Репарация путем гомологической рекомбинации (HRR)

Репарация двунитевых разрывов путем гомологической рекомбинации (HR) считается безошибочным и, как уже не раз говорилось, осуществляется во время поздней S-фазы или G2-фазы. Общая схема этого процесса в клетках эукариот показана на рисунке. Необходимо обратить внимание, что на завершающем этапе HR может осуществляться двумя принципиально различными способами. Первый связан с разрешением классической холлидеевской структуры либо путем кроссинговера, либо путем генной конверсии, сопровождающимся образованием разрывов и в донорной, и в реципиентной ДНК и последующим, реальным (физическим) обменом соседними участками двунитевой ДНК. При репарации путем HR по второму механизму разрывы в донорной ДНК не образуются, а идет инициированный свободным концом ДНК ограниченный синтез в районе повреждения, а затем вновь синтезированная нить вытесняется и отжигается со вторым свободным концом в реципиентном дуплексе. Таким образом, даже если рекомбинация произойдет между негомологичными хромосомами или негомологичным участкам гомологичных хромосом, то это не приведет к появлению хромосомных перестроек. Это очень важно для высших эукариот, так как их геном состоит на 90 % из повторяющихся последовательностей, опасность рекомбинации между которыми достаточно велика.

В процесс репарации путем гомологической рекомбинации вовлечено большое число белков: RAD51, RAD52, RAD54, BRCA1, BRCA2, RAD51-паралоги: RAD51b,c,d, XRCC2, XRCC3 и комплекс MRN. Кроме этих белков, непосредственно участвующих в самом процессе рекомбинации, есть немало факторов, служащих триггерами клеточного ответа на повреждения ДНК, что приводит к изменению параметров клеточного цикла и запуску репарационных реакций. Таким триггерами являются протеинкиназы ATM (ataxia-teleangiectasia mutated), ATR (ataxia-teleangiectasia related), DNA-PK (DNA-dependent protein kinase). Все они являются гомологами PI-3-киназы (фосфатидилинозитол-3' киназы). Известно, что PI-3 киназа активно участвует в передаче сигналов в клетке и опосредует клеточный ответ на действие различных факторов роста, триггерных факторов клеточной дифференцировки и инсулин.

Запускает процесс HRR протеинкиназа АТМ, которая каким-то образом, вероятнее всего через конформационные изменения ДНК, «чувствует» DSB. Затем она переходит в активную форму путем автофосфорелирования по серину в 1981 положении (Ser-1981) и, может быть, связывается с DSB. Активированная АТМ фосфорелирует гистон Н2АХ, что привлекает белки BRCA1 (breast cancer 1) и NBS1 (Niejmegen breakage syndrome, Нийменгенским синдромом ломкости хромосом), которые АТМ также фосфорелирует. NBS1 является частью комплекса MRN (NBS1/RAD50/MRE11) и прямой мишенью АТМ, то есть главным переносчиком сигнала с АТМ на MRN-комплекс. Белок BRCA1 служит якорем и координатором для дальнейшей сборки репарационного комплекса.

Рисунок 25. Репарация двунитевых разрывов путем гомологической рекомбинации (HRR).

Комплекс MRN (обладающий 3’-5’-экзонуклеазной активностью), скорее всего совместно с другими экзонуклеазами (обладающими 5’-3’-активностью) ращепляет ДНК для создания у двунитевого разрыва выступающих концов, которые нужны для их перекрывания в процессе рекомбинации. MRE11, вероятно играет в этом комплексе главную роль, так как обладает одновременно и экзо(3’-5’) – и эндонуклеазной (со сродством к днДНК) активностями. В состав MRN кроме NBS1 и MRE11 входит еще и АТФаза RAD50, раскручивающая ДНК. Общая схема этого пути репарации показана на рис. 25.

BRCA1 привлекает к разрыву BRCA2, который облегчает загрузку белка RAD51 (гомолог RecA) на одетую RPA (гомолог SSB-белка) нить ДНК. То есть у эукариот RAD51 вытесняет RPA с нити в комплексе с BRCA2. Участвующие в реакции паралоги RAD51 в свою очередь привлекают белки RAD52 и RAD54, может быть с помощью WRN и BLM геликаз. Так формируется активный 3’-конец ДНК, ведущий процесс гомологического спаривания и обмена нитей. RAD52 помогает RAD51 образовывать промежуточные комплексы при обмене нитей. Мономеры RAD52, как и в процессе SSA, образуют гептамерное кольцо, способное надеваться как на однонитевую, так и на двунитевую ДНК. RAD54 обладает АТФазной активностью и, взаимодействуя с геликазами, изменяет топологическую структуру ДНК. Эти топологические изменения, препятствуя суперскручиванию ДНК, облегчают RAD51 и RAD52 ее «распрямление» в районе DSB и способствуют их взаимодействию с другими белками репарации. Предполагается, что в некоторых случаях RAD54 может являться именно тем белком, поведение которого приводит к выбору пути репарации между SSA и HRR.

Известно, что в этом ДНК-белковом комплексе также обнаружен антионкоген Р53, способysq связываться с белками BRCA1, RAD51, WRN и BLM.

Геликазы WRN и BLM в процессе синапсиса внедряются в образовавшиеся холидеевских структуры. Именно в этот момент решается, каким образом эти структуры будут разрешены – с кроссинговером или без него. То есть эти геликазы, вероятнее всего, способны «открутить» донорную ДНК после завершения репаративного синтеза от места спаривания без ее разрывов. В эукариотических клетках существует и специфическая для структуры Холлидея геликазная-эндонуклеазная активность, способствующая ее разрешению, которая может быть аналогична RuvABC-активности Е. coli. У S. cerevisiae выделен комплекс Mus81-Mms4, который способен к правильному разрешению Холлидеевской структуры. Белок Mus81 был идентифицирован по его взаимодействию с белком Rad54. Он имеет гомологию с субъединицами структурно-специфической эндонуклеазы ERCC1/XPF (Rad1/Rad10), принимающей участие в NER. Также в разрешении Холлидеевских структур при HRR принимают участие паралоги белка Rad51 (XRCC2 и XRCC3, о которых мы подробнее поговорим ниже).

До сих пор точно не известно, какие ДНК-полимеразы и лигазы участвуют в процессе HRR.

Вероятно, роль HRR более значительна в эмбриональных клетках, чем в клетках взрослого организма. Об этом свидетельствует то, что нокаутные по основным генам HRR мыши погибают еще на эмбриональных стадиях, а клетки, мутантные по этим генам, вполне жизнеспособны