Изменениям в клетках высших животных

Цитофлюориметрии по качественным и количественным

Оценка безопасности наноматериалов методом проточной

Для оценки безопасности наноматериалов используют методы проточной цитофлюориметрии,

которые основаны на считывании флюоресцентных сигналов с каждой клетки биологического

образца, меченной моноклональными антителами к специфическим рецепторам или

флюорохромными красителями. Методами проточной цитофлюориметрии изучаются клетки

иммунной системы, которые являются наиболее чувствительными к повреждающему действию

наноматериалов или иных факторов.

Основными путями поступления наноматериалов в организм человека являются:

ингаляционный, алиментарный и перкутанный. Поступая в организм человека, наноматериалы могут

оказывать цитотоксическое действие на иммунную систему. Стратегия определения

иммунотоксичности наноматериалов состоит в последовательном изучении состояния клеточных

элементов иммунной системы в условиях действия наноматериалов на организм животных (схему

эксперимента см. разделы 4.2 и 4.3). Объектом для анализа являются клетки селезенки и

перитонеальные макрофаги интактных и обработанных наноматериалами лабораторных животных.

4.11.1. Определение содержания T- и B-лимфоцитов и соотношения T-хелперов и

цитотоксических T-лимфоцитов

Центральное место в иммунных реакциях организма принадлежит лимфоцитам.

Количественное нарушение субпопуляций лимфоцитов приводит к развитию иммунодефицитных

состояний. В ходе медико-биологического тестирования наноматериалов производится определение

абсолютного количества T- и B-лимфоцитов, обеспечивающих развитие иммунного ответа, а также

субпопуляций регуляторных T-лимфоцитов (хелперов и цитотоксических лимфоцитов) после

обработки животного наноматериалом.

Выявление субпопуляций лимфоцитов основано на способности специфических

моноклональных антител связываться с антигенными детерминантами, которые экспрессированы

лейкоцитами. Анализируется флуоресценция ограниченной популяции клеток, чтобы отличить

положительно окрашенные клетки от неокрашенных. Результаты выражают в виде доли

флуоресцирующих клеток в процентах от общего числа клеток.

Например, определяют количество T-лимфоцитов (CD3+, т.е. несущих на своей поверхности

CD3 рецепторы), B-лимфоцитов (CD19+), T-хелперов (CD3+CD4+) и цитотоксических лимфоцитов

(CD3+CD8+).

Анализируется содержание T- и B-лимфоцитов и соотношения T-

хелперов и

цитотоксических T-лимфоцитов следующим образом. В пробирки

вносят по

0,005 куб. см моноклональных антител к поверхностным рецепторам CD3,

CD19,

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

CD4, CD8, меченных разными флуорохромами (например, FITC, PerCP, PE,

APC).

Добавляют по 0,1 куб. см суспензии спленоцитов (1 x 10

кл./куб. см).

Исследуемые образцы тщательно перемешивают и инкубируют в темноте

15 - 30

минут при температуре 22 +/- 4 °C.

Далее лизируют эритроциты с использованием FACS Lysing Solution, BD. Концентрированный

лизирующий раствор предварительно разводят деионизованной водой в 10 раз. В каждую пробирку

вносят по 2 куб. см рабочего раствора, смешивают на вортексе и инкубируют в темноте 10 - 12 минут

(не больше!) при температуре +20 - +25 °C. Осаждают лейкоциты центрифугированием (200 - 300 g, 5

минут). Встряхивают клеточный осадок на вортексе и отмывают лейкоциты в 2 куб. см ФСБ с 0,1%

азидом натрия. Дважды осаждают лейкоциты центрифугированием (200 - 300 g, 5 минут). Вносят в

каждую пробирку по 0,5 куб. см ФСБ с 0,1% азидом натрия, перемешивают.

Затем фиксируют лимфоциты, для этого в каждую пробирку вносят по 500 куб. мм 1% раствора

параформальдегида, хорошо перемешивают. Препараты хранят до проведения анализа при

температуре +4 °C не более 24 часов.

Анализ подготовленных образцов проводят на проточном цитофлюориметре с использованием

программного обеспечения (например, Cell Quest или Multiset).

Специфичность моноклональных антител гарантируется предприятием-изготовителем. Уровень

неспецифического свечения контролируют по изотипическому контролю (флюоресценция должна

отсутствовать).

Для количественного определения субпопуляций лимфоцитов строят стандартную зависимость

с использованием пробирок TRUCount BD, содержащих известное количество флуоресцирующих

частиц или аналог.

Эффект негативного воздействия наноматериала на содержание T- и B-лимфоцитов и

соотношение T-хелперов и цитотоксических T-лимфоцитов выявляют по достоверному

увеличению/снижению данных показателей относительно контрольных значений у интактных

доноров (здоровых, не подвергавшихся воздействию наноматериалов).

4.11.2. Выявление маркера ранней активации лимфоцитов

Для определения влияния наноматериалов на функциональное состояние лимфоцитов

анализируют способность T-клеток активироваться в ответ на стимуляцию in vitro

фитогемагглютинином (ФГА), а B-клеток - в ответ на стимуляцию липополисахаридом (ЛПС). Один

из признаков активации - появление антигена ранней активации CD69 на поверхности лимфоцита.

Принцип метода заключается в подсчете CD3+ клеток, экспрессирующих антиген ранней активации

CD69 в ответ на стимуляцию in vitro ФГА и в учете CD19+CD69+ клеток в ответ на стимуляцию in

vitro ЛПС. Сравнивают количество митоген-активированных CD69-позитивных T- и B-лимфоцитов,

выделенных из групп контрольных мышей и опытных групп животных, обработанных

анализируемым наноматериалом. Низкий уровень экспрессии CD69 рецептора на поверхности T- и

B-лимфоцитов, стимулированных соответствующим митогеном, свидетельствует о снижении

функциональной активности лимфоцитов под воздействием наноматериала.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Высокий уровень спонтанной активации клеток (увеличение CD69-позитивных T- и B-

лимфоцитов у мышей, обработанных наноматериалом) свидетельствует о гиперактивации клеток

иммунной системы.

Возможно также сравнение количества CD69-позитивных T- и B-лимфоцитов,

стимулированных соответствующим митогеном, в присутствии и без наноматериала в среде.

Снижение уровня экспрессии CD69 рецептора на поверхности митоген-активированных T- и B-

лимфоцитов, за счет присутствия наноматериала в среде, свидетельствует о нарушении

функциональной активности лимфоцитов.

При анализе маркера ранней активации лимфоцитов используют внесенные по 0,1 куб. см в

лунки планшета разведения лимфоцитов каждой из исследуемых групп мышей, затем добавляют

питательную среду, растворы КонA, ЛПС и дисперсии наноматериала в питательной среде в

соответствии со схемой (таблица 3).

Таблица 3

СХЕМА АНАЛИЗА МАРКЕРА РАННЕЙ АКТИВАЦИИ