SOS-ответ у E.coli
Ошибки в ДНК возникают в результате неточной работы всех трех различных систем: подбора оснований полимеразами (base selection), редакторской 3'-5'-экзонуклеазы (proofreading) и репарации неправильно спаренных оснований (mismatch correction). Все это называется "спонтанный мутагенез", так как ошибки ДНК-полимеразы присущи самому организму, а не индуцируются извне. Однако, как известно, частоту мутаций можно значительно повысить, если организм обработать каким-либо ДНК-тропным агентом, например химическим веществом, ионизирующим или ультрафиолетовым излучением. Этот эффект называется индуцированным мутагенезом, а его механизм зависит от природы повреждения азотистого основания в ДНК. Все дефекты в ДНК удобно разбить на два класса: модифицированные азотистые основания, не блокирующие работу ДНК-полимеразы; и летальные дефекты, блокирующие работу ДНК-полимеразы. В первом случае ДНК-полимераза узнает дефектное основание и ставит напротив него комплементарное звено (например, при окислении аминогруппы цитозина, комплементарного гуанину, образуется азотистое основание с кетогруппой в четвертом положении, комплементарное аденину, в результате возникает транзиция G → А). Подобного типа дефекты носят исключительно мутагенный характер, а мутагены, индуцирующие в ДНК такие дефекты, широко используются на практике (например, производные алкилирующих соединений типа М-метил-N'-нитpo-N-нитрозогуанидина, метилметансульфоната, бисульфита и многих других).
Более сложная ситуация возникает, если в ДНК индуцируются летальные дефекты, блокирующие ДНК-полимеразу, например апуриновые/апиримидиновые сайты (abasic site или АР-сайты), циклобутановые пиримидиновые димеры (Руг-Руг) и др. В этом случае в клетке возникает особое состояние, получившее название SOS. Ключевыми элементами SOS-системы являются белки RecA и LexA. RecA уже известен нам по процессу рекомбинации (вспомним, что RecA – ключевой белок процесса гомологичной рекомбинации, способствующий формированию особого R-триплекса с гомологичным участком ДНК и переносу нити ДНК с одной молекулы ДНК на другую). LexA – репрессор группы генов (их количество около 30–40), входящих в состав SOS-регулона. LexA связывается со специфическим десятичленным палиндромом в регуляторных областях генов SOS-регулона и таким образом препятствует их транскрипции. Чем выше совершенство каждого данного палиндрома, тем крепче связан с ним репрессор LexA.
Белок RecA выполняет несколько функций. Во-первых, он имеет высокое сродство к однонитевой ДНК, поэтому при взаимодействии с онДНК образуется растянутый филамент RecA: ДНК (один мономер RecA на каждые 4 н. ДНК). Во-вторых, RecA в этом комплексе активируется (активированный RecA обозначают обычно RecA*) и приобретает свойства весьма специфической протеазы, деградирующей белок-репрессор LexA (точнее, ускоряющей авторасщепление белка LexА, то есть он может быть назван его копротеазой). В результате разрушения LexA открываются гены SOS-регулона, из которых два гена, umuD и umuС, имеют прямое отношение к индуцированному мутагенезу.
Здесь же отметим специфическую активность RecA* по отношению к белку UmuD. При взаимодействии RecA* с UmuD с N-конца UmuD отщепляются первые 24 аминокислотных остатка и образуется белок UmuD', который принимает непосредственное участие в SOS-мутагенезе.
Итак, в SOS-индуцированных клетках Е. coli в области повреждения формируется особая структура ДНК: вплоть до дефектного нуклеотида расположена двунитевая ДНК, с З'-ОН-концом последнего правильного нуклеотида которой связана ДНК-полимераза III, затем идут дефектный нуклеотид в матричной нити и однонитевая ДНК в виде филамента (RecA*: ДНК). Есть еще два уже упомянутых белка – UmuD' и UmuC, которые образуют комплекс (UmuD')2UmuC. Основная задача этого комплекса – «проскочить» сложный дефект и, желательно, без потерь, то есть без формирования бреши напротив дефекта. Подобный вариант синтеза и носит наименование TLS (translesion synthesis). Как правило, TLS сопровождается включением во вновь синтезируемую нить нуклеотида, некомплементарного исходному основанию в матрице. В результате возрастает выживаемость клетки (SOS-репарация) и возникает мутация (SOS-мутагенез). Этот процесс схематически показан на рис. 19 (Сойфер, 1997).
Рисунок 19. SOS-ответ у Escherihia coli.
При реконструкции этого процесса в системе in vitro было показано, что очищенный комплекс (UmuD')2UmuC в присутствии белков RecA, ATP и всех четырех dNTP самостоятельно ведет синтез ДНК, причем напротив G (перед дефектом) ставит С (dCTP, комплементарный синтез), а напротив X ставит случайный нуклеотид, то есть что этот комплекс является самостоятельной ДНК-полимеразой типа «error-prone», названной ДНК-полимераза V. Эффективность TLS (но не комплементарного синтеза) принципиально зависит от белка RecA и значительно усиливается при добавлении в смесь белка, связывающего однонитевую ДНК (SSB), и вспомогательных субъединиц ДНК-полимеразы III. В комплексе (UmuD')2UmuC собственно полимеразной активностью обладает UmuC, а субъединица (UmuD')2 является ее активатором. Показано, что механизм SOS-мутагенеза позволяет клетке заменить мутацию со сдвигом рамки (инсерция или делеция нуклеотида), как правило, инактивирующую ген, на более «мягкую» по последствиям мутацию замещения (транзицию или трансверсию).
В 1999 г. получены новые данные и по механизму мутагенеза на неповрежденной матрице ("non-targeted''-мутагенез). Известно, что "non-targeted''-мутагенез наблюдается при введении в SOS-индуцированные клетки неповрежденной матрицы. Показано, что белок DinB (ген dinB относится к группе SOS-генов) отвечает за "non-targeted''-мутагенез на ДНК бактериофага λ, а сверхпродукция этого белка приводит к появлению у клетки мутаторного фенотипа. Белок DinB также обладает полимеразной активностью. Он получил наименование ДНК-полимераза IV: эта полимераза не содержит редакторской экзонуклеазной активности и обладает гомологией с белками семейства UmuC. Таким образом, в клетках Е. coli к настоящему время обнаружены пять ДНК-полимераз: ДНК-полимераза I (репарирующая) обнаружена А. Корнбергом в 1956–1958 годах, ДНК-полимеразы II и III (реплицирующая) выявлены в 1970–1971 годах, а ДНК-полимеразы IV и V– в 1999 году. Долгое время оставалась непонятной роль ДНК-полимеразы II (кодирующий ее ген polB/dinA также относится к группе SOS-генов). Недавно было показано, что ДНК-полимераза II играет ключевую роль в ресинтезе ДНК. Известно, что при УФ-облучении бактерий репликация хромосомы блокируется, а затем через определенное время восстанавливается. Процесс восстановления репликации и называется ресинтезом, или "replication restart". Блокирование репликации определяется двумя факторами: SOS-индуцией umuDC (именно UmuD, но не UmuD'), которые на первой стадии действуют как регуляторы чекпойнтов клеточного цикла (подробнее о чекпойнт-контроле мы будем говорить ниже), увеличивая тем самым время, необходимое для более полного проведения эксцизионной репарации ДНК; и комплексом (UmuD')2UmuC, участвующим в процессе пострепликативной репарации ДНК. Каким именно образом ДНК-полимераза II восстанавливает синтез бактериальной хромосомы, остается пока неясным.
Рисунок 20. Роль интенсивности SOS-сигнала в процессе ответа клетки.
Помимо установления основных принципов действия SOS-системы in vitro, в последнее время получен ряд новых, принципиально важных результатов по регуляции SOS-системы in vivo. Оказалось, например, что белок UmuD расщепляется сериновой АТР-зависимой Lon-протеазой, а процессированный белок UmuD', у которого удалены с N-конца 24 аминокислотных остатка, в том числе фрагмент 15-FPLF, являющийся мишенью для Lon-протеазы, расщепляется (в комплексе с геликазой UvrD) другой клеточной сериновой АТР-зависимой протеазой ClpXP. К тому же белки RecA и LexA также являются членами SOS-регулона. В результате после SOS-индукции в бактериальной клетке довольно быстро восстанавливается уровень белков SOS-peгулона, характерный для необработанных клеток.
Интенсивность SOS-ответа клетки зависит от степени повреждения ДНК, так как только большое количество однонитевой ДНК позволяет активироваться RecA белку в количестве, достаточном для открытия SOS-регулона. Эта зависимость представлена на рис. 20 (Ланцов, 1999). Так как белок RecA связывается c LexA в том же сайте, в котором происходит его связывание с двунитевой ДНК, то при запуске SOS-ответа белок RecA не активирует процесс гомологической рекомбинации. В норме при гомологичной рекомбинации SOS-ответ также выражен слабо.
Каким же образом RecA* делает выбор между запуском SOS-ответа и инициацией гомологичной рекомбинации? Вероятно, все зависит от ситуации в клетке: быстрая диссоциация белка SSB от онДНК, то есть быстрое формирование комплекса белка RecA с онДНК приведет к SOS-ответу, который индуцирует также и синтез ряда рекомбинационных ферментов. Медленное формирование тройного комплекса завершается только гомологичной рекомбинацией со слабой SOS-индукцией. Скорость сборки комплекса зависит и от рекомбиногенной активности самого белка RecA.
На рис. 20 ясно видно, каким образом выраженность SOS-ответа зависит от количества повреждений ДНК.