Грамположительных и грамотрицательных прокариот

Химический состав клеточных стенок

Клеточная стенка

Клеточная стенка представляет собой внешнюю структуру бактерий толщиной 30-35 нм, главным компонентом которой является пептидогликан (муреин). Пептидогликан является структурным полимером, состоящим из чередующихся субъединиц N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных гликозидными связями (рис. 2).

Рис. 2. Схематическое изображение однослойной структуры пептидогликана. Сходящиеся вдали ряды – гетерополимерные цепочки, состоящие из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина (Г) и N-ацетилмурамовой кислоты (М) (Шлегель Г., 1987).

Параллельно расположенные полисахаридные (гликановые) цепи скреплены между собой поперечными пептидными мостиками (рис. 3).

Полисахаридный каркас легко разрушается лизоцимом – антибиотиком животного происхождения. Пептидные связи являются мишенью для пенициллина, который ингибирует их синтез и препятствует формированию клеточной стенки. Количественное содержание пептидогликана влияет на способность бактерий окрашиваться по Граму. Бактерии, имеющие значительную толщину муреинового слоя (90-95%), стойко окрашиваются генцианвиолетом в сине-фиолетовый цвет и носят название грамположительных бактерий. Грамотрицательные бактерии с тонким слоем пептидогликана (5-10%) в клеточной стенке после действия спирта утрачивают генцианвиолет и дополнительно окрашиваются фуксином в розовый цвет. Клеточные стенки у грамположительных и грамотрицательных прокариот резко различаются как по химическому составу (таблица 1), так и по ультраструктуре (рис. 4).

Рис. 3. В левой части фигуры показано детальное строение фрагмента, изображенного справа в рамке. Светлые и черные короткие стрелки указывают связи, расщепляемые соответственно лизоцимом (мурамидазой) и специфической муроэндопептидазой (Шлегель Г., 1987).

Рис. 4. Схематическое изображение клеточной стенки у грамположительных (А) и грамотрицательных (Б) прокариот: 1 – цитоплазматическая мембрана; 2 – пептидогликан; 3 – периплазматическое пространство; 4 – наружная мембрана; 5 – ДНК (Гусев В.М., 1985).

Кроме пептидогликана в клеточной стенке грамположительных бактерий содержатся тейхоевые кислоты (ТК), в меньшем количестве липиды, полисахариды, белки.

Таблица 1

Тейхоевые кислоты (полифосфатные соединения) делят на 2 класса: 1)стеночные, связанные с пептидогликаном клеточной стенки; 2)мембранные (липотейхоевые), соединенные с гликолипидом цитоплазматической мембраны. ТК могут связываться с клеточными мембранами животных клеток и осуществлять процесс адгезии, необходимый для бактериальной колонизации, являющейся первой стадией большинства инфекций. Особый интерес представляет изучение явления индукции тейхоевыми кислотами воспалительных процессов, цитотоксичности и иммуносупрессии.

На поверхности клеточной стенки грамположительных бактерий могут присутствовать белковые молекулы, не образующие структур определенной формы (белок А стафилококков, М-протеин стрептококков). Они обладают высокой биологической активностью, вызывают агглютинацию эритроцитов, являются иммунодепрессантами, угнетают фагоцитоз, комплемент, препятствуют трансформации лимфоцитов, способствуют адгезии бактерий на клетках эпителия слизистых оболочек.

Грамотрицательные прокариоты имеют наружную мембрану, в состав которой входят липиды (22%), белки, полисахариды, липопротеиды.

Липополисахариды (ЛПС) – гетерополимеры с комплексной структурой, обладающие разнообразной биологической активностью. Липоидный комплекс обуславливает токсичность (воспалительные реакции, лихорадка, эндотоксиновый шок), полисахаридный компонент ответственен за О-антигенспецифичность. ЛПС индуцирует синтез Jg М-антител, в иммунологии используется в качестве адъюванта и поликлонального активатора В-клеток.

Клеточная стенка у бактерий выполняет, в основном, формообразующую и защитную функции, обеспечивает ригидность, формирует капсулу, определяет способность клеток к адсорбции фагов.

Методика окраски по Граму

1. На мазок кладут фильтровальную бумагу и наливают карболовый раствор генцианового фиолетового на 1-2 мин.

2. Снимают бумагу, сливают краситель и, не промывая мазок водой, наливают раствор Люголя на 1 мин.

3. Сливают раствор Люголя и обесцвечивают препарат в 96⁰ спирте в течение 30 сек.

4. Промывают водой.

5. Красят 1-2 мин водным раствором фуксина.

6. Промывают водой и высушивают.

В результате окраски грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный.

Различают шаровидные (кокки), палочковидные и извитые формы бактерий (рис. 5).

Рис. 5. Формы одноклеточных бактерий: 1- микрококки; 2 – диплококки; 3 – стрептококки; 4 – стафилококки; 5 – сарцины; 6 – палочковидные бактерии; 7 – спириллы; 8 – вибрионы (Шлегель Г., 1987).

Шаровидные бактерии в зависимости от расположения подразделяют на микрококки (расположенные беспорядочно), диплококки (парное расположение), стрептококки (расположенные цепочками), стафилококки (гроздьевидные) и сарцины (формирующие пакеты). Палочковидные бактерии располагаются часто беспорядочно (эшерихии), попарно (клебсиеллы), под углом (коринебактерии дифтерии), цепочками (возбудитель сибирской язвы). Извитые бактерии могут быть в виде запятой (холерный вибрион) и спиралей с одним –тремя витками (спириллы).

Для микобактерий и нокардий характерна усложненная структура клеточной стенки. Основу у них, также как и у грамположительных бактерий, составляет муреиновый каркас, однако последний связан с полисахаридами и липидами. Липиды представлены миколовыми кислотами, которые придают клеточной поверхности гидрофобность. Гидрофобность, с одной стороны делает клетку устойчивой к действию различных химических веществ (такие бактерии называются кислотоустойчивыми), с другой стороны тормозит обмен клетки с окружающей средой и замедляет ее рост. Поэтому в питательные среды для культивирования микобактерий туберкулеза добавляют поверхностно-активные вещества. Кислотоустойчивость микобактерий является важным диагностическим признаком, для ее определения пользуются окраской по методу Циля-Нильсена.

Методика окраски кислотоустойчивых бактерий

по методу Циля-Нильсена

1. На фиксированный мазок помещают фильтровальную бумагу и наливают карболовый фуксин Циля и осторожно нагревают на горелке до появления паров. Операцию повторяют 2-3 раза.

2. Когда препарат остынет, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и промывают препарат водой.

3. Препарат погружают 2-3 раза в стакан с 5% серной кислотой на 1-2 сек.

4. Тщательно промывают препарат водой и докрашивают щелочным метиленовым синим 3-5 мин.

5. Промывают водой и подсушивают.

Кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются серной кислотой и сохраняют красный цвет, некислотоустойчивые теряют краситель и докрашиваются метиленовым синим в голубой цвет.