Получение и культивирование клеточных культур

СОСТАВ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Приготовление растворов и сред

Состав применяемых питательных сред представлен в таблице 1.

Таблица 1

Компоненты Количество

Среда РПМИ-1640

Сухая среда РПМИ-1640 (Sigma) 10,4 г

Деионизированная вода До 1000 куб. см

Полная питательная среда (ППС) на основе РПМИ-1640

Сухая среда РПМИ-1640 (Sigma) 10,4 г

Натрий бикарбонат безводный 2 г

Буфер HEPES 5,96 г

L-глутамин 0,146 г

Фетальная сыворотка теленка (FCS) 50 куб. см

Деионизированная вода До 1000 куб. см

Полная питательная среда (ППС) на основе DMEM

Сухая среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM) (Sigma) 9,99 г

Натрий бикарбонат безводный 2 г

Буфер HEPES 5,96 г

L-глутамин 0,146 г

Фетальная сыворотка теленка (FCS) 100 куб. см

Деионизированная вода До 1000 куб. см

Среда 199

Сухая среда 199 (Sigma) 9,9 г

Деионизированная вода До 1000 куб. см

4.7.1. Получение первичных клеточных культур

Выделение перитонеальных макрофагов мыши

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Клетки выделяют из перитонеальной полости мышей за сутки до

начала

эксперимента. Перитонеальные макрофаги мыши получают с помощью

промывания

брюшной полости раствором фосфатно-солевого буфера. Мышей

эвтаназируют

ингаляцией CO , затем асептически вскрывают брюшину и промывают

брюшную

полость 4 - 6 куб. см ФСБ, используя пинцет и пипетку. Для

исключения

адгезии клеток к пластику пробирку с суспензией перитонеальных

клеток

держат на ледяной бане. Суспензию клеток перитонеальной

полости мыши

центрифугируют при 250 g 10 мин., затем убирают надосадочную

жидкость,

лизируют эритроциты добавлением 1 куб. см деионизованной воды на 15

секунд

с тщательным перемешиванием. Восстанавливают солевой баланс

раствора

добавлением 1 куб. см 2-кратного ФСБ, снова центрифугируют и

убирают

надосадочную жидкость. После этого добавляют ППС на основе

DMEM,

подсчитывают количество клеток в камере Горяева, доводят

концентрацию до

3 - 5 x 10 клеток/куб. см, высевают в плоскодонный 96-луночный

планшет для

культур тканей и оставляют на 24 часа до формирования монослоя.

Выделение альвеолярных макрофагов морской свинки

Суспензию интерстициальных легочных клеток получают по методу

[Holt

et al., 1985] в модификации [Lyadova et al., 1998]. После

анестезии

гексеналом (5 мг/мышь) кровеносную систему через правый желудочек

сердца

перфузируют раствором Версена с антибиотиками (100 ед./куб. см

пенициллина

и 100 мкг/куб. см стрептомицина) до молочно-белой окраски легочной

ткани.

Для удаления бронхоальвеолярных клеток легкие несколько раз

промывают этим

же раствором через канюлированный надрез в трахее. Легочные доли

измельчают

глазными ножницами до кусочков размером 1 - 2 куб. мм и помещают

в ППС

на основе среды RPMI 1640, содержащую 150 ед./куб. см

коллагеназы,

50 ед./куб. см ДНК-азы и антибиотики (гентамицин 100 мкг/куб.

см или

пенициллин 100 мкг/куб. см), из расчета 5 куб. см среды/мышь.

После

инкубации в течение 90 минут в CO -инкубаторе полученный

дезинтеграт

для улучшения моноклеточности интенсивно пипетируют. Суспензию

клеток

трижды промывают ФСБ с антибиотиками (гентамицин 100 мкг/куб.

см или

пенициллин 100 мкг/куб. см), ресуспендируют в среде 199 с

10% FCS

и антибиотиками (гентамицин 100 мкг/куб. см или

пенициллин

100 мкг/куб. см), а затем инкубируют в культуральных флаконах

Costar

(75 куб. см) в CO -инкубаторе (60 мин.) из расчета 20 - 30 x 10

легочных

клеток в 8 - 10 куб. см на флакон.

Дальнейшую отмывку от неприлипших клеток и перевод макрофагов из монослоя в суспензию

проводят в среде DMEM без антибиотиков так же, как описано выше для перитонеальных

макрофагов.

Получение спленоцитов мыши

Клетки получают в день эксперимента. Мышей эвтаназируют

ингаляцией CO ,

затем асептически вскрывают брюшную полость и изолируют

селезенку.

Селезенку стерильно гомогенизируют через капроновый фильтр в

среду

РПМИ-1640, дважды центрифугируют полученную суспензию спленоцитов при

250 g

по 10 мин., ресуспендируют в ППС на основе РПМИ-1640 до

конечной

концентрации 5 x 10 клеток/куб. см и вносят в плоскодонный 96-

луночный

планшет для культур тканей. Клеточную суспензию спленоцитов

используют как

источник лимфоцитов.

Получение лейкоцитов и мононуклеаров периферической крови

человека

Клетки получают в день эксперимента. Лейкоциты человека

получают из

периферической крови здоровых доноров методом осаждения крови

в 1%

растворе желатина. Периферическая венозная кровь в количестве 5

куб. см

забирается в пробирку, содержащую гепарин из расчета 10 ед. на 1

куб. см

крови. Гепаринизированная кровь смешивается с 1% раствором

желатины в

среде-199 или среде РПМИ-1640 в равных объемах и инкубируется 30

мин. при

37 °C. После осаждения эритроцитов надосадок забирается и трижды

отмывается

раствором Хенкса без фенолового красного при 250 g по 10 мин.

После

последней отмывки клеточный осадок ресуспензируют в ППС на основе

РПМИ-1640

до конечной концентрации 5 x 10 клеток/куб. см и помещают в 96-

луночный

плоскодонный планшет для культур клеток по 100 куб. мм в

лунку.

Клеточную суспензию лейкоцитов используют как источник нейтрофилов.

Мононуклеары человека получают из венозной крови здоровых

доноров

методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-

верографина,

состоящем из смеси фиколла и верографина плотностью 1,077.

Периферическую

венозную кровь в количестве 5 куб. см забирают в стерильную

пробирку,

содержащую гепарин из расчета 25 ед. на 1 куб. см крови.

Гепаринизированную

кровь разводят средой 199 или средой РПМИ-1640 в равных объемах,

аккуратно

с помощью пипетки по стенке пробирки наслаивают ее на 3

куб. см

фиколл-верографина и центрифугируют 45 мин. при 400 g и температуре

21 °C

на центрифуге с горизонтальным (бакетным) ротором. Затем аккуратно

собирают

пипеткой слой мононуклеаров (белое кольцо, образующееся на

разделе фаз

между градиентом плотности и плазмой крови) и трижды отмывают

средой 199

или средой РПМИ-1640 центрифугированием при 1000 g и температуре

4 °C в

течение 5 мин. Дополнительно освобождаются от эритроцитов,

ресуспендируя

мононуклеары в 2 куб. см лизирующего раствора с последующим

осаждением и

двукратным отмыванием средой 199. После последней отмывки клеточный

осадок

ресуспендируют в ППС на основе РПМИ-1640 до

концентрации

2 - 3 x 10 кл./куб. см и вносят в плоскодонный 96-луночный

планшет для

культур тканей. Клеточную суспензию мононуклеаров используют как

источник

лимфоцитов.

4.7.2. Ведение и подготовка перевиваемых клеточных культур к тестированию

В тестах по оценке безопасности наноматериалов используются в качестве моделей следующие

клеточные линии: мышиные макрофагоподобные клетки J774.A1, мышиные фибробласты L929,

эмбриональные мышиные фибробласты линии Balb/3T3 (линия 3T3), человеческие моноцитарные

линии THP-1 и HL-60, человеческую лимфоидную линию К-562.

Клетки готовят за 24 часа до тестирования. Суспензионные

клеточные

линии разводят свежей ППС на основе D-MEM до

концентрации

1 - 4 x 10 клеток/куб. см и вносят по 100 куб. мм в

лунки

96-луночного планшета. Для подготовки адгезивных клеток во

флакон,

содержащий клеточный монослой, вносят 5 куб. см раствора

трипсин/ЭДТА и

инкубируют 10 минут. После удаления раствора трипсин/ЭДТА клетки

снимают с

пластиковой подложки интенсивным встряхиванием флакона и затем

смывают

10 куб. см раствора Хенкса без фенолового красного (Sigma).

Полученную

суспензию клеток центрифугируют при 500 g 10 минут, помещают в

свежую

питательную среду в концентрации 1 - 4 x 10 клеток/куб. см, вносят в

лунки

96-луночного планшета и инкубируют 24 ч для

кондиционирования и

формирования монослоя в стандартных условиях.

5rik.ru

Материалы для учебы и работы

Получение и культивирование клеточных культур