ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

Лабораторный практикум составлен согласно действующей программе по «Анатомии сельскохозяйственных животных, в том числе и птиц» для средних специальных учебных заведений, по специальности «Технология мяса, мясопро­дуктов и птицепродуктов». При проведении лабораторных работ необходимо ис­пользовать диапроектор и диапозитивы, демонстрировать видеофильмы по раз­личным системам органов или фрагменты видеофильмов по препаровке животно­го или птицы, кроме того, желательно пользоваться на занятиях компьютерными программами по анатомии сельскохозяйственных животных, в том числе птиц. На лабораторных работах следует большое внимание уделять изучению готовых гис­тологических препаратов, при отсутствии учебных наборов гистологических пре­паратов следует их изготовить по методике, описанной в лабораторной работе «Техника изготовления гистологических препаратов».

Занятия проводятся с применением микроскопической техники, поэтому надо прежде всего ознакомиться с устройством микроскопа и правилами работы с ним.

Важное значение придается зарисовкам изучаемых объектов. Благодаря ри­сунку препарат лучше запоминается, закрепляется его зрительное представление и тем самым обеспечивается лучшее и более глубокое восприятие фактического материала. Зарисовку надо проводить с самого препарата. Изучение обязательно начинают при слабом увеличении микроскопа (объектив 8х, окуляр 7х). При сла­бом увеличении микроскопа выбирается нужное место, которое устанавливается в центре поля зрения для дальнейшего рассмотрения отдельных деталей и зарисов­ки при сильном увеличении (объектив 40х, окуляр 7х). Рисунки желательно вы­полнять цветными карандашами или фломастерами и сопровождать пояснитель­ным текстом.

Рис. 116. Устройство и оптическая схема микроскопов:

а — МБР-1: / — ножка микроскопа; 2 — кронштейн конденсора; 3 — тубусодержатель (ручка микроскопа); 4 — коробка с механизмом; 5— окуляр; 6 — тубус; 7 — призма; 8 — головка ту-бусодержателя; 9— винт для фиксации револьвера; 10 — револьвер на салазках; 11 — объектив; 12 — предметный столик; 13 — конденсор; 14 — рукоятка ирис-диафрагмы; 15 — апертурная диафрагма; 16 — зеркало; 17 — микрометрический винт; 18 — макрометрический винт; б — световой микроскоп: / — штатив; 2— микровинт; 3— макровинт; 4— тубус; 5— окуляр; 6— объектив; 7— револьвер; 8— предметный столик; 9 — микропрепарат; 10— клеммы; 11 — винт столика; 12 — винт конденсора; 13 — ручка диафрагмы; 14 — конденсор; 15 — зеркало

Тубус — зрительная труба микроскопа. В нижней части тубуса находится ре­вольвер, в который ввинчиваются объективы. Револьвер вращается и дает возмож­ность быстро менять объективы и переходить от одного увеличения к другому. На револьвере напротив объектива имеется желобок, в который входит специальная пружина, закрепляющая объектив в центральном положении. При попадании пружины в желобок появляется небольшой щелчок, а затем необходимо неболь­шое усилие для выведения револьвера из этого положения. На резкость тубус ус­танавливают двумя винтами: макрометрическим и микрометрическим. Макромет­рический винт служит для грубой установки микроскопа (освещения поля зрения и просмотра сухими объективами). Точную установку производят микрометри­ческим винтом, который позволяет перемещать тубус на 0,1 мм.

Предметный столик предназначен для размещения изучаемого объекта (на­пример, гистологического препарата). Препарат закрепляют на столике специаль­ными клеммами. В центре столика имеется отверстие для прохождения лучей све­та, освещающих препарат. Предметные столики подвижны (имеются на краях столика специальные винты). Вместе со столиком передвигается и изучаемый препарат, что позволяет рассматривать его в разных местах.

Оптическая часть микроскопа состоит из осветительной и оптической сис­тем

К осветительной системе относят зеркало и конденсор с диафрагмой. Поле зрения микроскопа освещают с помощью зеркала и осветителя (конденсора). Зер­кало микроскопа вращается. Одна сторона зеркала плоская, другая вогнутая. Зер­калом лучи света направляют через рассматриваемый предмет в объектив. Плос­ким зеркалом пользуются при хорошем дневном освещении, а вогнутым — в ос­новном при искусственном освещении.

Конденсор находится под предметным столиком микроскопа. Он состоит из нескольких собирательных линз, которые концентрируют лучи света рассматри­ваемого предмета.

Диафрагма расположена ниже конденсора и служит для регулирования осве­щения. Она состоит из металлических пластинок, которые поворотом рычажка сдвигаются или раздвигаются. При этом отверстия, пропускающие отраженные зеркалом лучи, суживаются или расширяются. Такая диафрагма называется ирис-диафрагмой.

При микроскопировании окрашенных препаратов конденсор обычно припод­нят, верхняя плоская линза совпадает с поверхностью предметного столика, ди­афрагма открыта. При микроскопировании неокрашенных препаратов конденсор опускают до тех пор, пока свет не появится в плоскости препарата, диафрагму закрывают на 3/4.

Оптическая система микроскопа состоит из объективов и окуляров. Объек­тив — система линз, заключенных в металлическую оправу. Он дает действитель­ное, увеличенное и обратное изображение объекта и выявляет его детали. Биоло­гические микроскопы могут иметь один или более объективов. На металлической оправе каждого объектива нанесена цифра, показывающая увеличение, даваемое данным объективом. Различают сухие объективы и иммерсионные. Сухой объек­тив — это объектив, у которого между препаратом и линзой находится воздух. К таким объективам относят объективы с увеличением в 8 и 40 раз. Объектив с уве­личением в 90 раз — иммерсионный. Иммерсионный объектив при работе необ­ходимо погружать в кедровое масло. Применение масла позволяет увеличить поле зрения линзы.

Окуляр состоит из двух линз, заключенных в металлическую оправу. Нижняя линза называется собирательной, верхняя — глазной. Окуляр увеличивает изобра­жение, данное объективом, т. е. дает мнимое изображение, поэтому чем в боль­шей степени увеличивает окуляр, тем менее точным будет изображение. Биологи­ческие микроскопы имеют окуляры с увеличением в 7, 10 и 15 раз.

Общее увеличение микроскопа равняется произведению увеличения объекти­ва на увеличение окуляра. Комбинируя объектив и окуляры, можно достигнуть различных степеней увеличения.

2. Правила работы с оптическим микроскопом. Перед ра­
ботой проверяют исправность микроскопа, устанавливают освещение. Для этого
револьвер переводят на объектив наименьшего увеличения и располагают на рас­
стоянии 1,5 см от предметного столика. Наблюдая в окуляр, зеркало ставят так,
чтобы лучи света проходили через отверстие диафрагмы в конденсор и попадали в
объектив. После установки освещения препарат помещают на предметный сто­
лик, закрепляют зажимали и рассматривают, пользуясь определенным объекти­
вом. По окончании микроскопирования тубус микроскопа поднимают и снимают
препарат спредметного столика.

После работы с иммерсионным объективом его необходимо протереть мягкой тряпочкой или замшей. Хранят микроскопы в специальных футлярах.

3.Бинокулярныймикроскоп (рис. 117,а). При необходимости рас­ширения границ видимости и улучшения изображения некоторых объектов при­меняют специальный бинокулярный микроскоп с двумя окулярами. Они дают правильное стереоскопическое изображение предмета в трех измерениях. При микроскопировании тубусы с окулярами сдвигаются или раздвигаются до тех пор, пока изображение предмета не совпадет в обоих глазах.

4.Эл ектро нный микроскоп (рис. 117,6). Устройство электронного микроскопа аналогично устройству оптического. Но оптические линзы в элект­ронном микроскопе заменены электромагнитными катушками, которые создают электромагнитное поле. Оно управляет движением потока электронов. Электроны

Рис. 117. Микроскопы:

а — бинокулярный: 1 — тубусо-держатель; 2 — окуляры; 3 —

ножка микроскопа; б — электронный: 1 — фотокаме­ра; 2 — окошко для наблюдения конечного изображения; 3 — све­товой микроскоп; 4 — проекци­онная линза; 5 — окошко для на­блюдения промежуточного изоб­ражения; 6 — ручка управления пушкой; 7 — люк для смены объекта; 8 — конденсорная лин­за; 9 — пушка; 10 — линза объек­тива; 11 — вакуум-провод; 12 — поводки передвижения объекти­ва; 13 — люк для смены фотопла­стинок; 14 — клапанный пере­ключатель вакуума; IS— диффу­зионный масляный насос; 16 — ручка управления вакуум­ной системой

излучаются специальным ис­точником — электронной пушкой. На пути потока электронов ставят препарат с исследуемым объектом, ко­торый отражается на экран. На нем наблюдают объект или производят съемку с помощью фотографического аппарата, вмонтированного в микроскоп.

В электронном микроскопе можно получить изображение, увеличенное в 100—200 тыс. раз. Электронная микроскопия постоянно совершенствуется. Она нашла широкое применение в науке.

ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ КЛЕТКИ ОРГАНИЗМА ЖИВОТНОГО

Цель работы:ознакомление студентов со строением клетки организма живот­ного. Обратить особое внимание на органоиды клетки.

Оборудование и материалы:микроскопы; набор гистологических препаратов по общей гистологии.

Содержание работы. 1.Изучение под микроскопом гистологических препара­тов по морфологии клетки. 2. Зарисовка изученных препаратов в Рабочую тетрадь. 3. Повторение функции органоидов клетки, которые были изучены под микро­скопом.

Методические указания.1. Для ознакомления со строением клетки организма животного следует использовать окрашенные гистологические препараты из на­боров, специально изготовляемых для учебных целей. В наборах имеются препа­раты нервной клетки спинального узла лошади или свиньи. Нервные клетки — наиболее крупные из тканевых клеток животных. Они имеют отростки, но при обычных методах обработки они не выявляются, и клетки спинальных узлов ка­жутся круглыми. При слабом увеличении в клетке хорошо различимы цитоплазма с включениями и ядро. Ядро имеет вид крупного светлого пузырька, покрытого оболочкой; в нем видно ядрышко в виде круглого шарика красного цвета. Вокруг нервных клеток располагаются клетки нейроглии. При специальной обработке препарата (азотнокислым серебром) в цитоплазме выявляется сетчатый аппарат Гольджи в виде густой сети, окружающей ядро со всех сторон.

2. Все изученные под микроскопом препараты следует зарисовать цветными карандашами или фломастерами в специальную Рабочую тетрадь. Каждый зари­сованный препарат подписывают в соответствии с его названием, указанным на наклейке предметного стекла. Кроме того, в зарисованном препарате следует обо­значить стрелками все увиденные составные части клетки.

3. Все изученные под микроскопом структурные образования в клетке орга­низма животного выполняют различные функции, необходимые для ее жизнедея­тельности. Следует указать функции этих образований.

ТЕХНИКА ИЗГОТОВЛЕНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Цель работы:ознакомить студентов с методами изготовления гистологических препаратов, с требованиями, предъявляемыми к ним.

Оборудование и материалы:лабораторное животное, в том числе птица; инст­рументы (ножницы, скальпель, препаровальные иглы, кровоостанавливающие за­жимы, шпатели и др.); раствор формалина; спирт 96%-ный; парафин; микротом; гематоксилин-эозин; смола; предметные и покровные стекла; бензол; бумага для этикетирования предметных стекол.

Содержание работы.1. Изучить требования, предъявляемые к гистологичес­ким препаратам. 2. Взятие материала для приготовления гистологического пре­парата. 3. Фиксация исследуемого материала. 4. Промывание, обезвоживание и уплотнение исследуемого материала. 5. Приготовление срезов. 6. Окрашивание срезов и заключение в специальные среды.

Методические указания.1. Требования,предъявляемые к гис­тологическимматериалам. Хороший гистологический препарат дол­жен отвечать следующим основным требованиям: исследуемая ткань должна в максимальной степени сохранять свое прижизненное строение; срез должен быть достаточно тонким и прозрачным (для того чтобы через него свободно проникали лучи проходящего света); изучаемые микроструктуры должны отчетливо выде­ляться на общем фоне препарата.

Именно на обеспечение этих требований и направлены все усилия в процессе приготовления микроскопического препарата. Первое из условий обеспечивается своевременным взятием и надлежащей фиксацией исследуемого материала, вто­рое — качественным приготовлением и обработкой срезов, третье — соответству­ющей окраской изучаемых микроструктур.

2. Взятиематериаладляприготовлениягистологичес­ких препаратов. Сбор материала — первый этап в приготовлении гистоло­гических препаратов, и от того, насколько правильно выполнена эта процедура, зависит успех всей работы. Существует несколько путей получения материала: от животных, умерщвленных специально для этих целей; от животных в результате при­жизненного иссечения кусочков тканей (биопсия);

взятие материала от трупа. После умерщвления тело живот­ного быстро фиксируют в положе­нии на спине. Мелких лаборатор­ных животных фиксируют на до­щечках, прикалывая за растянутые в стороны лапки (рис. 118).

Для фиксации крупных живот­ных используют специальные стан­ки. Техника вскрытия брюшной и грудной полостей для всех лабора­торных животных одинакова. У животных, имеющих шерстный по­кров, вначале следует иссечь широ­кий кожный лоскут, чтобы избе-

Рис. 118. Фиксация лабораторного животного

жать загрязнения внутренних органов. Для этого, захватив и приподняв с помо­щью хирургического пинцета кожу нижней части стенки живота, по средней ли­нии подрезают ножницами образовавшуюся складку по направлению к голове, срезая кожный лоскут в нужном направлении. Вскрывают брюшную полость, а затем грудную. Следующим этапом является взятие исследуемого материала с по­мощью острых режущих инструментов (скальпель, ножницы и т. д.). Исследова­тель должен обладать знанием основных особенностей анатомо-гистологического строения органов, чтобы правильно выбрать место и направление разреза.

3. Фиксация исследуемого материал а. Ввиду того что лишен­ные питания ткани организма быстро начинают претерпевать необратимые изме­нения, первым и обязательным условием микроскопической техники является предупреждение и задержка посмертных изменений в тканях. Это достигается пу­тем фиксации взятого для исследования материала. Фиксация, как указывает сам термин, представляет собой закрепление, сохранение в обрабатываемом кусочке органа того строения, которое он имел при жизни. В основе действия фиксаторов лежат физико-химические процессы и в первую очередь процесс коагуляции бел­ков. В качестве фиксаторов используют раствор формалина, этиловый спирт, ме­тиловый спирт и др.

4. Промывание ,обезвоживание и уплотнение исследуе­мого материала. Для получения тонких срезов зафиксированный материал необходимо сделать плотным и нехрупким. Для этого ткань следует промыть от излишнего фиксатора. Чаще всего кусочки тканей промывают в проточной водо­проводной воде. После промывки кусочки подвергают дальнейшему уплотнению путем обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации.

5. Приготовление срезов. Приготовление высококачественных гис­тологических препаратов требует наличия равномерно тонких срезов с исследуе­мого объекта. Для того чтобы их получить, кусочки тканей пропитывают и залива­ют такой средой, которая превратила бы их в хорошо режущуюся массу. Для этих целей применяют парафин, целлоидин и желатин. Следующим этапом является приготовление срезов на специальных приборах — микротомах.

Микротом — специальное механическое устройство, предназначенное для приготовления гистологических срезов определенной толщины (рис. 119). ₍

Рис. 119. Санный микротом с подъемным объектодержателем по наклонной

плоскости:

1 — станина; 2 — ножевые салазки с ножом; 3 — микрометрический винт; 4 — рамка с ограни­чителем; 5— объективные салазки с объектодержателем

Резку исследуемого объекта на микротоме производят с помощью специаль­ных микротомных ножей.

Для дальнейшей обработки срезов их наклеивают на предметные стекла. Для этого используют белок с глицерином, дистиллированную воду или 30%-ный

спирт.

6. Окрашивание срезов и заключение в специальные среды. Дальнейшая обработка срезов предусматривает их окрашивание (простая и сложная окраска) для лучшего выявления структурных компонентов и заключе­ние их под покровное стекло. Для окрашивания срезов применяют железный ге­матоксилин, гематоксилин-эозин и т. д. Для того чтобы окрашенный срез можно было исследовать под микроскопом и долго хранить, он должен быть прозрачным и защищен от механических повреждений и влияния факторов внешней среды. Для этого его просветляют, используя 96%-ный спирт, ксилол, бензол и др. За­ключают окрашенные срезы в специальные среды, которые и сохраняют их про­зрачность, окраску и структурную целостность. Готовые гистологические препа­раты обязательно этикетируют.