Ошибки при определении групп крови по системе АВО
II. Перекрестный метод определения группы крови - одновременное распознавание агглютиногенов в эритроцитах исследуемой крови с помощью стандартных сывороток и выявление агглютининов, содержащихся в сыворотке этой крови с помощью стандартных эритроцитов. Для определения группы крови используются моноклональные антитела, для получения которых используется гибридомная биотехнология. Гибридома- это клеточный гибрид, образованный путем слияния клетки опухоли костного мозга (миеломы) с иммунным лимфоцитом, синтезирующим специфические моноклональные антитела. Гибридом а приобретает свойства обоих родителей и способность к неограниченному росту, характерную для опухолевой клетки и возможность синтезировать антитела, присущие иммунному лимфоциту. Цоликлоны анти-А и анти-В, или моноклональные антитела, применяют для определения агглютиногенов эритроцитов.
Методика определения групп крови
Определение групп крови системы АВО стандартными изогемагглютинирующими сыворотками.
Стандартные сыворотки системы АВО двух различных серий каждой группы наносят на пластинку под соответствующими обозначениями таким образом, чтобы получилось два ряда по три большие капли (0,1 мл) в следующем порядке слева направо: Оab (I), Аb (II), Вa(III). Исследуемую кровь наносят по одной маленькой капле (0,01 мл) рядом с каждой каплей сыворотки и перемешивают кровь с сывороткой.
Наблюдение за ходом реакции проводят при легком покачивании пластинки в течении 5 минут при комнатной температуре. По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через 3 минуты, в капли, в которых наступила агглютинация эритроцитов, добавляют по одной капле (0,05мл) изотонического раствора хлорида натрия и продолжают наблюдение до истечения 5 минут.
Оценка результата. Реакция в каждой капле может быть положительной (наличие агглютинации эритроцитов) и отрицательной (отсутствие агглютинации).
Различные сочетания положительных и отрицательных результатов дают возможность судить о групповой принадлежности исследуемой крови (см. табл.).
| Результат реакции с изогемагглютинирующими сыворотками группы: | ||||
| Оab(I) | Аb(II) | Вa(III) | АВО (IV) | Это указывает, что эритроциты не содержат: |
| - | - | - | + | О(I) |
| + | - | + | - | А(II) |
| + | + | - | - | В(III) |
| + | + | + | - | АВ(IV) |
·Оценка результатов определения групп крови при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток. Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации, знаком минус (-) - ее отсутствие.
Как видно из таблицы, результат оценивается в зависимости от реакции со стандартными сыворотками группы Оab(I), Аb(II), Вa(III). В тех случаях, когда положительный результат получен с сывороткой всех трех групп, для исключения неспецифической агглютинации производится контрольное исследование со стандартной сывороткой группы АВО (IV), не содержащей групповых агглютининов.
Ошибки при определении группы крови делятся на 3 группы:
1. Низкое качество реагентов (срок годности сыворотки и т.д.).
2. Технические ошибки: а) несоблюдение внешних условий (плохая освещенность, изменение температуры окружающей среды на 15-20 град., б) нарушение расположения сывороток, в) недобавление физ. раствора - псевдоагглютинация.
3. Особенности исследуемой крови - неспецифическая панагглютинация ®агглютинация со всеми эритроцитами и со своими собственными антиген А2-слабый.
Техника определения групповой принадлежности крови хорошо разработана и описана в учебных пособиях. Однако правила, используемые при этом, основаны на опыте ошибок. Известны два типа ошибок в технике определения и оценке результатов: во-первых, когда считают, что агглютинации не произошло, а она имеется или должна появиться; во-вторых, когда предполагают, что агглютинация произошла, а она фактически отсутствует.
Причинами первого типа ошибок могут быть: а) малая активность (титр) сыворотки или агглютинабельность эритроцитов (группа А2 ). Возможность этой ошибки исключается, если пользоваться только активными, проверенными сыворотками (титр не менее 1:32) и наблюдать за реакцией не менее 5 минут;
б) слишком большая капля крови при добавлении к стандартной сыворотке приводит к разведению агглютининов и снижению их титра. Избежать ошибки возможно при соблюдении соотношения капли крови и стандартной сыворотки 1:10;в) при окружающей температуре выше + 25 (жаркая погода) агглютинация может не возникнуть и реакция должна производится на охлажденной тарелке.
Вторая ошибка,т.е. учет агглютинации как положительной при фактическом ее отсутствии может произойти:
а) при склеивании эритроцитов в "монетные столбики", не отличимые простым взглядом от агглютинатов. Добавление капли0,85% раствора хлорида натрия, как правило, разрушает "монетные столбики", но не влияет на истинные агглютинаты;
б) когда испытуемые эритроциты дают феномен ауто-или панагглютинации (агглютинация) в сыворотке любых эритроцитов, даже собственных, или агглютинация эритроцитов в любой сыворотке, даже групп АВ(IV). Это явление наблюдается у больных с циррозами печени, лейкозом и др. Во избежание этой ошибки, определение групп крови необходимо производить при температуре не ниже +15 град С и обязательно использовать стандартные сыворотки АВ(IV) группы при появлении на стекле агглютинации во всех группахсыворотки. Агглютинация и в сыворотке АВ(IV) группы свидетельствует об ауто-или панагглютинации. Явления пан-и аутоагглютинации исчезают при температуре 37 град С и вновь появляются при охлаждении;
в) при пользовании бактериально загрязненной стандартной сывороткой, дающей неспецифическую агглютинацию (феномен Томсена). Эта ошибка не возникает, если не пользоваться помутневшей или подсыхающей, неправильно хранившейся сывороткой (не в холодильнике, без укупорки);
г) оседание эритроцитов на дно в кучки при отсутствии покачивания тарелки, подсыхании капли и длительном (более 5 минут) наблюдении.
Оба типа ошибок возможны при механической спутанности сывороток на штативе и палочек для размешивания капель. Они исключаются непременным пользованием не менее, чем 2 сериями стандартных сывороток. В сомнительных случаях при нечетких результатах прибегают к повторному определению группы крови другими сериями стандартных сывороток, а при необходимости к перекрестному способупо стандартным сывороткам и стандартным эритроцитам;
д) агглютинация, обусловленная наличием в сыворотке антител другой групповой системой, таковыми могут быть антитела анти-М, анти-Ц, анти-Л;
е) Выпадение фибрина наблюдается при исследовании свежей крови (цельной) и делает невозможным учет результатов. Связано это с избытком хлорида кальция в тестовых реактивах, приготовленных из плазмы крови путем дефибринирования ее указанными препаратами, необходимо тестовые реактивы приготовлять из нативной плазмы;
ж) кровяные химеры - так называют одновременное пребывание в кровяном русле двух популяций эритроцитов, отличающихся по группе крови и другим антигенам. Различают истинные и трансфузионные кровяные химеры, которые возникают в результате многократного переливания универсальной крови гр. О(I) реципиентам с гр. крови А(II) и В(III), или они носят транзисторный характер - после прекоащения трансфузии они исчезают. Истинные химерывстречаются у гетерозиготных близнецов, у которых в период внутриутробного развития возможен обмен родоначальными кроветворными клетками.