Эксцизионная репарация неспаренных оснований (mismatch repair, MMR)

Продолжая изучать эксцизионную репарацию ДНК, остановимся на репарации неспаренных оснований (mismatch repair, MMR. На русский название этого типа репарации часто переводят как коррекция неспаренных оснований, сокращенно КНО. Основная роль MMR состоит в поддержании стабильности генома и снижении количества потенциально возникающих мутаций.

Довольно часто (у Е. coli один раз на 104пар нуклеотидов, у эукариот еще чаще) во время репликации ДНК происходят ошибки спаривания, в результате которых вместо комплементарной пары нуклеотидов А + Т или G + C в дочернюю цепь ДНК оказываются включенными нуклеотиды, некомплементарные нуклеотидам в материнской нити и образующие с ними неправильные пары. Такие пары называют мисмэтчами – mismatch. Как уже говорилось ранее, исправление подобных ошибок самими полимеразами или автономными экзонуклеазами не может убрать их все, и в ДНК по окончании репликации остаются мисмэтчи. Но неспаренные основания в ДНК могут возникать и в результате других событий. Например, при модификации оснований ДНК или их предшественников продуктами клеточного метаболизма или экзогенными повреждающими агентами, если эти поврежденные основания не были отрепарированы системой BER. Особенности процесса рекомбинации мы будем обсуждать позже, но неспаренные основания могут возникать и при рекомбинационной интеграции однонитевого участка ДНК в неабсолютно идентичную ДНК партнера по рекомбинации. Все эти события приведут к образованию гетеродуплексной ДНК – субстрата для ферментов, исправляющих мисмэтчи.

Хотя процесс MMR получил свое название от неспаренных оснований, но его основными мишенями являются не только такие пары, как G/T, G/G, A/C и C/C, но и О6-меG, спаренный с С или Т, межнитевая сшивка СpG, вызванная действием цисплатина, индуцированные УФ-светом фотопродукты, пуриновые аддукты бензопирена, производные аминофлуорена и 8-оксигуанин. К настоящему времени стало понятно, что система MMR способна распознавать и корректировать не только неправильно спаренные основания, но и протяженные вставки и делеции (по крайней мере, у эукариот).

У E.coli принято различать 2 системы MMR: с длинным ресинтезируемым участком (LPMR, long patch mismatch repair) и очень коротким участком репаративного синтеза (VSPMR, very short patch mismatch repair). У высших эукариот и человека есть только LPMR, и именно этот процесс обычно называют эксцизионной репарацией неспаренных оснований. Процесс LPMR у Е. coli был реконструирован in vitro.

Ясно, что неправильное спаривание (ошибка репликации) может затронуть только дочернюю нить ДНК, матричная в процессе репликации остается неизменной. Если в матричной нити появилось повреждение, которое не было исправлено с помощью репарации и привело к замене основания, то это и есть мутация, и она будет воспроизводиться при репликации во всех последующих поколениях. Следовательно, система репарации мисмэтчей должна оперировать на дочерней нити и производить замену некомплементарных оснований только в ней. То есть одним из основных моментов, важных для данной системы репарации, является необходимость различения матричной и вновь синтезированной нитей. Клетки прокариот при этом используют важное различие в структуре матричной и дочерней нитей, найденное в 70-х годах. Вскоре после окончания репликации специальные ферменты – метилазы присоединяют мстильные группы к аденинам в последовательностях GATC. Поэтому во время следующего раунда репликации нити ДНК оказываются различимыми: материнская нить ДНК несет метилированные аденины, а в дочерней нити до окончания репликации аденины еще не метилированы. Их метилирование начнется только по окончании репликации. Таким образом, существует определенный временной промежуток, в течение которого вновь синтезированная нить в отличие от матричной остается недометилированной. Именно на этом явлении и основана система дискриминации матричной и дочерней нитей у Е. сoli. Пока это различие в метилировании сохраняется, клетки должны успеть отрепарировать мисмэтчи. Эта особенность MMR у Е. coli подчеркивает главную биологическую функцию системы – точность воспроизведения ДНК при репликации. С меньшей вероятностью MMR у E.coli способна узнавать и неметилированные или, наоборот, метилированные в обеих нитях последовательности GATC, производя ненаправленную коррекцию гетеродуплексной ДНК.

Процесс MMR схематично отображен на рис. 9 и включает в себя следующую цепь реакций. Двойная спираль ДНК была только что отреплицирована; матричная цепь несет уже метилированные основания, в то время как дочерняя нить еще неметилирована. Район мисмэтча, то есть гетеродуплексная ДНК, распознается гомодимерным белком МutS, который присоединяется к нему. Это соединение белка МutS с ДНК стабилизируется за счет присоединения белков МutH и МutL с образованием репаративного комплекса, на осуществление этой реакции тратится одна молекула АТФ.

В свободном состоянии белок МutH является слабой эндонуклеазой, но при соединении с белками МutS и МutL его эндонуклеазная активность возрастает на 2 порядка. Данный репарационный комплекс способен изгибать молекулу ДНК и как бы «протягивать» ее сквозь себя до того момента, когда белок МutH распознает ближайший, локализованный с любой стороны от мисмэтча полуметилированный GATC и осуществит его эндонуклеазную атаку. Белки МutH разрезают в ходе описываемого процесса репарации только неметилированные сайты GATC, чем и достигается направленность коррекции. Таким образом, вновь синтезированная ДНК будет надрезана двумя белками МutH с двух сторон от мисмэтча. Длинный участок ДНК, расположенный между этими двумя надрезами и несущий «неправильное» основание, должен быть отсоединен от молекулы ДНК, в результате чего возникает длинная однонитевая брешь. Матричная цепь ДНК остается целостной и служит матрицей для восстановления правильной последовательности в образовавшейся бреши. Эксцизия сегмента онДНК в месте разрыва требуюет участия белка MutU – ДНК-геликазы II (продукта гена mutU/uvrD/uvrE/recL – часто один и тот же ген бывает описан различными группами исследователей под разными названиями) и одной из ДНК-экзонуклеаз: ЕхоI (З'-экзо), ExoVIII (З'– или 5'-экзо) или Rec J (5'-экзо). Выбор экзонуклеазы зависит от направления деградации в сторону неспаренного основания.

При расплетании двунитевой ДНК геликазой MutU также расходуются несколько молекул АТФ. Репаративный синтез удаленного участка ДНК длиной до нескольких тысяч оснований, осуществляется PolIII с использованием дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (dNTP) при обязательном участи белка SSB, защищающего онДНК от эндонуклеазной атаки и препятствующего возникновению в ней вторичных структур. Соединение оставшихся после завершения репликации однонитевых разрывов производит ДНК лигаза. В результате всей цепи реакций участок мисмэтча заменяется правильной (комплементарной) парой.

Такова коррекционная система MutHLSU у грамотрицательных бактерий Е. coli. Подобная, хотя и неидентичная, система НехАВ описана у грамположительных бактерий Streptococcus рneumonia. Их гены hexA и hexB являются гомологами генов mutS и mutL соответственно. Однако ни аналога гена mutH, ни дискриминации нити, определяемой метилированием ДНК, в системе НехАВ не выявлено. Остается предположить, что эта система способна отличать вновь синтезированную нить ДНК от матричной каким-либо иным образом, например по «недолигированным» разрывам и концам ДНК, на которых и инициируется эксцизия сегмента с неправильным основанием. Ресинтезируемый участок в этом случае также очень велик и включает до 5 т. н.

Рисунок 9. Процесс MMR у Escherihia coli.

Система LPMR у Е. coli не обладает строгой специфичностью. Она опознает и корректирует все неспаренные основания (хотя транзиции репарируются более эффективно, чем трансверсии) за исключением одного – С-С. В отличие от LPMR система VSPMR у Е. coli строго специфична. Она репарирует только неправильные пары G-T, появление Т в которых обусловлено дезаминированием 5-меС, продукта модификации цитозинов с помощью метилазы Dmc. Как и в системе LPMR, неправильные основания узнают белки MutS и MutL, которые стимулируют расщепление ДНК с 5'-конца от Т специфической эндонуклеазой Vsr. Эксцизия и последующий синтез ДНК требуют присутствия Poll и ДНК-лигазы.

Основными биологическими функциями системы MMR у прокариот являются антимутационная, которая способствует точному воспроизведению генома при репликации и поддержанию его исходной структуры и антирекомбинационная, способствующая репродуктивной изоляции вида. Рекомбинация у бактерий во всех случаях сопряжена с образованием гетеродуплексов, и если система MMR ведет коррекцию пострекомбинационных гетеродуплексов по обеим нитям ДНК одновременно, то она разрушает продукты рекомбинации на стадии эксцизии однонитевого фрагмента ДНК и делает невозможной гомологичную рекомбинацию даже между таксономически близкими видами бактерий. Отдельно можно выделить и гипорекомбинационную функцию, так как коррекция длинных гетеродуплексов снижает частоту рекомбинационных обменов на единицу длины ДНК, приводя гибридную по составу ДНК к составу ДНК одного из партнеров.

У эукариот генетические и биохимические данные свидетельствуют о наличии системы, гомологичной LPMR, а системы VSPMR как таковой нет, ее замещают соответствующие гликозилазы. Но система MMR у эукариот работает несколько иначе, чем мы описывали у Е. coli.

5.2.1. Функциональные гены-гомологи у про– и эукариот

Поиск гомологичных генов привел к выявлению по меньшей мере двойного набора гомологов генов mutS и mutL у S. cerevisiae и человека, что легло в основу предположения о гетеродимерной структуре гомологов белков MutS и MutL у эукариот. Эти гомологи представлены в табл. 3. Распознавание мисмэтчей или модифицированных оснований у эукариот осуществляется комплексом MutSα, который связывается с повреждением. Он состоит из белков-гомолгов MutS E.coli MSH2 и MSH6 (также описанный под названием GT-связывающий белок – GTBP). Для эффективного связывания необходимо фосфорилирование комплекса MutSα. Особенностью комплекса MutSα у S. cerevisiae (MSH2 + MSH6) является его асимметрия – наличие главной и дополнительной составляющих. Действительно, мутации msh6 в отличие от msh2 показывают как слабый мутаторный фенотип, так и слабое подавление репарации инсерционно-делеционного типа. Это не исключает возможности существования комплексов белка MSH2 с другими составляющими. Именно такая ситуация имеет место в клетках человека, которые содержат два MutS-подобных комплекса, hMutSa (hMSH2 + hMSH6) и hMutSβ (hMSH2 + hMSH3), причем с разным спектром опознаваемых повреждений. Разные комплексы имеют разные мишени для связывания – MutSα способен связаться как с неправильно спаренными основаниями, так и с инсерциями/делециями, приводящими к неправильному спариванию и выпетливанию ДНК. MutSβ же способен связаться только с инсерционно-делеционными мисмэтчами и особо эффективен в случае петель, включающих 2–3 основания.

Несколько другая схема MMR у эукариот показана на рис. 10. До сих пор недостаточно ясно, как именно MMR у эукариот различает матричную и дочернюю нити. Предполагается, что в дочерней нити остаются недолигированные однонитевые разрывы (бреши), образовавшиеся во время репликации. На рис. 10А показано, что дискриминация нити происходит именно с использованием этих недолигированных брешей; всегда в течение какого-то времени сохраняющихся в новосинтезированной нити. Проблема в том, что такой разрыв и мисмэтч могут отстоять друг от друга на большое расстояние. Как же тогда MutSα может одновременно их распознать?

Тут нужно остановиться на роли АТФ в процессе MMR. Оба белка (MSH2 и MHS6) содержат АТФАДФ-связывающие сайты. Мутации в этих сайтах приводят к нарушению процесса MMR, но не влияют на GT-связывание. Пространственная модель этого связывания представлена на рис. 10Б. В настоящее время существуют две модели, объясняющие роль АТФАДФ в MMR. В модели «молекулярного переключения» (molecular switch model), которая базируется на реакциях АТФАДФ связывании и гидролиза АТФ, предполагается, что MutSα/АДФ комплекс отвечает за распознавание и связывание с мисмэтчем («активное состояние»). Связывание с мисмэтчем запускает реакцию АДФ→АТФ и стимулирует собственную АТФ-азную активность MutSα, приводящую к его конформационным изменениям, с образованием независимого от гидролиза АТФ «скользящего зажима». Этот «скользящий зажим» пассивно диффундирует от мисмэтча и подает сигнал на диссоциацию белков MMR от ДНК («неактивное состояние»). В этой модели гидролиз АТФ на MutSα вызывает конформационные изменения и таким образом способствует связыванию MutLα. К тому же диссоциация MutSα от ДНК зависит от связывания АТФ, но не от его гидролиза.

Рисунок 10. Процесс MMR у эукариот. А – схема последовательности реакций, Б – связывание гетеродимера MutSα с ДНК.

В другой модели, называемой «гидролиз-зависимой моделью перемещения» (hydrolysis-driven translocation model) MutSα использует энергию гидролиза АТФ для того, чтобы перемещаться вдоль ДНК от сайта распознавания мисмэтча к сайту, ответственному за сигнал о нитеспецифичности (чаще всего, однонитевому разрыву). Соединение с MutLα-комплексом происходит именно в этом сигнальном сайте.

Гетеродимер образуется и в структуре MutL-подобных комплексов эукарнот: MLHl + PMSl – у дрожжей и MLHl + PMS2 – у человека. У человека выявлен еще и третий гомолог– ген hPMSl. Таким образом после связывания с мисмэтчем MutSα ассоциируется с комплексом MutLα, состоящим из гомологов гена Е. сoli MutL – MLH1 и PMS2. Эксцизию ДНК, содержащей неправильно спарившееся основание осуществляет экзонуклеаза I, а новый синтез – ДНК-полимераза-δ. Вероятно, у высших эукариот в этой системе репарации принимает участие и белок PCNA, так как у MSH2 и MLH1 есть специфические сайты, связывания с ним.

Является ли процесс MMR индуцибельным, до сих пор не ясно. Промотор гена, кодирующего MSH2, имеет сайт связывания с белком Р53 и его индукция была показана при котрансфекции Р53 и онкогенов fos/jun. Обработка клеток алкилирующими агентами, например метил-нитро-нитроз-гуанидином (MNNG) приводит к повышению мисмэтч связывающей активности комплекса MSH2/MSH6 и его перемещению внутри ядра. Вероятно, регуляция активности MMR происходит как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях.

Таким образом мы видим, что картина репарационных событий в системе MMR у эукариот подобна той, которая была выявлена у прокариот. При этом функции MutS– и MutL-подобных гетеродимсрпых комплексов аналогичны описанным для системы MutHSLU бактерий. Но по количеству структурных и регуляторных элементов она, безусловно, является более сложной. Биологические функции системы MMR у эукариот, безусловно, шире, чем у прокариот. Эта система является барьером для внутрихромосомных рекомбинационных перестроек, возможных из-за существования в геноме высших эукариот множественных повторов (в клетках млекопитающих внутрихромосомная рекомбинация значительно более чувствительна к совершенству гомологии взаимодействующих участков ДНК, чем межхромосомная).

Таблица 3. Функциональные гены-гомологи системы MMR у про– и эукариот

К тому же существует множество данных о том, что белки MSH2, MSH6 и MLH1 принимают непосредственное участие в других репарационных процессах – эксцизионной репарации нуклеотидов, спаренной с транскрипцией, репарации двунитевых разрывов и генерации и передаче сигнала о повреждении ДНК (об этом мы будем подробнее говорить при изучении репарации двунитевых разрывов).

Как видно из табл. 3, гомологов белка MutH у эукариот не обнаружено. Это связано с принципиально иным типом различения родительской и вновь синтезированной нитей ДНК.

Сравнительное изучение системы MMR у человека имеет большое медико-биологическое значение. Это подтверждается наличием таких наследственных заболеваний человека, как семейная форма неполипозного рака прямой кишки (HNPCC).

Неполипозный рак толстого кишечника (ННРТК, HNPCC – human non polyposis colon cancer), который составляет, по разным оценкам, от 5 % до 15 % всех регистрируемых случаев колоректального рака, сопряжены, главным образом, с повреждениями трех генов – hMLHI (49 %), hMSH2.(45 %) и hPMS2 (6 %). К настоящему времени выявлено до 40 мутаций в каждом из первых двух генов и небольшое число мутаций в других генах, включая hPMS2 и hPMSI. Складывается также и генетическая картина перехода от предрасположенности к развитию заболевания в результате инактивации обоих аллелей одного из этих генов системы MMR.

В то же время среди спорадических раковых опухолей различной локализации от 10 % до 30 % имеют нестабильную структуру микросателлитной ДНК, так называемый фенотип RER+ (replication error). Эта нестабильность возникает в результате неисправленной ошибки репликации, что автоматически подразумевает существование дефекта в системе MMR. Результаты исследований клеточных линий, происходящих из раковых клеток с фенотипом RER+, показывают, что они несут мутации в генах hMSH2, hMLHI, hPMS2 и GTPB.

Что касается VSPMR, то у эукариот тоже выявлена система специализированного исправления G-T на G: C, но она не сопряжена с MutS– или MutL-noдобными белками. Вероятно, в этом случае используется специализированная гликозилаза, удаляющей Т из пары G-T (то есть функции этого пути MMR E.coli. у высших эукариот берет на себя BER).