Оценка иммунотропного действия наноматериалов
Целью данной серии тестов является получение информации о воздействии наноматериалов на
функциональную активность иммунокомпетентных клеток человека и животных, в частности,
лимфоцитов. Изучение иммунотропного действия наноматериалов проводят с помощью реакции
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
бласттрансформации лимфоцитов, оценки синтеза лимфоцитами интерферона-гамма, оценки
продукции иммуноглобулина E.
4.10.1. Оценка влияния наноматериалов на поликлональную активацию лимфоцитов в реакции
бласттрансформации лимфоцитов
Интегральным тестом для оценки функционального состояния
лимфоцитов
является реакция спонтанной и индуцированной бласттрансформации
лимфоцитов.
Принцип метода основан на способности лимфоцитов к моно- и
поликлональной
активации (образованию бластных форм клеток) и пролиферации под
действием
многих неспецифических (митогенов) и специфических
(антигенов)
стимуляторов. Уровень поликлональной активации лимфоцитов
оценивается
радиометрически по интенсивности включения в клетки [ H]-тимидина.
В качестве источника лимфоцитов в реакции бласттрансформации используют взвесь
мононуклеаров (лимфоциты и моноциты) периферической крови человека либо спленоциты
экспериментальных животных. Получение обоих видов клеток проводят, как описано в разделе 4.7.1.
Лимфоциты культивируют в ППС на основе РПМИ-1640.
В качестве митогенов для неспецифической активации T-лимфоцитов используют
конканавалин A (КонA) в конечной концентрации 5 мкг/куб. см, для активации B-лимфоцитов - ЛПС
в конечной концентрации 50 мкг/куб. см. Для оценки негативного действия наноматериалов на фоне
действия митогенов используют субоптимальную концентрацию митогенов. Субоптимальную дозу
митогена определяют в предварительных экспериментах.
Образцы наноматериалов разводят в ППС, как описано в разделе 4.8.1.
При постановке реакции концентрацию мононуклеаров
доводят до
5 x 10 кл/.куб. см. Реакцию ставят в 96-луночных плоскодонных
планшетах
в объеме 0,2 куб. см. В опытные лунки вносят 0,1 куб. см
мононуклеаров
с указанной выше концентрацией клеток, 0,05 куб. см раствора
митогена
в соответствующей дозе и 0,05 куб. см наночастиц в
соответствующих
концентрациях. В контрольные лунки вместо наночастиц вносят ППС.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Планшеты
инкубируют от 48 до 120 часов в стандартных условиях (37 °C, 5% CO
, 95%
влажности). За 18 часов до окончания инкубации к клеткам добавляют
меченый
тритием тимидин в концентрации 1 мкКи/лунку в объеме 0,3 куб. см.
После окончания инкубации с помощью планшетного харвестера лимфоциты из лунок планшета
переносят на стекловолокнистые или бумажные фильтры, которые после промывки водой и
фиксации спиртом помещают в лунки планшета. Затем добавляют 0,1 куб. см сцинтилляционной
жидкости для определения концентрации изотопа и измеряют их радиоактивность на планшетном
сцинтилляционно-люминесцентном счетчике Top Count (Packard, США). Каждую пробу выполняют
в 3 повторах и результаты по определению радиоактивности усредняют.
Оценку результатов опыта определяют по двум показателям: числу импульсов в минуту (CPM) и
индексу стимуляции, рассчитанному как отношение импульсов в минуту в присутствии митогена и
без него. По уровню включения радиоактивной метки судят о степени поликлональной активации
лимфоцитов. В присутствии митогена оценивают индуцированную поликлональную активацию
лимфоцитов, а без митогена - спонтанную. Безопасность наноматериалов оценивают по негативному
влиянию на спонтанную и индуцированную поликлональную активацию лимфоцитов. Сравнение
результатов опытных (с наноматериалом) и контрольных тестов проводят с использованием t-
критерия Стьюдента. Эффект наноматериала признается выявленным при уровне значимости
различия P < 0,05.
4.10.2. Оценка влияния наноматериалов на продукцию лимфоцитами интерферона-гамма
(ИНФ-гамма) методом ИФА
Принцип метода основан на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью
ферментативной реакции окисления субстрата (ОФД). Степень окисления оценивается
колориметрически, по интенсивности окраски судят о количестве ИНФ-гамма в клеточном
супернатанте. В качестве модельной клеточной системы для синтеза ИНФ-гамма используют взвесь
мононуклеаров (лимфоциты и моноциты) человека либо спленоциты экспериментальных животных.
Получение обоих видов клеток проводят, как описано в разделе 4.7.1. Клетки культивируют в ППС на
основе РПМИ-1640.
В качестве митогенов для активации синтеза ИНФ-гамма лимфоцитами используют ФМА в
конечной концентрации 100 нг/куб. см вместе с иономицином в конечной концентрации 1 мкг/куб.
см. Для оценки действия наноматериалов используют субоптимальную концентрацию активаторов,
которую определяют в предварительном эксперименте. Для предварительной оценки
субоптимальных концентраций активаторов определяют концентрацию, при которой отсутствует
окисление субстрата (ОФД), что оценивается колориметрически.
Образцы наноматериалов разводят в ППС, как описано в разделе 4.8.1.
При постановке реакции концентрацию мононуклеаров
доводят до
5 x 10 кл./куб. см. Реакцию ставят в 96-луночных плоскодонных
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
планшетах
в объеме 0,2 куб. см. В опытные лунки вносят 0,1 куб. см
разведения
мононуклеаров с указанной выше концентрацией клеток, 0,05
куб. см
активаторов в вышеуказанных дозах и 0,05 куб. см дисперсии
наночастиц
в соответствующих концентрациях. В контрольные лунки вместо
наночастиц
вносят ППС. Планшеты инкубируют от 24 до 48 часов в стандартных
условиях
(37 °C, 5% CO , 95% влажности). Через 24 и 48 часов отбирают
супернатант
макрофагов и используют для определения количества ИНФ-гамма.
Определение количества ИНФ-гамма производят с помощью иммуноферментной тест-системы
на основе моноклональных антител. Реакцию ставят в 96-луночном полистироловом планшете из
тест-системы с адсорбированными мышиными или человеческими моноклональными антителами к
ИНФ-гамма. Промывают дважды каждую лунку планшета 200 куб. мм буфера для промывания (ФСБ
+ 0,05% твин 20).
Разводят стандарт и исследуемые образцы супернатанта буфером для разведения на основе ФСБ
согласно инструкции к набору. Вносят по 0,1 куб. см разведенного стандарта в двух репликах в лунки
планшета (первые два ряда). В остальные лунки планшета вносят по 0,1 куб. см исследуемых
супернатантов в трех повторностях. Далее во все лунки вносят по 0,1 куб. см раствора
биотинилированного конъюгата МАТ, разведенного буфером для разведения согласно инструкции
фирмы-производителя. Герметично закрывают планшет липкой лентой и инкубируют при
встряхивании на шейкере при комнатной температуре 2 часа.
Удаляют содержимое лунок, трижды промывают лунки 0,2 куб. см буфера для промывания и
вносят в каждую лунку по 0,1 куб. см конъюгата проявляющего субстрата со стрептавидином,
разведенного буфером для разведения согласно инструкции фирмы-производителя.
Инкубируют планшет при комнатной температуре 10 - 20 минут, пока интенсивность окраски
наименьших разведений стандарта не достигнет значений оптической плотности при 450 нм - 0,8 -
0,9. Останавливают реакцию добавлением 0,1 куб. см стоп-раствора. Определяют интенсивность
окрашивания по оптической плотности раствора на планшетном фотометре при длине волны 450 нм
против контрольной лунки, в которой содержится только ППС и конъюгат МАТ.
Оценку результатов теста проводят путем сопоставления оптической плотности в опытных и
контрольных лунках. Величина оптической плотности пропорциональна количеству ИНФ-гамма. В
присутствии активаторов оценивают индуцированный синтез ИНФ-гамма, а без них - спонтанный
уровень синтеза ИНФ-гамма. Безопасность наноматериалов оценивают по негативному влиянию на
спонтанный и индуцированный уровень синтеза ИНФ-гамма лимфоцитами.
Каждый опытный и контрольный тест выполняют в трех повторностях. Достоверность
разницы оптической плотности по сравнению с контролем определяют по критерию Стьюдента.
Искомое воздействие наноматериала на жизнеспособность клеток считается выявленным при
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
установлении различия на уровне значимости P < 0,05.