Статистическая обработка и интерпретация полученных данных

Статистический анализ данных проводят, как указано в п. 6.2.1.5.

Расчет

LD и минимальной токсической дозы производится при предварительной

оценке

острой токсичности наноматериала согласно МУ 1.2.2520-09

"Токсиколого-

гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

Наноматериал признается безопасным по результатам тестирования при выполнении

следующих критериев:

1) если показатель среднего АД и ЧСС остается в пределах физиологической нормы (для крыс:

среднее АД - 85 - 115 мм рт. ст., ЧСС - 350 - 420 уд./мин.);

2) если интегральные параметры (коэффициент вариабельности, усредненные спектры

спектрального или вэйвлет-анализа, ЧБР) в опытных группах животных, подвергшихся воздействию

наноматериалов, не отличаются достоверно от контроля.

6.3.4. Методика регистрации ЭКГ у бодрствующих крыс в покое и при стрессирующем

воздействии

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

6.3.4.1. Принцип метода

Электрокардиография - методика регистрации и исследования электрических полей,

образующихся при работе сердца. Прямым результатом электрокардиографии является получение

электрокардиограммы (ЭКГ) - графического представления разности потенциалов, возникающих в

результате работы сердца и проводящихся на поверхность тела. На ЭКГ отражается усреднение всех

векторов потенциалов действия, возникающих в определенный момент работы сердца. Регистрация

ЭКГ может проводиться у бодрствующих крыс в покое и при стрессирующем воздействии с

последующим вычислением средней длительности ПИ и показателей вариабельности сердечного

ритма с использованием вэйвлет-анализа. Для создания модельных условий стресса на крысу

воздействуют струей воздуха ("air-jet stress"), при которой у животных возникает ориентировочная

реакция, сопровождающаяся умеренным повышением АД и ЧСС, а также характерным

перераспределением кровотока между органами.

6.3.4.2. Животные, оборудование и материалы

6.3.4.2.1. Животные

Нелинейные и линейные крысы (линий Wistar, Sprague-Dawley и др.). В случае использования

линейных крыс необходимо указать линию.

Количество животных в группе зависит от целей исследования, но не должно быть менее 10

особей. Разброс по исходной массе тела животных в группе не должен превышать +/- 10%. В течение

всего эксперимента животные должны иметь свободный доступ к корму и питьевой воде (за

исключением времени измерения физиологических параметров). Для унификации исследований

животные на протяжении всего эксперимента получают полусинтетический рацион согласно МУ

1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

6.3.4.2.2. Оборудование

Усилитель потенциалов по ГОСТ 26033-91 для выходного сигнала до 10 В, имеющий полосу

частот от 10 Гц до 20 кГц. Аналого-цифровой преобразователь Е14-440 (L-Card, Россия, внесен в

Государственный реестр средств измерения под N 28131-04) или аналогичный (разрядность АЦП -

14 бит, максимальная частота преобразования - 400 кГц, диапазон входного сигнала: +/- 10 В; +/- 2,5

В; +/- 0,625 В; +/- 0,156 В). Компьютер IBM PC-совместимый по ГОСТ 27201-87 с установленным

программным обеспечением Powergraph (ООО "ДИСофт", Россия), MatLab (MathWorks, США) и SPSS

12 (SPSS Inc., США).

Клетки для содержания животных, "плексигласовый домик" (ООО "СПИ", Россия, или

аналогичный). Баллон со сжатым воздухом 5 литров ГОСТ 949-73 (пневматический нанос).

6.3.4.2.3. Материалы и реактивы

Одноразовые электроды, предназначенные для регистрации ЭКГ у новорожденных Sensi-Prema

(Unomedical Ltd, Великобритания). Стальная проволока общего назначения ГОСТ 3282-74 диаметр от

0,2 мм (Мегапром, Россия). Трубка пластиковая (поливинилхлорид) с внутренним диаметром 7 мм

(ВТМ-2000, Россия). Спирт этиловый технический по ГОСТ 17299-78 (ч.д.а.).

6.3.4.3. Метод введения наноматериалов животным

Наноматериалы можно вводить: парентерально (внутривенно, внутримышечно,

внутрибрюшинно), ингаляционно и перорально (в составе корма, питьевой воды или через зонд).

Допустимо острое (однократное введение), подострое (ежедневное введение в течение 1 - 3 месяцев)

и хроническое введение (ежедневное введение в течение 6 месяцев и более) наноматериала.

При остром воздействии введение наноматериала проводят после наложения электродов, при

подостром и хроническом воздействии введение наноматериала проводят за 1 час до наложения

электродов. Регистрацию ЭКГ проводят сначала в режиме экспозиции, т.е. во время и

непосредственно после или через 1 час после введения наноматериала, а затем каждый день в

течение 14 дней (при остром введении), на 210, 240, 270, 300, 330 и 360 дни и более (при

хроническом введении).

Доза вводимого наноматериала при остром воздействии может

варьировать

от минимальной токсической до 1 LD (при возможности ее

определения), при

подостром воздействии - от минимальной токсической до 1/5 LD

, при

хроническом воздействии - 1/3 - 1/10 части минимальной токсической

дозы.

Контрольным животным вводят физиологический раствор в том же объеме

и тем

же способом, что и коллоидный раствор или дисперсию наноматериала.

6.3.4.4. Проведение измерений

Регистрация ЭКГ проводится с помощью накожных электродов, закрепленных на

вентролатеральной поверхности грудной клетки крысы. На этих участках тела сбривается шерсть,

кожа обезжиривается спиртом и наклеиваются ЭКГ-электроды так, чтобы их расположение

соответствовало II стандартному отведению. Рекомендуется использовать одноразовые электроды,

предназначенные для регистрации ЭКГ у новорожденных детей.

Для надежной фиксации электродов на крысу надевается шлейка. Сигнал от электродов

поступает на усилитель потенциалов, имеющий полосу частот от 10 Гц до 20 кГц. От усилителя

сигнал поступает на аналого-цифровой преобразователь, который через usb-порт соединяют с

персональным компьютером. Частота опроса ЭКГ-сигнала должна быть не менее 1000 Гц.

ЭКГ может регистрироваться одновременно у четырех крыс, что обеспечивает высокую

пропускную способность установки и эффективность тестирования.

Air-jet-стресс моделируют струей воздуха, которая подается через трубку, помещенную в угол

клетки, как показано на рисунке 5. Внутренний диаметр трубки составляет 7 мм, отверстие трубки

должно находиться на высоте 4 см от пола клетки. Воздух в трубку нагнетается при помощи баллона

со сжатым воздухом. Мощность потока воздуха подбирают так, чтобы он производил легкое

шипение. Длительность стрессирующего воздействия составляет 1 - 5 мин., в зависимости от

поставленной задачи. При коротком воздействии реакцию на стресс можно воспроизводить

многократно в течение одного эксперимента. После окончания воздействия регистрируют ЭКГ еще в

течение 30 мин.

6.3.4.5. Анализ и интерпретация полученных данных

6.3.4.5.1. Поцикловый анализ сигнала ЭКГ

Проводят поцикловую обработку полученного сигнала: на записи ЭКГ идентифицируют QRS-

комплексы, соответствующие индивидуальным сердечным циклам. Анализ полученных результатов

проводят с помощью программного обеспечения Powergraph.

6.3.4.5.2. Спектральный анализ сердечного ритма

Из-за нерегулярности сердечного ритма вычисленные значения R-R интервала неравномерно

распределены во времени. Поскольку для вычисления спектра мощности необходимы значения,

разделенные равными временными интервалами, по экспериментальным данным путем линейной

интерполяции вычисляют значения R-R интервала, отстоящие друг от друга на 0,1 сек. Далее весь

исследуемый интервал (30 мин.) разбивают на неперекрывающиеся отрезки длительностью 51,2 с

(512 точек). При такой длине анализируемых отрезков времени нижняя граница исследуемых частот

составляет около 0,02 Гц, а верхняя - 5 Гц.

На регистрируемой кривой, как правило, присутствуют линейные тренды, обусловленные

колебаниями, период которых больше 51,2 сек. Чтобы они не проявлялись на спектре мощности,

полученные ряды интерполированных значений (51,2 с) приводят к нулевому среднему путем

вычитания линейного дрейфа. Затем для каждого отрезка (51,2 сек.) вычисляют спектр мощности с

использованием быстрого преобразования Фурье. Отрезки, содержащие артефакты, связанные с

резкими движениями животного, исключают из анализа. Полученные спектры усредняют для всего

30-мин. интервала.

Суммарную интенсивность колебаний R-R интервала в различных частотных диапазонах

вычисляют интегрированием вычисленной спектральной плотности.

6.3.4.5.3. Вэйвлет-анализ

Обработку данных проводят с помощью программного обеспечения MatLab.

Для локализации динамических изменений сердечного ритма во времени используют метод

вэйвлет-анализа. Основная идея вэйвлет-анализа заключается в вычислении корреляции

исследуемого сигнала с некоторой функцией (анализирующим вэйвлетом) в каждой точке t. Таким

образом, вэйвлет-анализ сводится к вычислению преобразования, определяемого формулой (9):

1 +бесконечность тау - t

W (t, a) = - Интеграл S(тау) пси (-------) d

тау, (9)

пси a -бесконечность a

где центр анализирующего вэйвлета пси находится в точке t, а его ширина определяется

масштабным фактором a. В качестве анализирующего вейвлета можно использовать достаточно

широкий класс функций, основным свойством которых является масштабируемость. Таким образом,

вэйвлет-преобразование можно рассматривать как своеобразный "математический микроскоп",

который дает возможность следить за поведением сигнала на различных временных масштабах.

Величину, обратную временному масштабу, можно рассматривать как частоту, поэтому вэйвлет-

анализ, так же как и спектральный анализ, позволяет определить частотно-временные

характеристики сигнала. В некотором смысле эти два подхода дополняют друг друга. Спектральный

анализ обладает хорошим разрешением по частоте, однако плохой временной локализацией.

Напротив, вэйвлет-анализ позволяет точно локализовать точку, в которой происходит изменение

частотных характеристик сигнала, однако обладает худшим частотным разрешением. Таким образом,

спектральный анализ особенно эффективен при изучении частотных характеристик стационарных

сигналов, тогда как вэйвлет-анализ более пригоден для изучения нестационарных процессов, для

точной локализации изменений спектральных характеристик сигналов (оценка переходных

процессов, происходящих, например, при быстром изменении внешних условий, при стрессе и т.д.).

Следует отметить, что метод вэйвлет-анализа широко применяется для тестирования

кардиодинамики в условиях патологии.

При проведении вэйвлет-анализа R-R интервала выполняют следующие процедуры:

- временной ряд R-R интервалов с помощью линейной интерполяции приводят к ряду

равноотстоящих по шкале времени значений;

- вычисляют вэйвлет-преобразование полученного временного ряда, при этом

масштабирующие коэффициенты a выбирают таким образом, чтобы обеспечить необходимый

частотный диапазон;

- коэффициенты вэйвлет-преобразования представляют в форме аналитического сигнала:

iф(t) ~

S (t) = A(t) e тождественно = W (t) + i W

(t), (10)

a a a

где W (t) - преобразование Гильберта от вэйвлет-

трансформанты с

масштабирующим коэффициентом a. Вычисленные таким образом

амплитуды

характеризуют интенсивность осцилляций сигнала на данной частоте в

данный

момент времени.

На рисунке 9 представлен пример обработки данных методом вэйвлет-анализа. Видно, что

после стресса у крыс происходит незначительное увеличение амплитуды колебаний с частотами ~ 1

Гц и ~ 0,5 Гц, которое сохраняется в течение длительного <...>.

Результаты вэйвлет-анализа позволяют заключить, что как до, так и после стресса динамику R-R

интервала можно рассматривать как стационарную. Это дает основание применять для исследования

вариабельности R-R интервала метод спектрального анализа, который обладает лучшим разрешением

по частоте по сравнению с вэйвлет-анализом.

Вследствие усреднения большого количества спектров, вычисленных для последовательных

отрезков записи ЭКГ, происходит нивелирование случайных флуктуаций R-R интервала и

акцентирование колебаний, обусловленных активностью регуляторных механизмов.

6.3.4.5.4. Статистическая обработка и интерпретация полученных данных