Оценка цитотоксических свойств наноматериалов
4.9.1. Оценка цитотоксичности с помощью МТТ
Принцип метода МТТ основан на способности фермента сукцинатдегидрогеназы
митохондриальной мембраны клеток млекопитающих восстанавливать желтую соль 3-[4,5-
диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид (МТТ) до кристаллов формазана фиолетового
цвета, накапливающихся в результате этой реакции в цитоплазме живых клеток. Таким образом, по
интенсивности накопления кристаллов формазана в цитоплазме можно судить об уровне
митохондриального дыхания клетки, что является показателем ее жизнеспособности. Количество
образуемого формазана в клеточном монослое пропорционально имеющемуся количеству живых
клеток. Безопасность наноматериалов оценивают по величине ингибирующего эффекта наночастиц
на пролиферацию и жизнеспособность эукариотических клеток-мишеней.
Выбор клеток-мишеней зависит от предполагаемых биологических эффектов наночастиц,
заявленных их производителями. Чаще всего в качестве клеток-мишеней используют перевиваемые
клеточные культуры: мышиные фибробласты L929, мышиные макрофагоподобные клетки J774.1A или
эпителиальные клетки человека HeLa S3.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Мышиные фибробласты L929 культивируют в ППС на основе
DMEM. Для
эксперимента клетки L929 пересевают в соответствии со
стандартной
процедурой (раздел 4.7.2) в 96-луночный плоскодонный планшет для
культур
клеток в ППС в концентрации 2 x 10 клеток/куб. см по 100 куб. мм в
лунку.
Наноматериалы подготавливают и вводят в культуру клеток, как
описано в
разделе 4.8.1. Образцы наноматериалов разводят в ППС. Обычно при
первичном
исследовании образца используют титрование шагом от
концентрации
10 мг/куб. см до пикограммовых концентраций. Затем раститрованный
образец
добавляют к монослою клеток (по 100 куб. мм в лунку) и
проводят
культивирование клеток в стандартных условиях (37 °C, 5% CO
, 95%
влажности). В качестве контроля используется среда или
растворитель
(носитель) образца (в случае его применения), который также
добавляется
в среду культивирования в той же концентрации, что и в составе
исследуемого
образца наноматериала.
Через 24, 48, 72, 96 и 120 часов после добавления препаратов наноматериалов в каждую лунку
добавляют по 10 куб. мм раствора МТТ в ФСБ (5 мг/куб. см), инкубируют 4 часа и затем вносят 50
куб. мм лизирующего буфера на основе ДСН (таблица 2) для лизиса клеточного монослоя и
растворения фиолетовых кристаллов формазана в цитоплазме клеток. Через 18 ч инкубации при
комнатной температуре определяют интенсивность фиолетового окрашивания по оптической
плотности раствора на планшетном спектрофотометре при длине волны 595 нм. Оценку результатов
теста МТТ проводят путем сопоставления оптической плотности в опытных и контрольных лунках.
Величина оптической плотности пропорциональна количеству живых клеток в лунках. По
изменению оптической плотности судят о цитотоксической активности препарата. Достоверность
разницы оптической плотности по сравнению с контролем определяют по критерию Стьюдента.
Возможное негативное воздействие наноматериала на жизнеспособность клеток считается
выявленным при установлении различия на уровне значимости P < 0,05.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Таблица 2