исключением 7-го и 8-го, кодирует один белок, фраг­менты 7 и 8 кодируют по два белка с уникальными последовательностями аминокислот, благодаря сплайсингу и сдвигу рамки при трансляции.

Определена первичная структура всех генов вируса гриппа.

Белки, антигены. В составе вируса гриппа содержится 7 белков.

Белки р[, Pa, Рз названы по первой букве слова «по-лимераза», поскольку предполагалось, что все три являют­

ся субъединицами РНК-полимеразы. На самом деле, РНК-полимеразой является белок Pi. Белок Рз обладает свой­ствами эндонуклеазы, «откусывая» «шапочку» у клеточных иРНК вместе с 10—13 прилегающими нуклеотидами и перебрасывая ее на 5^/-кoнeц вирусного транскрипта. Функции белка Рг неизвестны. Белки Pi и Рз обладают основными свойствами, а белок ?2 — кислыми, поэтому их еще называют PBi (Pi), PB2 (Рз) и РА (Рз). Все три белка находятся в составе нуклеокапсида и образуют комплекс, интимно связанный с геномом.

Мономер гемагглютинина имеет форму палочки длиной 14 нм и диаметром 4 нм, которая одним концом (С-конец легкой цепи) погружена в липидный бислой (рис. 44). Субъединица гемагглютинина представляет собой тример.

Гемагглютинин синтезируется в виде предшественника, который нарезается протеолитическими ферментами на две субъединицы, тяжелую цепь (НА1) и легкую (НА2) с молекулярными массами примерно 50 000 и 25 000, связанные дисульфидными связями.

С помощью рентгеноструктурного анализа кристал­лизованного НА, сделанного Д. Скейлом с соавт., предло­жена его пространственная модель. Согласно этой модели в тримере НА обнаруживаются два структурных участ­ка — стебель и глобула. Глобула содержит антигенный и рецепторный участки (см. рис. 44). Она состоит только из НА1, а стебель — из обеих субъединиц (НА1 и НА2).

Обнаружено четыре предполагаемые зоны антигенов А, В, С, D. Зона антигена А является петлей, которая образуется между тримерами. Эти зоны соответствуют четырем антигенным детерминантам. Все они связаны с тяжелой цепью гемагглютинина. Две из них являются последовательными, а две образуются при взаимодействии мономеров. Третья обусловлена третичной структурой, четвертая — четвертичной структурой и формируется путем взаимодействия трех мономеров (см. рис. 44). Наиболее активными антигенными детерминантами яв­ляются 1-я и 2-я.

Гемагглютинин является основным специфическим антигеном вируса, определяющим, наряду с нейрамини-дазой, подтип вируса и вызывающий образование про-тективных антител. Свойство гемагглютинина,к антиген­ной изменчивости обусловлено двумя генетическими процессами — дрейфом и шифтом. В результате' дрейфа происходят незначительные изменения генаНА, обуслов­ленные точечными мутациями, а - антигенные свойства

Рис. 44. Гемагглютинин вируса гриппа.

а — тример с четырьмя антигенными детерминантами (черные квадратики^ и участком взаимодействия с клеточным рецептором (белый квадратик — рецепторный карман); б — структура мономера по данным рентгеноструктур-ного анализа. Цифры обозначают порядковый номер аминокислот, кружки, квадраты и треугольники—4 антигенные детерминанты (А, В, С и D), 1—' место нарезания предшественника (N-конец. малой субъединицы), S-S-дисуль" фидные связи.

меняются незначительно, но при продолжительном периоде циркуляции вируса под влиянием коллективного иммунитета селекционируются варианты, значительно отличающиеся по антигенным свойствам от прототипного штамма. Шифт возникает в результате полной смены гена и обусловлен их пересортировкой при одновременной репродукции в клетке двух вирусов гриппа.

Вирус агглютинирует эритроциты кур, морских свинок, человека и многих других видов животных. При низких значениях рН (5,0—5,5) вирус вызывает гемолиз эритро­цитов.

Нейраминидаза является ферментом, катализирующим отщепление сиаловой кислоты от субстрата. Мономер нейраминидазы под электронным микроскопом имеет вид

барабанной палочки и состоитиз головки, обращенной кнаружи, размером 4Х4Х4 нм и ножки длиной 10 нм. Соединение двух мономеров происходит за счет дисуль-фидных связей, а двух димеров в тетрамере — за счет межмолекулярных связей. Активные центры и антигенные детерминанты находятся на головках мономеров.

Нейраминидаза может изменяться независимо от гемагглютинина, в основе антигенной изменчивости также лежат процессы дрейфа и шифта. Антитела против нейраминидазы не оказывают такого защитного дей­ствия, как антитела против гемагглютинина, однако, они частично нейтрализуют вирус и ослабляют инфекционный процесс.

Нуклеопротеид (NP) — основной внутренний белок вируса, формирующий субъединицы капсида.Он интимно связан с геномом в течение всего периода репродукции вируса, но не препятствует экспрессии генома. Этот белок является типоспецифическим антигеном, общим для всех вирусов типа А. Антитела к NP не оказывают защитного действия и применяются с целью диагностики инфекции.

Матриксный белок — самый низкомолекулярный белок в составе вириона, локализованный на внутренней поверх­ности липопротеидной мембраны вируса. m|-белок играет роль медиатора при сборке вирусной частицы. Mi-белок является стабилизирующим фактором, при его отсутствии или уменьшении концентрации вирусная частица стано­вится хрупкой и быстро распадается.

Матриксный белок, как и NP, является типоспецифи­ческим антигеном, общим для всех вирусов типа А. Белок М2, который кодируется тем же седьмым геном, является неструктурным и локализован в клеточной оболочке.

Белки ns] и NSz — неструктурные вирусные белки, которые хотя и кодируются одним (восьмым) геном, имеют уникальные последовательности аминокислот благодаря трансляции со сдвигом рамки. Белок ns) синтезируется на самых ранних этапах репродукции. В ядре и цитоплазме он накапливается в больших коли­чествах и образует включения.

Чувствительность к физическим и химическим факто­рам. Вирус гриппа относительно стабилен и может сохра­няться при температуре 4° С в течение недели. Инфек­ционная активность сохраняется продолжительное время при хранении при температуре —70° С. Прогревание при температуре 50—60° С уничтожает его активность

в течение нескольких минут. Вирусы чувствительны к эфи­ру, детергентам. При низких значениях рН (3,0 и ниже) инфекционная активность теряется.

Репродукция. Вирус адсорбируется на клеточных рецепторах, содержащих сиаловую кислоту (гликопро-теидах или ганглиозидах). Проникновение вируса в клетку Осуществляется обычно по механизму рецепторного Эндоцитоза с последующим слиянием вирусной мембраны со стенкой вакуоли и выходом нуклеокапсида в цито­плазму, а затем в ядро. Слияние происходит при низких значениях рН, которые создаются в эндоцитарной вакуо­ли — рецептосоме. Транскрипция и репликация генома происходят в ядре в составе нуклеокапсида.

Затравкой для транскрипции является КЭП, «шапоч­ка», которая вместе с 10—13 нуклеотидами отрезается от клеточных и РНК, находящихся в ядре (отсюда необ­ходимость ядерной локализации транскрипции), и пере­брасывается на 5'-конец вирусного транскрипта.

На ранней стадии с наибольшей скоростью синтези­руются иРНК для белков NS и NP, на поздней стадии — иРНК для белков НА, NA, М. Соответственно белки NS и NP являются ранними, а НА, NA и М — поздними. Белки Р синтезируются на протяжении инфекционного цикла с одинаковой скоростью.

Нуклеокапсиды транспортируются из ядра в цитоплаз­му и затем к клеточной оболочке к тем ее модифици­рованным участкам, на которых снаружи находятся вирус­ные гликопротеиды, а со стороны цитоплазмы — Mi-белок. Вирус выходит из клетки путем почкования.

Патогенез и клиника. Вирус гриппа попадает в орга­низм через дыхательные пути вместе с каплями влаги и частицами пыли. Чем меньше величина капель и частиц, тем глубже проникает вирус в дыхательные пути. Благо­даря короткому инфекционному циклу вируса (6—8 ч) при попадании в верхние дыхательные пути одной вирус­ной частицы уже через 8 ч количество инфекционного потомства достигает 10³, а к концу первых суток — 10²⁷. Эти расчеты объясняют столь короткий инкубационный период при гриппе — 1—2 сут. Репродукция вируса происходит в клетках эпителия слизистой оболочки дыхательных путей.

Может развиться первичная пневмония с некрозом Эпителия бронхиол. Пораженные клетки отторгаются, а продуктыих распада всасываются, попадают в кровь, вызывая интоксикацию организма и лихорадочное состоя­

ние. Вирус проникает в кровь и разносится по всему организму. Активация вирусом всей системы протеолиза и повреждение клеток эндотелия капилляров приводит к повышенной проницаемости сосудов, кровоизлияниям и дополнительному повреждению ткани. Возникают патологические изменения в почках, мозге. В результате повышенной проницаемости сосудов может возникнуть отек мозга с летальным исходом. Это случай так назы­ваемого молниеносного гриппа, когда смерть наступает на 2—3 сут. Вирус гриппа, попадая в кровь, вызывает угнетение кроветворения и иммунной системы, развивается лейкопения, может присоединиться интеркурентное забо­левание, наблюдаются осложнения, вызванные бакте­риями и другими вирусами — затяжные риниты, гнойные синуситы, отиты, вторичные вирусные бронхиты и. пнев­монии.

Однако описанное беспрепятственное распространение вируса в организме имеет место далеко не во всех слу­чаях и может быть приостановлено при включении в про­цесс факторов неспецифического и специфического имму­нитета, таких как неспецифические ингибиторы, находя­щиеся в крови, имеющиеся у больных антитела, интерферон. В результате развитие вирусной инфекции замедляется или прерывается, а через несколько суток появляются специфические антитела класса IgM, которые «защищают» организм. Антитела класса IgG появляются лишь спустя 2 нед после начала заболевания и их роль состоит в защи­те против повторного заражения данным серовариантом вируса гриппа.

Для клинического течения гриппа характерно быстрое развитие инфекции с высокой температурой, общей интоксикацией, воспалительными процессами в дыхатель­ных путях. Температура достигает 38—39° С и более. Общая интоксикация выражается в головной боли, боли в глазных яблоках, резком угнетении. Развиваются симп­томы местного поражения дыхательных путей — насморк, кашель, боли за грудиной. Поражение эндотелия стенок кровеносных сосудов приводит к точечным кровоизлия­ниям в верхних дыхательных путях, трахее, бронхах. Если развивается первичная гриппозная пневмония, она имеет геморрагический характер, и мокрота содержит прожилки крови.

Иммунитет. Пассивный иммунитет, передаваемый от матери, сохраняется у детей на протяжении первых месяцев жизни. После перенесенного заболевания возни­кает стойкий иммунитет.

Повторные заболевания гриппом обусловлены не кратковременностью иммунитета, а появлением новых серовариантов вируса гриппа, против которых у населения нет иммунитета.

В иммунитете против гриппа большую роль играют антитела классаIgA, накапливающиеся в секрете слизис­той оболочки полости носа.

Эпидемиология. Эпидемиология гриппа своеобразна и не имеет аналогов среди других инфекционных заболе­ваний. Грипп передается воздушно-капельным путем. Больной или носитель (часть зараженных переболевает гриппом в инаппарантной или стертой форме) выделяют вирус вместе со слизью носоглотки и верхних дыхатель­ных путей не только при кашле и чиханье, но и при разговоре. Так как инкубационный период болезни очень короток и не превышает 1—2 дней, то возникшая эпиде­мия распространяется довольно быстро, охватывая все новые и новые восприимчивые контингенты населения. Дальнейшее развитие эпидемии регулируется иммуните­том, который развивается после болезни через 1—1 '/2 нед, и поэтому по мере нарастания иммунной прослойки эпи­демия гриппа идет на убыль. В условиях даже большого города на это уходит около месяца, а при нынешних широких связях между странами и быстрых транспортных средствах эпидемии гриппа в течение немногих месяцев охватывают население многих стран, нередко — все полу­шарие или даже всю планету. Такие обширные эпидемии называются пандемиями.

Причиной повторных эпидемий гриппа и повторных заболеваний является уникальная изменчивость белков вирусов гриппа (гемагтлютинина и нейраминидазы) в результате шифта и дрейфа. Люди, болевшие ранее гриппом, полностью восприимчивы к новому сероварианту вируса, к которому нет коллективного иммунитета, он начинает безудержно распространяться среди населения всего земного шара, вызывая пандемию гриппа.

' Первая достоверно документированная пандемия гриппа (ретроспективно мы знаем, что это был грипп типа А) возникла в 1889 г. Предполагается, что она началась в Китае, а затем в течение ближайших 1 '/2— 2 лет распространилась на все страны мира.

Следующая пандемия гриппа возникла через 29 лет — в 1918 г. За два года она распространилась во все страны мира и от нее погибло около 20 млн. человек. Никогда до этого и после этого грипп не протекал так тяжело.

На основании иммунологических исследований было установлено, что пандемия была вызвана вирусом, цирку­ляция которого к началу 30-х годов прекратилась среди людей и вирус был выделен от свиней. Эта пандемия началась в Китае, но он получил название «испанского» гриппа, так как первые упоминания о тяжелой эпидемии появились в Испании. Вирус, вызвавший эту эпидемию, в настоящее время обозначается H1N1. После 1918 г. эпидемии гриппа типа А повторялись через 2—3 года, а гриппа типа В — через 4—6 лет. В 1947—1949 годах возникла пандемия гриппа типаА, которая медленно распространялась и в течение 3 лет прошла во всех странах мира. Следующая пандемия получила название азиатской, а вызвавший ее вирус назвали вирусом азиат­ского гриппа. Эта пандемия, как и две предшествовавшие, началась в Китае (первый вирус, однако, был выделен в Сингапуре) в 1957 г. и к концу года охватила весь мир, вызвав заболевание от 1,5 до 2 млрд. человек. Панде­мия была вызвана новым серовариантом вируса гриппа с антигенной формулой H2N2 (вирус азиатского гриппа). Одновременно перестал циркулировать вирус H1N1.

В дальнейшем эпидемии гриппа стали наблюдаться почти ежегодно, отличаясь степенью интенсивности — в зимние месяцы в северном полушарии, в летние меся­цы — в южном полушарии. Новая пандемия разразилась через 11 лет, в 1968 г. она также началась в Китае и была вызвана вирусом, получившим название «гонконгского» по месту его выделения. Пандемия развивалась стреми­тельно и поразила не менее 1 млрд. человек. Пандемию вызвал новый серовариант — гонконгский вирус гриппа с антигенной формулой H3N2, и одновременно перестал циркулировать среди людей азиатский вирус гриппа H2N2.

В 1977 г. произошло необычайное событие — «возвра­тился» вирус H1N1 после 20-летнего отсутствия. И на этот раз эпидемия началась в Китае. Заболевали почти исключительно лица моложе 20 лет, т. е. родившиеся после 1957 г., когда прекратилась циркуляция этого вируса среди населения. Другой особенностью явилось то, что предшествующий вирус (H3N2) не исчез, а также продолжал циркулировать и были выделены штаммы-рекомбинанты, содержавшие гены обоих вирусов. Вирус, вызвавший пандемию, получил название А/СССР/77, так как он впервые был выделен советскими учеными и не­медленно переданВОЗ. Позже выяснилось, что сходные

вирусы были выделены летом 1977 г. в Китае. История пандемий показана на рис. 45.

Начав циркулировать среди населения, новый вариант вируса не остается стабильным: его гликопротеиды НА и NA из года в год претерпевают антигенный дрейф, который приводит к тому, что через 2—3 года, а иногда и ранее выработанный иммунитет обеспечивает лишь частичную защиту от заболевания. Коллективный имму­нитет (иммунологический пресс) является тем фактором, в результате которого селекционируются новые антиген­ные варианты, т. е. является движущей силой антигенного дрейфа.

По основному вопросу — источнику появления новых вариантов вируса гриппа в результате шифта — суще­ствуют две основные концепции. Согласно одной из них варианты, исчезнувшие из человеческой популяции, на самом деле продолжают циркулировать среди населения. Фактов, подтверждающих это предположение, нет. Другая гипотеза объясняет появление новых антигенных вариан­тов возвращением в человеческую популяцию вирусов, циркулирующих у животных. Во время эпидемии человек массивно выделяет вирус гриппа в биосферу и эпидемии и пандемии гриппа обычно сопровождаются эпизоотией среди домашних и диких животных, особенно птиц. Установлены экологические и эволюционные связи между вирусами человека и животных, и (благодаря секвени-рованию гена гемагглютинина) природа шифтов, которые привели к появлению азиатского и гонконгского серо-вариантов вирусов. Азиатский вирус сохранил четыре гена своего предшественника H1N1 — гены р|, Р2, Рз и NP, и получил новые четыре гена от предполагаемого партнера — гены НА, NA, M и NS. У гонконгского виру­са H3N2 остались неизменными семь генов предшествен­ника и только один ген НА был заменен в ходе реком­бинации. Возможными источниками этого гена были названы два вируса: вирус Hav7Neq2, выделенный от уток на Украине, и вирус Heq2Neq2, выделенный от ло­шадей в Майами (США).

Лабораторная диагностика. Материалом для иссле­дования является отделяемое носоглотки, которое берут в первые 3 дня болезни ватными или марлевыми тампо­нами с задней стенки глотки, и мазки-отпечатки слизис­той оболочки носовой полости. В летальных случаях используют кусочки пораженной легочной ткани, соскоб слизистой оболочки трахеи и бронхов.

Быстрая диагностика основана на выявлении вирусного антигена в эпителии слизистой оболочки верх­них дыхательных путей. Наиболее широко используют метод ИФ. Антиген выявляют в мазках-отпечатках или эпителии, полученных из отделяемого носоглотки с по­мощью прямого и непрямого методов, используя коммер­ческие флюоресцирующие иммуноглобулины. Специфи­ческий антиген обнаруживается в цитоплазме в виде ярко светящихся конгломератов. Серологический вариант вируса гриппа (типов А, В или С) можно определить с помощью ИФ. Разработаны методы быстрой диагностики с помощью непрямой иммуноферментной реакции, осно­ванные на идентификации типоспецифических антигенов (M и NP) в смывах носоглотки больных.

Выделение вируса. В связи со сменой серо-вариантов вируса гриппа желательно выделение его при вспышках и эпидемиях. Основным методом выделения вируса гриппа из смывов носоглотки является заражение 10—11-дневных куриных эмбрионов в амнион.

Идентификацию вируса проводят в РТГА или в РСК.

В сыворотках животных содержится большое коли­чество неспецифических ингибиторов гемагглютинации, как термолабильных, которые разрушаются при прогре­вании сывороток при температуре 58°С, так и термо­стабильных. Вирусы гриппа могут быть как чувствитель­ными, так и устойчивыми к ингибиторам. В первом случае иммунные сыворотки для удаления ингибиторов обраба­тывают углекислотой, перийодатом калия или фильтратом холерного вибриона. Вирусы гриппа агглютинируют эритро­циты с разной интенсивностью (авидностью) и в зависи­мости от этого их делят на авидные и неавидные штаммы. Для неавидных штаммов лучше использовать эритроциты человека группы 0. Для выделения вируса используют также культуры клеток эмбриона человека (почек и легких), почек обезьяны, МДСК и др. Индентификацию вируса проводят в РТГА, ИФ.

Серологическая диагностика заключается в обнаружении прироста антител в парных сыворотках больных. Используют РСК и РТГА, в качестве антигенов используют стандартные диагностикумы. Во второй сыво­ротке больного может быть обнаружен прирост антител сразу к двум или большему количеству используемых антигенов. В этом случае возбудителем заболевания считают тот штамм, к которому во второй сыворотке выявлен наивысший титр антител. Серологическую диаг­ностику осуществляют также с помощью РН и ИФ в культуре клеток, реакции преципитации в геле, РРГ, ИФА. В РН используют наиболее чувствительные к вирусу культуры клеток почек собаки (MDCK) или быка (MDBK), а также клетки почек человека и обезьяны.

Профилактика и лечение. Применяются как убитые, так и живые вакцины. Те и другие имеют свои преиму-.щества и недостатки. Получение вакцинных штаммов основано на следующих принципах. Заранее приготавли­вается вирус-носитель, который обладает всеми необхо­димыми свойствами и хорошо размножается в лабора­торных условиях (куриных эмбрионах). Используя тех­нику рекомбинаци, от «актуального» вируса вирусу-носителю пересаживают только два гена — НА и NA, определяющих иммунологические свойства вируса. Для получения убитой вакцины вирус выращивают обычно на куриных"' эмбрионах, затем очищают от примесей, концентрируют и инактивируют, формальдегидом или другими химическими и физическими воздействиями, например, ультрафиолетовым облучением. При правильном подборе вакцинных штаммов вакцины снижают заболе­ваемость среди привитых в 2'/2—3 раза по сравнению с непривитыми. В качестве вируса-носителя для живых вакцин перспективно использование «холодовых» мутан­тов, которые неспособны к репродукции при температуре 37° С, но хорошо размножаются при более низких темпе­ратурах, свойственных слизистой оболочке носоглотки (32—34° С). При этом создаются условия для репродук­ции вакцинного штамма в эпителии носоглотки, а не легочных альвеол. Для детей младшего возраста, а также лиц пожилого возраста, страдающих хроническими забо­леваниями, разрабатываются вакцины со сниженной реактогенностью. Такие вакцины получают путем расщеп­ления вирионов и выделения гемагтлютинина и нейра-минидазы (субъединичные вакцины). Для лечения и про­филактики гриппа применяют химиопрепараты — аман-тадин и ремантадин. Последний является менее токсичным препаратом, его назначают внутрь в дозе 150—300 мг

в сутки в течение 2—3 дней. Лечение следует начинать как можно раньше после начала заболевания. Для лече­ния и профилактики гриппа используют интраназальное введение интерферона.