НА ЛЕЙКОЦИТЫ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
----------------------T-----------------T----------------T-----------
-----
¦ Клеточная взвесь ¦ Питательная среда ¦ Наноматериал ¦
Наноматериал ¦
¦ 6 ¦ ¦ (высокая ¦
(низкая ¦
¦ 1 x 10 кл./куб. см ¦ ¦ концентрация) ¦
концентрация) ¦
+---------------------+-----------------+----------------+-----------
-----+
¦ 0,100 куб. см ¦ 0,110 куб. см ¦
¦ ¦
+---------------------+-----------------+----------------+-----------
-----+
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
¦ 0,100 куб. см ¦ 0,100 куб. см ¦
¦ ¦
+---------------------+-----------------+----------------+-----------
-----+
¦ 0,100 куб. см ¦ 0,100 куб. см ¦ ¦ 0,010 куб.
см ¦
L---------------------+-----------------+----------------+-----------
------
Планшеты инкубируют 24 ч при 37 °C, 5% CO во влажной
атмосфере.
Клеточную взвесь в каждой лунке тщательно перемешивают и
переносят по
0,1 куб. см маркированные пробирки для проведения
цитофлюориметрического
анализа Falcon. Добавляют 7-AAD и CD45 ФИТЦ из расчета по 0,005
куб. см
раствора красителей на 1 x 10 клеток. Инкубируют 30 минут при
+4 °C в
темноте.
При необходимости лизируют эритроциты. Для этого в каждую пробирку вносят по 1 куб. см 1
X Facs Lysing Solytion (BD), аккуратно перемешивают на вортексе в течение 10 сек., инкубируют 10 -
12 минут в темноте при комнатной температуре (18 - 20 °C).
Осаждают лейкоциты центрифугированием при 300 g 5 минут. Удаляют надосадочную
жидкость. Дважды отмывают лейкоциты в ФСБ (300 куб. мм), 400 g, 5 минут.
Лейкоциты фиксируют путем добавления к ресуспендированной клеточной взвеси по 500 куб.
мм 1% раствора параформальдегида, образцы встряхивают на вортексе.
Анализ проводят на проточном цитофлюориметре в программе Cell Quest Pro.
Цитотоксичным считается наноматериал, индуцирующий гибель более
чем 18%
лейкоцитов через 18 - 24 ч после совместной инкубации in vitro при
37 °C
при 5% CO во влажной атмосфере.
4.11.5. Определение цитолитической активности лимфоцитов
Литическая активность естественных киллеров - один из показателей иммунного статуса.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Естественные киллеры - это несенсибилизированные большие гранулярные лимфоциты,
осуществляющие независимый от антител и комплемента лизис широкого спектра клеток-мишеней -
опухолевых, зараженных вирусами, поврежденных клеток. Естественные киллеры играют важную
роль в иммунном надзоре за состоянием клеточной пролиферации и цитодифференцировки.
В качестве клеток-эффекторов (КЭ) используют спленоциты линейных
мышей
Balb/c, выделенные из групп контрольных мышей и групп,
обработанных
анализируемым наноматериалом. Для этого выделяют клетки селезенки,
лизируют
эритроциты, готовят клеточную суспензию 1,5 x 10 кл./куб. см, как
описано
в разделе 4.7.1.
В качестве клеток-мишеней (КМ) используют эмбриональные
мышиные
фибробласты линии Balb/3T3 (линия 3T3) или клетки эритробластоза
человека -
К-562 (1,3 x 10 кл./куб. см), подготовленные к анализу, как
описано в
разд. 4.7.2. В лунки 96-луночного планшета раскапывают клетки-
эффекторы и
клетки-мишени по указанной ниже схеме:
1 лунка 2 лунка Контроль Контроль
(соотношение (соотношение клеток- клеток-
КМ:КЭ = 1:10) КМ:КЭ = 1:15) эффекторов мишеней
Спленоциты 0,080 куб. см 0,080 куб. см 0,080 куб. см -
К-562 (или 3T3) 0,080 куб. см 0,120 куб. см - 0,080 куб. см
Полная среда RPMI 0,040 куб. см - 0,120 куб. см 0,120 куб. см
(без сыворотки)
Инкубируют планшеты 4 ч при 37 °C в условиях 5% CO во
влажной
атмосфере. Добавляют в лунки контролей по 0,007 куб. см 1%
бромистого
этидиума (на дистиллированной воде), инкубируют 30 минут при 4
°C. На
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
цитофлюориметре определяют процент жизнеспособных клеток. Живые
клетки с
целостной мембраной не окрашиваются красителем. В контрольных
лунках
жизнеспособность спленоцитов в норме должна составлять не
менее 95%,
жизнеспособность клеток-мишеней - не менее 87%.
Для оценки цитолитической активности естественных киллеров из лунок, содержащих клетки-
мишени и клетки-эффекторы, отбирают по 0,070 куб. см клеточной взвеси в двух повторах.
Добавляют по 200 куб. мм раствора Версена.
Затем готовится окрашивающий раствор, состоящий из 0,007 куб. см 1% раствора (на
дистиллированной воде) тритона X100, 0,005 куб. см РНК-азы и 0,007 куб. см 1% бромистого
этидиума.
На цитофлюориметре анализируют процент спленоцитов с гиподиплоидным содержанием
ДНК, используя программу Cell Quest.
Коэффициент литической активности рассчитывают по формуле:
n - n
1 2
K = ------- x 100%,
c n
где:
K - коэффициент литической активности;
c
n - количество гиподиплоидных клеток в 1-ой лунке
(соотношение
КМ:КЭ = 1:10);
n - количество гиподиплоидных клеток во 2-ой лунке
(соотношение
КМ:КЭ = 1:15).
Достоверное снижение/увеличение цитолитической активности лимфоцитов, выделенных от
животных, обработанных наноматериалом, по сравнению с цитолитической активностью
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
лимфоцитов, выделенных от интактных животных, свидетельствует об ингибировании/активации
наноматериалом литической активности естественных киллеров.
4.11.6. Оценка фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов животных
Фагоцитоз является одной из важнейших реакций, обеспечивающих как естественную
резистентность организма (неспецифический иммунитет), так и представление антигена,
необходимое для развития специфического иммунного ответа. Нарушения на различных этапах
фагоцитоза приводят к развитию многочисленных патологических состояний.
Анализ фагоцитарной активности можно проводить, используя коммерческий набор Phagotest,
BD или с применением приготовленных ФИТЦ-меченых бактерий (например, E. coli - ФИТЦ).
Для этого штамм E. coli HB 101 выращивают в среде LB (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт
и 1% раствор хлорида натрия) на возвратном вибраторе (150 об./мин.). После культивирования в
течение ночи при 37 °C бактерии осаждают центрифугированием при 1500 g, дважды промывают
ФСБ и один раз дистиллированной водой. Бактерии инактивируют нагреванием в течение 60 мин.
на водяной бане при 56 °C.
Инактивированные клетки E. coli (1 x 10 клеток/куб. см)
отмывают в
0,15 М фосфатном буфере. Инкубируют в 2,5 куб. см
0,1 М
карбонат-бикарбонатного буфера, pH 9,0 (0,15 М NaCl, 0,5 М NaHCO ,
0,5 M
Na CO ), содержащего 500 мкг изомера 1-флуоресцеинизотиоцианата
(ФИТЦ) в
2 3
течение 60 мин. при 4 °C.
Клетки перемешивают, энергично промывают 2 - 3 раза охлажденным на льду 0,15 М
фосфатным буфером и 1 раз дистиллированной водой, каждый раз осаждая клетки
центрифугированием (1500 g).
Меченные ФИТЦ клетки E. coli можно хранить в малом количестве сбалансированного солевого
раствора Хенкса, pH 7,4 при температуре минус 20 °C в течение 2 месяцев.
Для оценки фагоцитоза меченные ФИТЦ клетки E. coli
суспендируют в
сбалансированном солевом растворе Хенкса. Перитонеальные макрофаги
вносят в
пробирки по 0,1 куб. см в разведении 1 x 10 кл./куб. см. Перед
добавлением
ФИТЦ-меченных бактерий макрофаги инкубируют на льду в течение 10
мин. для
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
того, чтобы охладить их до 0 °C. Тщательно перемешивают охлажденные
ФИТЦ-
меченные клетки E. coli и добавляют их в объеме 0,01 куб. см к
взвеси
макрофагов. Пробирки встряхивают. Контрольные пробы оставляют на
льду.
Исследуемые пробы инкубируют 10 мин. при температуре +37 °C на
водяной
бане.
Для подавления флуоресценции непоглощенных макрофагами бактерий непосредственно перед
окончанием времени инкубации достают все образцы одновременно из водяной бани и помещают их
на лед для того, чтобы остановить фагоцитоз. В каждую пробирку добавляют по 0,1 куб. см ФСБ,
содержащего 1% азид натрия (или Quenching Solution, BD). Пробирки встряхивают.
Добавляют по 3 куб. см ФСБ в каждую пробирку. Перемешивают содержимое пробирок
встряхиванием. Осаждают клетки центрифугированием (5 мин. при 250 g, +4 °C). Удаляют
супернатант. Отмывают образцы еще один раз, добавив 3 куб. см ФСБ.
Лизируют эритроциты. При использовании FACS Lysing Solution, BD концентрированный
лизирующий раствор предварительно разводят деионизованной водой в 10 раз. В каждую пробирку
вносят по 2 куб. см рабочего лизирующего раствора, смешивают на вортексе и инкубируют в темноте
10 - 12 минут (не больше!) при температуре +20 - 25 °C. Осаждают макрофаги центрифугированием
(200 - 300 g, 5 минут). Встряхивают осадок на вортексе и отмывают макрофаги в 2 куб. см ФСБ с 0,1%
азидом натрия. Осаждают макрофаги центрифугированием (200 - 300 g, 5 минут). Повторяют
процедуру отмывки. Вносят в каждую пробирку по 0,5 куб. см ФСБ с 0,1% азидом натрия и
диспергируют клетки.
Для фиксации макрофагов в каждую пробирку вносят по 0,5 куб. см 1% раствора
параформальдегида и встряхивают на вортексе. Препараты можно хранить до проведения анализа
при температуре +2 - 4 °C не более 24 часов.
Измеряется общее количество фагоцитирующих макрофагов (поглощение одной или более
бактерий одним макрофагом) с использованием программы Cell Quest.
Оценку влияния наноматериала на функцию фагоцитоза проводят, сравнивая фагоцитарную
активность макрофагов, выделенных от обработанных наноматериалом мышей и интактных
животных. Снижение фагоцитарной активности макрофагов мышей, обработанных наноматериалом,
свидетельствует о снижении естественной резистентности организма.