Жіктелуі. 3 страница

Әр гибридомадан 10-14 күн арасында клон – бір жасушаның «ұрпақтарының» жиынтығы пайда болады. Гибридомалардың арасынан антигенге үйлесімділігі жоғары антиденелер жасап жатқан клондарды иммунологиялық тәсілдердің (ИФТ, ИФР, АР және т.б.) көмегімен анықтайды. Клон тек біркелкі жасушалардан құралғандықтан және ол синтездейтін антиденеде біркелкі болғандықтан, осы гибридома қндіретін иммуноглобулиндерді моноклональді антиденелер деп атайды. Мұндай антиденелер, жоғарыда атап өткендей, тек бір ғана детерминантаға бұл бағытталған гибридома тоқтаусыз өсіп көбейіп отырғандықтан, ондай антиденені шексіз ала беруге болады [5].

МКА көп мөлшерін алу үшін гибридоманы сингенді тышқандардың бүйір қуысына енгізіп өсіреді. Бір тышқанның іш шеменінен 40-50 мг дейін МКА алуға болады.

Моноклональды антиденелер – жеке антиген детерминантына қарсы антиденелер. В-торшалардың бір клонының туындысы. Әртүрлі антигендер арасындағы ең аз айырмашылықты тани алады өйткені олардың тәнділік (спецификалық) қасиеті өте басым. Вирусологияның көптеген салаларында өте жоғары дәрежелі зерттеу құралы ретінде қолданылады.

Моноклоналды антиденелерді синтездейтін гибридомаларды алу әдісіне келесі методологиялық жұмыстар жол берген:

1) Миеломалар алу, оларды ағзадан бөлек өсіру;

2) Жасұшалардың соматикалық гибридизация әдісі.

Вирустарға қарсы тұратын иммуноглобулиндер поликлоналды гетерогенді антиденелер болады. Неге десек – олар әр түрлі клондардың В-лимфоциттерінің қоспасы.

Антигеннің молекуласының белсенді топтарының (бір неше аминқышқылдар) кешеңіне қарсы иммунды жасұшаларда (гибридомаларда) бір белгілі иммуноглобулин (моноспецификалы антидене) синтезделеді. Иммундық жасұшалардың ісік жасұшалармен гибридизациясы жасанды ісік – гибридома жаратады. Оны алу техникасы гибридомды технологияға жатады. Гибридомаларды жасұшалардың бір клонымен (моноклоналды антиденелер (МКА)) секреттелетін гомогенді антиденелер шығарады.

Моноклоналдық антиденелерді алу кезеңдері

1 жануарларды иммундеу;

2 иммунделген тышқандардың лимфоциттері мен миелома жасушаларын будандастыру;

3 МКА-ді синтездейтін гибридомаларды анықтау (скрининг);

4 МКА-ді тұрақты синтездейтін гибридомаларды клондау;

5 МКА-ге сипаттама беру;

6 гибридомалардыin vivo жән in vitroжағдайларында өсіру арқылы МКА-ді көп мөлшерде жинау;

7 моноклоналды антиденелерді тазарту;

8 гибридті жасушаларды сақтау (криоконсервация).

Әдістің ұстанымы. Гибридомаларды алу әдістің негізінде көкбауырдың сенсибилизденген лимфоциттердің және миеломды жасұшалардың қосылуынан кейін гибридтік жасұшалардың сериялық өсіруі жатыр. Кейіннен керекті ерекшелігі бар антиденелерді секреттейтін клондарды іріктейді. Іріктелген клонды жасұшалардың дақылдары ретінде сақтайды немесе тышқандардың ағзасында асцидтік ісік ретінде сақтайды. Гибридомды технология бір неше кезеңдерден тұрады: дайындық жұмыстар, моноклондарды алу, клондарды сақтау, реклондау, асцидтік ісік алу, антиденелерді тесттілеу, антиденелерді тазалау.

Иммунизацияға алдын ала тазаланған антигенмен қолданады. Тышқандардың қарынына минерал майын немесе инертті қатты пластикті еңгізіп жануарлардың ағзасында ісік жаратылуға жол береді. Миелома жаратылуға жануардың генетикалық қасиеттері өте маңызды болады. Инбредтік тышқандардың тек қана екі түрінен осы ісіктерді алуға мүмкіншілік тұды. Антигенді 3-5 рет 0,5-5 мг мөлшерде еңгізеді. Бірінші инъекцияны Фрейнд адьювантымен жануарға 0,5 мл мөлшерде салады. Ақырғы иммунизациядан 2-4 күн өткеннен кейін тышқандарды өлтіріп, көкбауырдың жасұшаларының суспензиясын дайындайды: көкбауырды зарарсыздандырылған жағдайда шығарып алып, оны хирургиялық пинцеттің көмегімен немесе сүзгіштен өткізіп бұзып суспензия жасайды. Суспензия көлемін 10 мл дейін Эрл ортасымен немесе тұзды буфермен жеткізеді.

Суспензияны 170 об/мин 15 минут центрифугадан өткізеді. Микроскоп астында алынған суспензияның жасұшаларының өмірге кабілеттігін анықтайды. Анықтау жұмысын өткізгенде үлгілерді көк трипанның 0,1 пайыздық ерітіндісімен бояйды. Көкбауырдың жасұшаларының суспензиясын гибридизациялық қосылуға дайындайды. Ол үшін алдын ала қосылудың алдында бір тәүлік бұрын 24-ұялық полистиролды платаның ұяларына 400 мкл қоректік жасұшаларды салады. Қоректік жасұшалар ретінде тышқандардың немесе теңіз шошқалардың макрофагтарын алады.

Қосылуды келесі түрде өткізеді: центрифугалық сынауықта 1 мл-де 75 пайызы өмірге жарамды қасиеті бар 10⁸ көк бауырдың жасұшаларын және 10⁷ миеломды жасұшаларды араластырады: 5 мл Дульбекко модификациялаған Игла ортасымен (МДСИ) жуады және 5 минут 100 об/мин центифугадан өткізеді; тұнбаны 50 мл ыдысқа құяды. Кейіннен тұнбаға абайлап тамшымен 0,5 мл 50 пайызды ПЭГ 4000 ерітіндісін қосады, ыдысты 1 сағат аралығында сілкіп қойып суспензиялайды. Кейіннен қоспаға (суспензияға) тамшымен 10 мл МДСИ қосады; 10 минуттан кейін көлемді ГАТ ортасымен (құрамында гипоксантин, амидоптерин, тимин кешені) 50 мл-ге дейін жеткізеді.

Алынған суспензияны 1 мл-ден 24 ұялы платаға құйып 37 градуста 5 пайызды көмірқышқыл газы бар көмірқышқылды инкубаторда ұстайды; әр бір 4 күнде ортаны ауыстырып отырады.

2 – 4 жұма өткеннен кейін тірі қалған клондарды қоректік жасұшалары бар 96-ұялы платаға отыртады. Клондардың өмірге жарамдығын микроскоп астында анықтайды. Дақылды суйықтықты жұма сайын радиоиммундық, иммунофлуоресценттік және иммуноферменттік әдістер арқылы тексеріп тышқан иммуноглобулиндерінің барын анықтайды.

Тышқандардың ішіне бір неше рет көп уақыт минерал майларымен әсер етіп, олардың ағзаларында миелома тұдырып, жұмысқа жарамды миеломды жасұшаларды алады. Осы жасұшаларды әдейленген зертханаларда да алады.

Клондау жұмыстарын жалғастыру үшін ГАТ ортасына қоректік жасұшалар ретінде 500 мл ортаға 10⁸ көкбауыр жасұшаларын және 10⁶ перитонеалды жасұшаларды салады. Суспензияны 1 мл-ден 96-ұялы панельге құйып көмірқышқыл инкубаторда 37 градуста ұстайды. Әр бір үш тәүліктен кейін ортаны ауыстырып отырып, жасұшалардын өмірге жарамдығын тексереді. Дақылды суйықтықта секреттейтін клон болса моноклоналды антиденелер жаратылады. Іріктеліп алынған гибридоманың клонын келесі микродақылдарда реклондайды. Дақылды суйықтықтың құрамында моноклоналды антиденелер болса, оларды эксперименттерде, иммунодиагностикумдарды дайындау үшін биотехнологиялық үдірістерде қолданады.