ЛИМФОЦИТОВ ДЛЯ ОДНОЙ ГРУППЫ МЫШЕЙ
--------------------T-------------T-------------T-------------T------
-------T-------------
¦ Клеточная взвесь ¦ Питательная ¦ ConA ¦ ЛПС
¦ Наноматериал ¦ Наноматериал ¦
¦ 6 ¦ среда ¦ ¦ ¦
(высокая ¦ (низкая ¦
¦ 1 x 10 кл./куб. см ¦ ¦ ¦
¦ концентрация) ¦ концентрация) ¦
+-------------------+-------------+-------------+-------------+------
-------+-------------+
¦ 0,100 куб. см ¦ 0,110 куб. см ¦ ¦
¦ ¦ ¦
+-------------------+-------------+-------------+-------------+------
-------+-------------+
¦ 0,100 куб. см ¦ 0,010 куб. см ¦ 0,100 куб. см ¦
¦ ¦ ¦
+-------------------+-------------+-------------+-------------+------
-------+-------------+
¦ 0,100 куб. см ¦ ¦ 0,100 куб. см ¦ ¦ 0,010
куб. см ¦ ¦
+-------------------+-------------+-------------+-------------+------
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
-------+-------------+
¦ 0,100 куб. см ¦ ¦ 0,100 куб. см ¦
¦ ¦ 0,010 куб. см ¦
+-------------------+-------------+-------------+-------------+------
-------+-------------+
¦ 0,100 куб. см ¦ 0,010 куб. см ¦ ¦ 0,100 куб.
см ¦ ¦ ¦
+-------------------+-------------+-------------+-------------+------
-------+-------------+
¦ 0,100 куб. см ¦ ¦ ¦ 0,100 куб. см ¦ 0,010
куб. см ¦ ¦
+-------------------+-------------+-------------+-------------+------
-------+-------------+
¦ 0,100 куб. см ¦ ¦ ¦ 0,100 куб.
см ¦ ¦ 0,010 куб. см ¦
L-------------------+-------------+-------------+-------------+------
-------+--------------
Инкубируют планшет 18 - 24 ч при 37 °C, во влажной атмосфере,
5% CO .
Затем переносят по 0,1 куб. см исследуемых биологических
образцов в
соответственно промаркированные пробирки для цитометрического
анализа
FALCON.
После чего добавляют в пробирки по 1 куб. мм моноклональных флюорохром-конъюгированных
антител: CD3 PerCP, CD19 APC, CD69 FITC. В отдельную пробирку добавляют 1 куб. мм
изотипического контроля IgG1-FITC. Аккуратно перемешивают пробирки на вортексе в течение 10
сек. и помещают в темное место при комнатной температуре (18 - 20 °C) на 20 - 30 минут.
Затем лизируют эритроциты. Для этого в каждую пробирку вносят по 1 куб. см 1 X Facs Lysing
Solytion (BD), аккуратно перемешивают на вортексе в течение 10 сек., инкубируют 10 - 12 минут в
темноте при комнатной температуре (18 - 20 °C).
Затем осаждают лейкоциты центрифугированием при 300 g 5 минут. Удаляют надосадочную
жидкость. Дважды отмывают лейкоциты в ФСБ (300 куб. мм), 400 g, 5 минут.
Затем фиксируют лейкоциты. Для этого ресуспендируют клеточную взвесь, вносят в каждую
пробирку по 500 куб. мм 1% раствора параформальдегида и встряхивают клетки на вортексе. Анализ
проводят на проточном цитофлюориметре в программе Cell Quest Pro. Меченные моноклональными
антителами образцы можно хранить при температуре 4 °C (в холодильнике) 24 часа.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Оценку негативного действия наноматериала ex vivo на функциональную активность T- и B-
лимфоцитов проводят на основании сравнения количества митоген-активированных CD69-
позитивных T- и B-лимфоцитов, выделенных из групп контрольных (интактных) мышей и
обработанных анализируемым наноматериалом. Достоверное уменьшение T- и B-лимфоцитов,
несущих на своей поверхности CD69 рецептор, после стимулирования соответствующим митогеном,
свидетельствует о снижении функциональной активности лимфоцитов. Спонтанное увеличение у
мышей, обработанных наноматериалом (по сравнению с интактными), CD69 позитивных T- и B-
лимфоцитов после культивирования клеток в среде свидетельствует о гиперактивации клеток
иммунной системы.
Оценку негативного действия наноматериала in vitro проводят на основании сравнения
количества CD69-позитивных T- и B-лимфоцитов, стимулированных соответствующим митогеном в
присутствии и без наноматериала в среде. Снижение уровня экспрессии CD69 рецептора на
поверхности митоген-активированных T- и B-лимфоцитов в присутствии наноматериала в среде, по
сравнению с количеством CD69-позитивных митоген-активированных T- и B-лимфоцитов без
добавления наноматериала в среду, свидетельствует о нарушении функциональной активности
лимфоцитов.
4.11.3. Оценка апоптотической и пролиферативной активности лейкоцитов
Апоптоз лимфоцитов - важнейший механизм иммунорегуляции от момента созревания и
дифференцировки иммунокомпетентных клеток до этапа реализации механизмов врожденного и
адаптивного иммунитета. Отсутствие адекватного апоптоза сопровождает лимфопролиферативную
патологию. Усиление апоптоза лимфоцитов является причиной формирования иммунологической
недостаточности. При проведении тестирования определяют процент апоптотических клеток в
селезенке мышей после обработки их наноматериалом согласно разделам 4.2 и 4.3.
Спленоциты, выделенные из групп контрольных мышей и групп,
обработанных
анализируемым наноматериалом, согласно разделу 4.7.1, разводят в
среде
RPMI-1640 до концентрации 10 кл./куб. см и в объеме 0,1 куб. см
помещают в
пробирки для проведения цитометрического анализа (например,
Falkon).
Отмывают в ФСБ 1 раз. Клетки фиксируют охлажденным до 4 °C 70°
этиловым
спиртом в течение не менее 1 часа (можно оставить препарат в
фиксаторе до
24 ч). Спирт добавляют по каплям, тщательно перемешивая
лейкоцитарную
взвесь, во избежание образования конгломератов. Фиксированные
образцы
центрифугируют при 400 g 5 мин. Супернатант удаляют.
Тщательно перемешивают лейкоцитарную взвесь и добавляют пропидий йодид в концентрации
5 мкг/куб. см в 0,2 куб. см в ФСБ, содержащем 0,1% тритона Х-100, 0,005 куб. см раствора РНК-азы и
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
0,1% азид натрия. Пробы перемешивают, инкубируют в темноте 1 час при комнатной температуре.
Анализ проводят на проточном цитофлюориметре (FACSCalibur, BD или аналог) с аргоновым
лазером при длине волны 488 нм в программе Cell Quest.
Анализируют 10000 клеток, среди которых определяют процент гиподиплоидных
(апоптотических) и пролиферирующих клеток с использованием программы Cell Quest.
Цитотоксичными считаются наноматериалы, индуцирующие после иммунизации животных
апоптоз более чем у 10% спленоцитов или снижающими до 15% количество пролиферирующих
клеток.
4.11.4. Оценка цитотоксического действия наноматериалов на лейкоциты периферической
крови человека
Оценку цитотоксичности наноматериалов in vitro в методе проточной цитофлуориметрии
проводят с использованием красителя 7-AAD (7-амино-актиномицин D). 7-AAD может
использоваться вместе с флюорохромами ФИТЦ (флюоресцеин изотиоционат) и PE (фикоэритрин).
Одновременное окрашивание клеток CD45 ФИТЦ (маркер всех кроветворных клеток лейкоцитов) и
7-AAD позволяет точно оценить количество жизнеспособных клеток.
Анализ проводят следующим образом. Разведения культуры донорских лейкоцитов человека,
полученных согласно разделу 4.7.1, вносят в лунки 96-луночного планшета по 100 куб. мм. Схема
эксперимента представлена в таблице 4.
Таблица 4
СХЕМА АНАЛИЗА ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НАНОМАТЕРИАЛОВ