Полуконсервативного способа репликации ДНК

Экспериментальное доказательство

Удвоение (репликация) ДНК

Принцип комплементарности (дополнения), лежащий в основе структуры ДНК, позволяет понять, как синтезируются новые молекулы ДНК незадолго перед делением клетки. Этот синтез обусловлен замечательной способностью молекулы ДНК к удвоению, он же определяет передачу наследственных свойств от материнской клетки к дочерним.

Сборка новой цепи идет в точном соответствии с принципом комплементарности: против А-Т, против Г-Ц, в результате образуется две молекулы ДНК того же нуклеотидного состава. Одна цепь «старая» происходит от первоначальной, а другая – синтезируется вновь. Таким образом, воспроизводится точная копия «материнской» молекулы ДНК. Иными словами, каждая нить ДНК служит матрицей, на которой строится комплементарная ей цепь. Процесс удвоения ДНК называется матричным синтезом, т.к. новые молекулы ДНК имеют ту же структуру, что и исходящие.

В дочерних клетках сохраняется та же наследственная информация. Если в исходной ДНК произойдет перестановка или замена нуклеотидов, то в дочерних это будет скопировано – в этом заключается молекулярный механизм изменчивости. Это изменение будет передаваться из клетки в клетку, из поколения в поколение.

До получения экспериментального подтверждения полуконсервативного способа репликации предлагались три варианта удвоения ДНК:

1. консервативный;

2. полуконсервативный;

3. мозаичный.

Н рисунке ниже изображены схемы консервативного и полуконсервативного способов репликации ДНК.

Мозаичный способ предполагает деградацию материнской ДНК до олигонуклеотидных фрагментов и дальнейшую сборку двух новых молекул ДНК как из этих фрагментов, так и с использованием новых нуклеотидов из цитоплазмы (кариоплазмы). Данная гипотеза сразу же вызвала большое количество нареканий, так как требует наличия аппарата запоминания информации, хранящейся в материнской ДНК, на время ее разрушения.

Таким образом, консервативный способ предполагает, что материнская ДНК полностью переходит к одной из дочерних клеток, полуконсервативный - каждой из дочерних клеток переходит по одной цепи от материнской ДНК, мозаичный - обе новые ДНК построены из смеси старых и новых олигонуклеотидных фрагментов.

В 1958 году Месельсон и Сталь с помощью только что разработанного метода центрифугирования в градиенте плотности доказали, что молекулы ДНК удваиваются полуконсервативным способом. Для этого E. coli выращивали в течение многих поколений в среде, содержащей в качестве единственного источника азота ¹⁵NH₄Cl. В результате такой процедуры весь азот ¹⁴N, содержащийся в исходной ДНК замещался на “тяжелый” ¹⁵N. Молекулы ¹⁴N-ДНК и ¹⁵N-ДНК различаются по массе всего на 1%. Однако этой разницы достаточно для разделения таких молекул ДНК в градиенте плотности хлористого цезия. Формирование линейного градиента плотности в центрифужной пробирке осуществляется при длительном центрифугировании пробирок, содержащих возрастающие сверху до низу концентрации хлористого цезия. В результате создается устойчивый градиент плотности от 1,66 до 1,76 г/см³. Под действием центробежной силы молекулы ДНК переходят в ту область градиента, в которой плотность раствора равна их собственной плавучей плотности. Высокополимерные молекулы ДНК образуют четко выраженную полосу, которую легко обнаружить по поглощению в ультрафиолете.

После полного замещения ¹⁴N в молекулах ДНК на “тяжелый” ¹⁵N, бактериальные клетки переносили в среду, содержащую ¹⁴NH₄Cl. При этом в результате последовательных клеточных циклов, каждый из которых включает репликацию ДНК, происходило постепенное обратное замещение "тяжелых" цепей ДНК на "легкие". Динамика изменения "тяжести" молекул ДНК при этом свидетельствовала о способе репликации. На рисунке показаны 3 возможных варианта размещения молекул ДНК в центрифужной пробирке в зависимости от их "тяжести".

При консервативной и полуконсервативном способах репликации должны были наблюдаться следующие изменения положения полос ДНК в центрифужной пробирке после каждого клеточного цикла.

Таким образом, полуконсервативный способ репликации ДНК, характеризуется исчезновением после первого же деления клеток "тяжелых" молекул ДНК, а также появлением гибридных молекул.

Мозаичный способ репликации характеризоваться появлением после первого деления расплывчатой полосы в районе гибридных ДНК с постепенным ее сдвигом вверх при последующих делениях.

Результаты, полученные Месельсоном и Сталем, свидетельствовали именно о полуконсерватив-ном способе репликации ДНК.