Показателям системы детоксикации ксенобиотиков
Оценка безопасности наноматериалов по интегральным
БЕЗОПАСНОСТИ НАНОМАТЕРИАЛОВ МЕТОДОМ ЭКТАЦИТОМЕТРИИ
ПОРЯДОК РЕГИСТРАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТИРОВАНИЯ
------------------------------T----------------------T---------------
-----
¦ ¦ tg альфа ¦
ID ¦
¦ ¦ ¦
max ¦
+-----------------------------+----------------------+---------------
-----+
¦ Фон ¦
¦ ¦
+-----------------------------+----------------------+---------------
-----+
¦ Нано (различные концентрации) ¦
¦ ¦
+-----------------------------+----------------------+---------------
-----+
¦ К (различные концентрации) ¦
¦ ¦
L-----------------------------+----------------------+---------------
------
Примечание. (tg альфа) - интенсивность деформации
эритроцитов в
сдвиговом потоке; (ID ) - максимальная растяжимость
эритроцитов в
max
сдвиговом потоке. Образцы крови: (Фон) - исходные; (Нано) - с
замещением
части плазмы на препарат наноматериала; (К) - с замещением части
плазмы на
раствор глицерина.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Статистический анализ данных проводят как указано в п.
6.4.1.5. IC
определяют предварительно согласно Руководству по
экспериментальному
(доклиническому) изучению новых фармакологических веществ/под
общей ред.
Хабриева Р.У. - 2 изд. - М.: ОАО "Издательство Медицина". - 2005. -
832 с.
Наноматериал признается безопасным по результатам
тестирования при
выполнении следующих критериев:
1) если интегральные параметры (индексы ID и tg альфа, а
также
max
эффективная вязкость крови k ) в опытных группах животных,
подвергшихся
воздействию наноматериала, не отличаются достоверно от контроля.
6.5.1. Метод гексеналовой пробы
6.5.1.1. Принцип метода
По продолжительности сна мышей и крыс после внутрибрюшинного введения гексеналового
наркоза можно оценить скорость метаболизма гексенала, осуществляемого цитохромом P-450-
зависимой монооксигеназной системой гепатоцитов, которая характеризует состояние
антитоксической функции печени.
6.5.1.2. Животные, оборудование и материалы
6.5.1.2.1. Животные
Мелкие лабораторные животные (крысы и мыши) линейные (крысы линий Wistar, Sprague-
Dawley и др.; мыши линий CBA, C57B1/6 и др.), так и нелинейные. В случае использования
линейных животных необходимо указать линию животных.
Количество животных в группе зависит от целей исследования, но не должно быть менее 10
особей в группе. Разброс по исходной массе тела животных в группе не должен превышать +/- 10%.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
В течение всего эксперимента животные должны иметь свободный доступ к корму и питьевой воде
(за исключением времени измерения физиологических параметров). Для унификации исследований
животные на протяжении всего эксперимента получают полусинтетический рацион согласно МУ
1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".
6.5.1.2.2. Оборудование
Нагревательный столик ML-1.5-4 (ООО Мила-Форм, Россия, или аналогичный). Компьютер
IBM PC-совместимый по ГОСТ 27201-87 с установленным программным обеспечением SPSS 12
(SPSS Inc., США).
6.5.1.2.3. Материалы и реактивы
Одноразовые пластиковые шприцы по ГОСТ 24861-91.
Гексенал (кат. N W256102, Sigma-Aldrich).
6.5.1.3. Метод введения наноматериалов животным
Наноматериалы можно вводить: парентерально (внутривенно,
внутримышечно,
внутрибрюшинно), ингаляционно и перорально (в составе корма,
питьевой воды
или через зонд). Рекомендуется проводить подострое (ежедневное
введение в
течение 3 месяцев) и хроническое введение (ежедневное введение в
течение 6
месяцев и более) наноматериала. Введение наноматериала проводят за 1
час до
проведения наркоза. При подостром и хроническом введении
наноматериала
гексеналовую пробу осуществляют на 10, 30, 60 и 90 сут. и на 30 и
180 сут.
и более, соответственно. Дозы введения наноматериала при
подостром
воздействии - от минимальной токсической дозы до 1/5 LD , при
хроническом
воздействии - от 1/3 до 1/10 части минимальной токсической дозы.
6.5.1.4. Проведение измерений
Осуществляют наркотизирование лабораторных животных с помощью гексеналового наркоза.
Гексенал вводят мышам - в дозе 80 мг/кг, крысам - в дозе 60 мг/кг внутрибрюшинно.
Животных помещают на столик, нагретый до 37 °C и измеряют продолжительность состояния
наркоза.
6.5.1.5. Анализ и интерпретация полученных данных
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Статистический анализ данных проводят, как указано в п. 6.2.1.5.
Расчет
LD , минимальной токсической дозы производят при предварительной
оценке
острой токсичности наноматериала согласно МУ
1.2.2520-09
"Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".
Наноматериал признается безопасным по результатам тестирования, если продолжительность
наркоза в опытных группах животных, подвергшихся воздействию наноматериала, не отличается
достоверно от контроля.
6.5.2. Метод пробы с бромсульфалеином
6.5.2.1. Принцип метода
Бромсульфалеиновая проба относится к числу наиболее информативных и чувствительных
методов исследования поглотительно-выделительной функции печени. Скорость элиминации
бромсульфалеина (БСФ) (в виде конъюгатов с цистеином и глутатионом) является показателем
состояния экскреторной и антитоксической функции печени. БСФ-проба становится положительной
при любых поражениях паренхимы органа (острые и хронические гепатиты, жировой гепатоз, цирроз
печени, доброкачественная гипербилирубинемия и др.), даже на самых ранних стадиях развития
заболевания и хорошо коррелирует с тяжестью патологического процесса.
6.5.2.2. Животные, оборудование и материалы
6.5.2.2.1. Животные
Мелкие лабораторные животные (крысы и мыши) линейные (крысы линий Wistar, Sprague-
Dawley и др.; мыши линий CBA, C57B1/6 и др.), так и нелинейные. В случае использования
линейных животных необходимо указать линию животных.
Количество животных в группе зависит от целей исследования, но не должно быть менее 10
особей в группе. Разброс по исходной массе тела животных в группе не должен превышать +/- 10%.
В течение всего эксперимента животные должны иметь свободный доступ к корму и питьевой воде
(за исключением времени измерения физиологических параметров). Для унификации исследований
животные на протяжении всего эксперимента получают полусинтетический рацион согласно МУ
1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".
6.5.2.2.2. Оборудование
Нагревательный столик ML-1.5-4 (ООО Мила-Форм, Россия, или аналогичный). Лабораторная
центрифуга с охлаждением, рассчитанная на ускорение до 10000 g. CM 6.03 ELMI (Латвия) или
аналогичная; Клетки для содержания животных "плексигласовый домик" (ООО "СПИ", Россия, или
аналогичный). Палочка (лопаточка) глазная (Апекслаб, Россия, или аналогичная).
Компьютер IBM PC-совместимый по ГОСТ 27201-87 с установленным программным
обеспечением SPSS 12 (SPSS Inc., США) или с аналогичными параметрами.
6.5.1.2.3. Материалы и реактивы
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Одноразовые пластиковые пробирки по ТУ 64-2-30-80. Дозаторы пипеточные по ТУ 64-16-55-
90 с диапазоном объема доз 20 - 200 куб. мм и 200 - 1000 куб. мм и дискретностью установки доз 1 и
5 куб. мм, соответственно, с наконечниками. Одноразовые пластиковые шприцы по ГОСТ 24861-91.
Бромсульфалеин фирмы "Sigma", США, или аналогичный.
6.5.1.3. Метод введения наноматериалов животным
Наноматериалы можно вводить: парентерально (внутривенно, внутримышечно,
внутрибрюшинно), ингаляционно и перорально (в составе корма, питьевой воды или через зонд).
Рекомендуется проводить подострое (ежедневное введение в течение 3 месяцев) и хроническое
введение (ежедневное введение в течение 6 месяцев) наноматериала.
Введение наноматериала проводят за 1 час до проведения
анализа. При
подостром и хроническом введении наноматериала анализ проводят на
10, 30,
60 и 90 сут. и на 30 и 180 сут., соответственно. Дозы
введения
наноматериала при подостром воздействии - от минимальной
токсической дозы
до 1/5 LD , при хроническом воздействии - от 1/3 до 1/10 части
минимальной
токсической дозы.
6.5.1.4. Проведение измерений
БСФ вводят в хвостовую вену животного в дозе 1 - 5 мг/кг. Через 1, 5, 15 и 45 минут после
введения красителя спектрофотометрическим методом определяют содержание БСФ в крови
животного. Вычисляют коэффициент ретенции БСФ, элиминируемого в виде конъюгатов с
цистеином и глутатионом.
Кровь у мелких лабораторных животных (мыши, крысы) можно отбирать из хвоста или из
сердца (в случае вскрытия животных). Оптимальный объем сыворотки крови - не менее 30 куб. мм.
Забор крови производят в одноразовые пластиковые пробирки.
После забора крови пластиковые пробирки закрывают крышками и центрифугируют от 10 сек.
до 1 мин. при скорости до 2000 g, чтобы сбросить капельки крови, осевшие на стенки пробирок, не
дав им высохнуть. Для получения плазмы кровь отбирают в пробирки, куда предварительно внесен
раствор гепарина (10 ед./куб. см). Пробирки центрифугируют в течение 10 мин. на скорости 2000 g.
Отбирают плазму, не задевая клеток, в отдельную пробирку, которую маркируют (например, П -
плазма).
6.5.1.5. Анализ и интерпретация полученных данных
Статистический анализ данных проводят, как указано в п. 6.2.1.5.
Расчет
LD , минимальной токсической дозы производят при предварительной
оценке
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
острой токсичности наноматериала согласно МУ
1.2.2520-09
"Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".
Наноматериал признается безопасным по результатам тестирования, если через 45 мин.
содержание БСФ не превышает 5% от первоначального уровня в крови, взятой через 3 минуты после
введения красителя.