Случайная рекомбинация

Сайт-специфическая рекомбинация

Этот тип рекомбинации связан с обменом между специфическими последовательностями и характерен для прокариот и дрожжей. Сайт-специфическая рекомбинация обычно происходит при интеграции фаговых геномов в бактериальную хромосому. В результате рекомбинации обмениваются специфические последовательности фаговой и бактериальной ДНК, обнаруживающие короткие – 100–150 нуклеотидных пар – участки гомологии. Ферменты, вовлеченные в это событие, действуют только на особую пару последовательностей-мишеней. Сайт-специфическая рекомбинация была открыта в результате исследований механизма перемещения бактериофага λ по хромосоме E.coli. В интегрированном состоянии вирус внедрен в бактериальную хромосому и реплицируется как часть ДНК клетки-хозяина. Когда вирус проникает в клетку, на матрице вирусного гена синтезируется фермент λ-интеграза. Этот фермент и катализирует сайт-специфическую рекомбинацию. Процесс начинается с того, что молекулы интегразы плотно связываются со специфическими последовательностями на кольцевой хромосоме фага. Затем получившийся ДНК-белковый комплекс связывается со сходными, но не идентичными последовательностями на бактериальной хромосоме, сближая таким образом бактериальную и фаговую хромосомы. Затем интеграза делает надрезы в молекулах ДНК, формируя маленький участок сочленения гетеродуплекса. Интеграза напоминает ДНК-топоизомеразу в том отношении, что она формирует ковалентную связь с ДНК в тех же местах, где и разрывает ДНК. У бактерий топоизомераза I и гираза являются ключевыми ферментами, определяющими степень суперскрученности ДНК при ее ответе на стрессовые внешние воздействия – такие как повышение температуры, изменении рН и оксидативный стресс. Топоизомераза I катализирует две основные реакции – разрезание и воссоединение однонитевой нормально спаренной ДНК для релаксации ее суперскрученности при репликации или транскрипции. Множество эндогенных факторов действуют на эти две реакции разобщающее и приводят к образованию и накоплению ТорI-разрешающего комплекса, который является переходным к образованию двунитевыфх разрывов ДНК со всеми вытекающими последствиями.

Тот же самый механизм сайт-специфической рекомбинации приходит в действие, только в обратном направлении, когда фаг λ вырезается из сайта интеграции.

Рекомбинация между негомологичными последовательностями нуклеотидов происходит в клетках прокариот и дрожжей достаточно редко, а в клетках млекопитающих – довольно часто. К негомологичной рекомбинации можно отнести процесс случайного встраивания вирусной или плазмидной ДНК в ДНК клеток животных.

Многие мобильные последовательности ДНК, включая вирусы и транспозоны, кодируют интегразы (другое название – транспозазы), которые позволяют их ДНК встраиваться в хромосомы с помощью механизма, отличающегося от сайт-специфической рекомбинации, которую использует бактериофаг λ. Так же, как и λ-интеграза, эти ферменты опознают специфические последовательности ДНК в соответствующем мобильном элементе, встриивание или вырезание которого они катализируют. В отличие от интегразы фага λ, эти интегразы/транспозазы не требуют специфических последовательностей ДНК в хромосоме-мишени и не формируют сочленения гетеродуплекса. Вместо этого они образуют надрезы с обоих концов линейной последовательности мобильного элемента, а затем катализируют взаимодействие этих концов ДНК с ДНК-мишенью, разрывая в ней фосфодиэфирные связи. Так как это разрезание происходит в разных нитях не прямо друг напротив друга, а с «зазором» в несколько нуклеотидов, то в результате в рекомбинантной молекуле ДНК образуются две короткие однонитчатые бреши, по одной на каждом конце мобильного элемента. На завершающем этапе процесса рекомбинации эти бреши застраиваются ДНК-полимеразой. Таким образом в ДНК клетки-хозяина образуются короткие дуплицированные прямые повторы, прилежащее к месту инсерции мобильного элемента. Такие фланкирующие прямые повторы являются отличительной чертой случайной, или транспозиционной рекомбинации. Мы еще вернемся к процессу негомологической рекомбинации при описании негомологического воссоединения двунитевых разрывов ДНК. Там же будет и приведен соответствующий рисунок.