Бактериофаги

Впервые просветление взвеси палочек сибирской язвы наблюдал Н.Ф. Гамалея (1898), а пассируемый агент, который растворял шигеллы, выделил канадский ученый-бактериолог Ф.Д. Эррель (1916) и назвал его бактериофагом.

Морфология бактериофага. Хорошо описанной является морфология типичных Т-фагов 2 и Т4. Типичная фаговая частица состоит из «головки», «хвоста», «отростков». Их головка состоит из нуклеиновой кислоты, окруженной белковой оболочкой - капсидом. Она упакована по типу икосаэдральной симметрии. Геном фага состоит из ДНК двухцепочечной и белковый капсид головки состоит из идентичных субъединиц.

Хвост фагов данного типа является наиболее сложного строения. Состоит из полого стержня - шириной 6-10 нм, сократительной стенки - шириной 15-20 нм и терминальной базальной пластинки гексагональной формы. Хвост фага имеет в длину 100 нм. Сократительная стенка (чехол) прикрепляется к воротничку фага, окружающему стержень рядом с головкой. Сократительный чехол состоит из белков, способных к сокращению. Базальная мембрана имеет 6 шипов и 6 отростков (фибрилл). У фагов этого типа отростки загнуты вниз. Очень важно наличие в шипах и нижней части хвостового отростка фермента лизоцима.

Известны фаги, с иной морфологией, например, не имеющие хвостового отростка, описаны фаги без сократительного чехла (Т1 и Т5), фаги без базальной мембраны, нитевидные фаги (фаг fd), с коротким хвостовым отростком (фаги Т3, Т7) и др.

Химический состав. По химическому составу фаги относительно однородны, содержат только белки и один из типов нуклеиновой кислоты. Большинство известных фагов - ДНК-содержащие, хотя описаны и РНК-содержащие. Нуклеиновая кислота составляет до 50 % их сухой массы. Белки головки, сократительного чехла и хвостика различаются между собой.

Существует необычный фаг РМ2, выделенный из морской псвдомонады - вирион, которой окружен липопротеиновой оболочкой и содержит 2 фермента: эндонуклеазу, переводящую ДНК фага в линейную форму, и ДНК-полимеразу.

Репродукция фага. Процесс проникновение фагов в бактерии достаточно специфичное явление - определенные фаги инфицируют только чувствительные к ним клетки бактерий.

Адсорбция. Клеточная стенка бактерий достаточно сложна и различно устроена. Задача адсорбции решается с помощью различных по специфичности рецепторов, присущих разным типам фагов, специфичных к определенным эпитопам, расположенным на поверхности бактерий. Рецепторы для фагов Т3,Т4,Т7 - это липополисахаридный слой, для

Т2 и Т6 фагов - это белковый слой. Очищенные стенки клеток, содержащие эти химические элементы, также активно адсорбируют фаг, как клетка. Бактерии без клеточной стенки фаги не адсорбируют. С помощью хвостового отростка фаги могут распознавать рецепторы клетки и прикрепляются к ним, но эта фаза еще обратима до раскрытия фибрилл и их прикрепления к поверхности клетки. Скорость адсорбции фага пропорциональна его концентрации или бактерий. В условии оптимального соотношения бактерий и фагов, каждая встреча фага с клеткой приводит к адсорбции. При избытке фагов на бактериальную клетку могут присоединится до 300 фаговых частиц. Адсорбция фагов приводит к глубоким изменениям в клеточной мембране.

Перенос фаговой ДНК в клетку. Фаговая частица, прикрепившись к поверхности микроорганизма, выделяет лизоцим, который лизирует клеточную стенку в месте встречи этих клеток - на участке поверхности под базальной пластинкой. В это время в чехле фага освобождаются ионы Са и активируют АТФазу.

В свою очередь этот фермент активирует сократительные белки в чехле. При их сокращении происходит погружение внутреннего полого стержня через плазматическую мембрану внутрь бактериальной клетки.

По этому полому стержню, за счет сокращения белков чехла, фаговая ДНК быстро вводится внутрь клетки. Эту часть процесса называют «впрыскиванием ДНК» в клетку. Белковые частицы, преобладающие в оболочке фага, остаются на клеточной мембране. Нитевидные фаги могут проникают в клетки целиком. Минорные белки проникают в цитоплазму клеток с ДНК фага.

Внутриклеточное размножение фага. После проникновения ДНК фага в цитоплазму бактерий, она не обнаруживается в лизатах клеток несколько минут - это эклипс-период (скрытый). Далее начинается синтез нескольких новых ранних белков: ферменты, ДНК-полимераза и киназы. Затем появляются поздние белки: субъединицы фаговой головки и хвостовой части, лизоцим. Синтезируются несколько сотен новых фаговых хромосом. С образованием ДНК - циркулярной с помощью лигазы, заканчивается ранний процесс, начинается репликация.

Белковые субъединицы головки и хвоста фага самопроизвольно аггрегируются. Затем образуются: полный капсид, хвостовая часть и фибриллы. Это происходит под генетическим контролем, а их соединение - головки с хвостом, а затем с фибриллами - без участия генов.

Созревание состоит в необратимом объединении новой фаговой нуклеиновой кислоты и белковой оболочки. Зрелая частица - это морфологически типичный вирион, обладающий инфекционностью, но который не может реплицироваться в клетке, в которой образовался.

Синтез фага идет до дезинтеграции клетки, после которой освобождаются дочерние вирусы, имеющие инфекционность. Из одного фага в клетке может синтезироваться до 200-300 дочерних вирионов. После размягчения клеточной стенки лизоцимом, разрушается вся клетка. Инфицирование бактерий нитевидными фагами и их выход происходят без гибели клетки.

Для фагов, содержащих РНК, проникновение их в клетку сопровождается соединением с рибосомами и трансляции новых белков, среди которых будет и РНК- полимераза. Затем образуется двухцепочечная промежуточная РНК, в которой плюс-цепь соединена с минус-нитью водородной связью. Последняя используется в качестве матрицы для синтеза новых плюс-цепей. Одноцепочечная РНК складывается в двухцепочечную, путем спаривания пар оснований.

Редукция фага. Часть фагов, инфицирующих бактерии, теряют способность лизировать клетку, но при этом могут репродуцироваться синхронно с размножением клетки. Подобные фаги претерпевают определенные изменения и их называют умереннымифагами.

Вирусная ДНК включается в геном клетки, при этом бактериальная клетка приобретает новый набор генов. Вирусная ДНК не вызывает синтез новых вирусных белков. Включение в хозяйскую хромосому происходит с помощью сайт-специфической рекомбинации. Такое явление известно каклизогения,а популяцию таких бактерий называют лизогенной. Если фаги синхронно размножаются вместе с хозяйской ДНК, что наблюдается несколько генераций, то такие латентные фаги называют профагами.

Состояние ДНК у профагов разных типов фагов различно. При механизме, описанном для Т-фагов, вирусная ДНК, встроенная в клеточную хромосому, имеет 1:50 ее длинны. Для фагов Р1 профаг не интегрирует с хромосомой клетки, при этом, не образуются фаговые белки.

Лизогенная система (профаг и лизогенная клетка) получает новые дополнительные свойства. Лизогенные бактерии становятся невосприимчивыми к новым атакам фагов того типа, который уже включен в клетку как профаг. При смешивании нелизогенных бактерий с умеренным фагом многие бактериальные клетки лизируются, а часть лизогенируется. Такие фаги индуцируют синтез репрессора, подавляющего размножение вегетативного фага. Этот процесс блокирует выход профага из лизогенной клетки.

Иногда профаг переходит в вегетативный и зрелый фаг, что приводит к лизису клеток. Для индукции профага необходима инактивация или деструкция репрессора в клетке.

Если фаг размножается в лактозоотрицательных бактериях, то, примерно, одна бактерия на 1 млн инфицированных клеток становится лактозоположительной. Приобретение нового свойства наследственно устойчиво. Это явление ничто иное как трансдукция, т.е. перенос части генома от одних бактерий лизогенным фагом другим бактериям. Иногда клетка может стать токсигенной в результате лизогенизации. У сальмонелл после лизогении появляются новые поверхностные антигены. Приобретение микробом новых свойств, путем лизогении фагом называется фаговой конверсией, она отличается от трансдукции тем, что эти гены, контролирующие новые свойства, находятся в геноме фага.

Многие виды микроорганизмов содержат два энзима, обладающих комплементарными свойствами. Один фермент модифицирует все ДНК путем метилирования оснований, а другой расщепляет все ДНК, которые не подверглись метилированию. Процесс называется рестрикцией. Конкретная рестриктаза узнает участок на ДНК и расщепляет в этом месте нуклеиновую кислоту. Рестрикция - это механизм защиты клетки против инвазии чужой ДНК. Некоторые фаги (Т2 и Т3) индуцируют синтез ранних белков, которые ингибируют действие рестриктаз (эндонуклеаз). В других случаях фаги кодируют синтез ферментов, модифицирующих их ДНК (гликолизирование), ингибируя действие эндонуклеаз.

Использование бактериофагов в медицинской практике. Известно, что препараты фагов применяют для идентификации выделенных бактерий, для обнаружения микроорганизмов на объектах внешней среды. Таким образом, определяют фаговар бактерий.

С терапевтическими и профилактическими целями фаги используют для лечения или предупреждения сальмонеллезов, шигеллезов, стафилококковых и др. инфекций.

Глава 7. Генетика прокариотов

Генетическим материалом бактерий является нуклеойд. У части бактерий обнаружены внехромосомные молекулы ДНК, которые представлены мигрирующими генетическими элементами (плазмиды, Is-элементы, транспозоны).