Перспективи одержання продуцентів етанолу, пива, вина. Генетика і генетична інженерія дріжджів.
Головний продуцент спирту - Sacch. cerevisiae.
Переваги використання дріжджів:
-достатньо велика кількість субстратів
- культивування в умовно стерильних ферментерах
- гарний об’єкт для генетичної інженерії
Недоліки дріжджів:
- конкуренція в процесі бродіння та дихання
- чутливість до підвищених концентрацій етанолу
- відсутність ферментів, що каналізують розщеплення крохмалю, целюлози та ксилози
Тому при виробництві пива є стадії виробництва сусла. При виробництві етанолу – стадії оцукрювання крохмалю з використанням препаратів амілаз.
Щоб усунути ці недоліки:
1). Проведення процесу в анаеробних умовах
2). Попередній гідроліз субстратів до моно- та дицукрів
3). Використання традиційної селекції для обрання найкращих продуцентів
Для того щоб підвищити ще в декілька разів потрібно використовувати генно-інженерні методи.
Генетичний апарат дріжджів
Sacch. cerevisiae . Генетичний апарат складається з 16 хромосом.
Всього геном – 14 млн нуклеотидних пар.
Містить в основному унікальні послідовності і до 5 % повторювані.
Наявна мітохондріальна ДНК (кільцеві молекули розміром 25 мкм, 20-70 копій).
В геномі дріжджів наявні транспозони (4-20 копій). Деякі штами транспозонів не містять. А в лабораторіях отримані варіанти, що містять 35 копій транспозонів.
5,3 т.н.п. – розмір транспозонів.
ЛК_10 (1.11)
Плазміди дріжджів (3 групи):
I – мітохондріальні
II - двомікронні криптичні плазміди
III - трьохмікронні (невідома функція)
II і III – використовують в якості векторів після додавання цільових генів і селективних маркерів.
Двомікронна плазміда (Scp1): в дріжджовій клітині – одна і дуже рідко до 50-ти копій; містить два інвертовані повтори довжиною до 600 н.п. і 2 унікальні області.
Трьохмікронна плазміда – здатна до автономної реплікації.
Мітохондріальна (24мкм): може бути до 40-ка копій.
Методи підвищення продуктивності дріжджів
1. Селекція та ступінчастий добір – розсів на ПС і відбір клонів. Мутагенез – для отримання нових продуктів.
Селекцію здійснюють і з використанням різних середовищ з різним складом, що впливає на регуляцію експресії необхідних ферментів. Якщо дріжджі посіяти на середовище з фосфатами, то індукується синтез кислої фосфатази за рахунок позитивної регуляції на продукт.
2. Гібридизація – схрещування різних рас дріжджів, що мають різні необхідні властивості з отриманням гібриду, що може мати властивості цих двох рас. Негативні фактори: випадковість і невелика ефективність.
Схрещування Sacch. cerevisiae штаму, що використовується для пивоваріння з низькопродуктивним штамом, але здатним до зброджування рафінози. Отримують диплоїдні гібриди, що зброджують рафінозу на 70% від вмісту ПС.
3. Методи генетичного конструювання. Як об'єкт для ген. інж. дріжджі мають ряд переваг:
- відбувається процесінг білків (глікозилювання)
- відсутність екзопротеаз дріжджів
Трансформація дріжджів.
Використовують системи:
1 – протопласт – у суміші з поліетиленгліколем (ПЕГ) і ДНК (плазмідна). Дріжджова клітина обробляється глюкоїнідазою або екстрактом шлункового соку виноградного равлика. Клітинна стінка руйнується. Додається ПЕГ, плазміди і відбувається трансформація. В рідкому середовищі клітинна стінка не регенерується. Отримані протопласти змішують з агаризованим середовищем, виливається в чашки Петрі, де клітини відновлюються. Для адсорбції екзогенної ДНК необхідно ПЕГ та катіони Са. Частота трансформації 10-7 на протопласт. Отримані протопласти стабільні, маркер не втрачається. Недолік: утворення не тільки диплоїдів, а й поліплоїдів; складність маніпуляції в товщині агару. Процес триває 3 години.
2 – клітини обробляють розчинами солей лужних металів (К, Li, Na, Ru). Клітини стають здатними до поглинання екзо-ДНК без руйнування клітинної стінки. Наявність ПЕГ як індуктора, обов'язкова. Тривалість 2 години.
3 – за допомогою електропорації, коли клітинна стінка обробляється струмом, що сприяє проникненню екзо-ДНК. Тривалість – 10хв. Клітинна стінка не руйнується.
4 – ДНК-гармата – вольфрамові, платинові або золоті (діаметр -0,5-0,65 мкм, швидкість – 500м/с) кульки. Можна одночасно адсорбувати 2 різні плазміди.
Векторні системи для дріжджів
Існує 5 типів дріжджових векторів: :
1 – YIp – вектори дезінтеграції – бактеріальні плазміди з включеними в них дріжджовими генами. Вони автономно не реплікуються і є інтегрованими (вбудовуються в хромосоми дріжджів). Як бактеріальні плазміди використовують pBR322 або ряд човникових плазмід (які реплікуються в дріжджах і в E.coli). До плазмід додається дріжджовий маркер. Іноді до таких векторів додають дріжджову послідовність початку реплікації, що надає плазмідам здатність до автономної реплікації і підвищення частоти реплікації. Але такі плазміди при культивуванні в неселективних умовах часто втрачаються. Можуть бути стабілізовані додаванням дріжджових центрамерних ділянок. Тоді такі плазміди називаються мініхромосомою (С-тип). Замість декількох копій в клітині залишається 1 плазміда, але вона розподіляється між дочірніми клітинами при мітозі і мейозі і зберігається при цьому. Вектори інтеграції можуть бути кільцевими і лінійними. Лінійні отримують розрізаними рестриктазами кільцевих плазмід, та додаванням до їх кінців дріжджових теломерних ділянок.
2 – клонуючі YEp – багатокопійні вектрні плазміди на основі плазміди Scp1. В неї вбудовують реплікони з E.coli або Sacch. cerevisiae та селективні послідовності (стійкість до антибіотиків, до токсичних сполук тощо). Наявні в дріжджовій клітині як в позахромосомному, так і в інтегрованому стані, тобто є епісомами. Вони човникові оскільки здатні до реплікації в дріжджах і в E.coli.
Також до клонуючих векторів належать:
3 – YRp – плазміди, створюють шляхом трансформації протопластів Sacch. cerevisiae гібридною плазмідою. Ця плазміда містила в собі ген TRP1 (триптофану) + pBR322. При трансформації протопластів був збільшений рівень трансформації. Це обумовлено тим, що ділянка гену TRP1 містила так звану ARS-послідовність, що кодує область початку реплікації дріжджової хромосоми і сприяє автономній реплікації даної плазміди. Ці плазміди в дріжджових клітинах містяться тільки в позахромосомному стані. Іноді їх називають реплікаторні вектори.
4 – стабільні, молекулярні вектори YCp. Це плазміди, що містять центромерні ділянки хромосом. Мають невелику копійність, але високу стабільність і не втрачаються.
5 – лінійні молекулярні вектори YLp – штучні дріжджові хромосоми, що містять послідовності необхідних генів і теломерні ділянки. Їх отримують найчастіше з плазміди YRp.
Найчастіше використовують YEp вектори. В них вбудовоують сильні промотори, застосовують конститутивні гліколітичні ферментні гени (GAL1 – ген бета-галактозидаза, який знаходиться під катаболітною репресією глюкози).
Приклади використання ген. інж. для дріжджів
1 – комплементація з мутантними генами E.coli. Гени дріжджів при цьому вбудовуються у вектор фагу "лямбда" або pBR322 і клонується в E.coli. При цьому трансформант набуває здатності до росту на певних середовищах. Особливість: в якості об'єкту трансформації використовують мутантні клітини E.coli з мутаціями в регуляторних ділянках, що призводить до збільшення продуктивності.
2 – комплементація з мутантними генами Sacch. cerevisiae. Використовують в якості реципієнту ауксотрофних температурочутливих або радіочутливих мутантів Sacch. cerevisiae. Трансформація клітин дріжджів здійснюється як дріжджовими генами, так і генами інших еукаріот (тварин).
3 – метод прогулянки хромосомою. Фрагмент хромосоми з будь-яким раніше клонованим геном використовують як вихідний, тобто за його допомогою відбирають з банку дріжджових ДНК фрагменти, що частково перекриваються з ним. Визначають ці фрагменти. Вони в свою чергу використовуються для відбору з банку наступних фрагментів, що вже перекриваються з іншими. Здійснюється пошук необхідних генів та визначення їх функції.
ЛК_11 (8.11)
4. Гомологія з клонованими генами інших еукаріотів. В генотипах еукаріотів частина ДНК послідовності дуже схожа з послідовністю ДНК дріжджів. Вважається що це пов'язано з законами еволюції і ці послідовнсоті є одними з найдавніших в геномах. Тому такі послідовності можна використовувати для створення плазмідних конструкцій, які можна вбудовувати в дріжджі і вони будуть мітити гени інших еукаріотів. Крім того цей метод застосувується для наукових досліджень - встановлює функції даного гену та особливості експресії і впливу на фенотип.
5. Посилення експресії гену при клонуванні у мультикопійних плазмідах.
Тобто плазміди містять ген дикого типу без змін і створюються умови. В тому числі обираються плазміди такого типу, щоб було не менше 30 копій в клітині. Трансформовані клони дріжджів інкубують в середовищі, що містить інгібітор в певній концентрації. При цьому клітини, що мають невелику кількість копій плазмід – гинуть, а виживають клітини з великою кількістю плазмід. Їх відбирають і використовують в якості продуцента, але постійно перевіряють.
6. Застосування евікції.
Це спосіб клонування мутантних алелей з метою встановлення отриманої мутації та механізму її утворення. Для цього з дріжджової клітини, що є вже трансформованою, виділяють хромосому (плазміду), обробляють певною рестриктазою, таким чином, щоб лише був один сайт розрізання. При цьому отримують або лінійну плазміду, або плазміду з прилеглою хромосомною ділянкою (якщо плазміда була інтегрованою). Потім проводять лігування і отриманими послідовностями трансформують бактерії і вже в бактеріях шукають або досліджують мутантні алелі.
Практичне використання (приклади)
1. При виробництві пива утворюється надлишок β-глюканів з ячменю, що ускладнює очищення пива. Це виправили використанням штаму S. cerevisiae , що був трансформований YEp-плазмідою, що містила кДНК — β-глюканази та послідовність сигнального пептиду під контролем промотора PGK1. PGK1 – промотор гену 3-фосфогліцераткінази дріжджів. Ці дріжджі продукують ендо- β-глюканазу, що практично повністю утилізує β-глюкани.
2. В S. cerevisiae введено багатокопійну плазміду з геном глюкоамілази виділеним з грибів р. Rhyzopus aбо з S. distaticus. Отримані трансформанти змогли здійснювати розщеплення до дицукрів і моноцукрів без додаткових стадій оцукрювання. Ці штами використовуються у виробництві етанолу з крохмалевмісної сировини.
Значення ГІ в утилізації та переробці відходів
Б/т методи, що застосовуються для утилізації відходів:
1) біодеградація;
2) біоконверсія.
Біодеградація – це розкладання токсичних речовин за допомогою мікроорганізмів найчастіше або ферментів. Біодеградацію застосовують для очищення ґрунтів, ґрунтових і поверхневих вод, а також різних відходів - токсичні відходи (ксенобіотики), наприклад синтетичні хімічні речовини: пестициди, гербіциди, холодоагенти, розчинники, вуглеводні нафти та нафтопродукти.
Основною групою м/о, що здатна до руйнування ксенобіотиків, є Pseudomonas. Біохімічні дослідження показують, що штами Pseudomonas здатні розщеплювати більше 100 ксенобіотиків. При чому один штам часто може розщеплювати декілька сполук, які хімічно споріднені - дикі штами Pseudomonas. Гени, що кодують ферменти здатні до розщеплення, можуть мати як хромосомну локалізацію, так і плазмідну. Плазміди з цими генами мають від 50 до 200 т.н.п. (великі розміри плазміди) і невелику копійність.
Плазміда SAL містить гени для деградації cолідатів – 60 т.п.н.
Плазміда TOL – для деградації толуолу – 113 т.п.н.
pJP1 – 2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота - 85 т.п.н.
CAM – для деградації камфори - 225 т.п.н.
NAH – для деградації нафталіну - 69 т.п.н.
XYL-K – ксилол і толуол – 135 т.п.н.
Гени, що містяться в цих плазмідах позначаються тими ж самими буквами.
Для деградації ксенобіотиків в більшості випадків необхідно декілька ферментів, які поступово перетворюють токсичну сполуку в нетоксичну. Наприклад, ароматичні сполуки без галогенів, як правило перетворюються на катехол або протокатехол, які потім в результаті декількох реакцій окислювального розщеплювання перетворюються на ацетил-КоА і сукцинат або піруват і ацетальдегід. Якщо ароматичні сполуки містять галогени, крім катехолу утворюються гідрохінони та їх галогенпохідні, тому необхідні додаткові етапи дегалогенування, для чого використовують внесення в бактерію плазміди з ферментами диоксигеназами, які заміняють галоген на гідроксильну групу. Дегалогенування може відбуватись на перших етапах деградації, а може – на останніх. Чим більше атомів галогену, тим повільніше відбувається деградація вцілому. Сполуки нетоксичні тільки тоді, коли не містять галогени вцілому.
Основні недоліки диких штамів м/о (Pseudomonas)
1. Жоден штам не може руйнувати велику кількість ксенобіотиків (1 або декілька схожих за хімічною структурою сполук).
2. Ряд органічних сполук у високій концентрації пригнічує життєдіяльність м/о.
3. Велика кількість джерел ксенобіотиків містить складну суміш токсичних сполук і тому м/о може інактивуватися або взагалі втрачати життєдіяльність під дією інших нецільових компонентів.
4. Невисока швидкість біодеградації.
5. Неполярні ксенобіотики добре адсорбуються в ґрунті і стають менш доступними.
Генно-інженерні методи для вирішення цих проблем
Використання плазмід.
В плазміду вбудовують різні гени для розширення спектру сполук, який даний м/о зможе руйнувати. Або використовують різні плазміди, кожна з яких містить ферменти для руйнування однієї сполуки, які поєднують в одному штамі.
В 1970 році створено перший штам Pseudomonas , що розщеплював більшість вуглеводнів нафти. Цей штам містив ряд плазмід, а саме плазміди CAM, XYL-K, NAH. Спочатку шляхом кон´югації плазміду К перенесли в штам, що несе плазміду OCT (деградує октан). Ці 2 плазміди несумісні (не можуть існувати у вигляді окремих плазмід в одній клітині), але вдалося провести рекомбінацію отриманих плазмід з 2 функціями. Схожим шляхом отримали плазміду, що мала гени деградації нафталіну і ксилолу. Отримані 2 плазміди об´єднують в одному штамі. Одержаний штам, здатний до руйнування 4х різних сполук, у великих масштабах не використовується, хоча спрямований на очищення октану від нафти.
Крім розширення спектру дії (сполуки) існує ще мезофільна здатність Pseudomonas : +20 – +40ºС. У відкритих водоймищах температура 0 - +20 ºС. Необхідно одержати штам, здатний до деградації при пониженій температурі. В психрофільний штам Pseudomonas putida (нездатний до деградації ксенобіотику) було внесено TOL і підібрано штам Pseudomonas putida, що утилізує саліцилати при 0ºС. В результаті одержують штам здатний руйнувати 2 сполуки при 0 ºС за умови наявності додаткових джерел вуглецю.
ЛК_12 (15.11)
Метод зміни генів. При цьому проводиться модифікація генів найчастіше розташованих у плазміді.
Було обрано плазміду pwwo що відповідає за розклад толуолу і ксилолу за це відповідає 12 генів. Xyl-оперон що контролює експресію являє собою промотор
. Xyl-оперон: Рm(промотор) xyz-послідовність генів що відповідає за синтез ферментів необхідних для послідовного розщеплення толуолу та ксилолу . Активність транскрипції цього гену знаходиться під позитивним контролем практично всіх метаболітів що утворюються на шляху розкладання ксилолу або толуолу. При цьому бактерії що несуть цю плазміну здатні розщеплювати 4-етилбензоат, проміжний продукт розщеплення не до кате холу а до 4-етил кате холу ця сполука ініктивує один з основних ферментів даного метаболітичного шляху а сам кате хол ін активує 2.3 дезоксигеназу, тому генно інж. Дослідження спрямовані на –по перше запобіганню інактивації цього ферменту і на індукування транскрипції генів цього ксил-оперону у випадку коли єдиним субстратом є 4-етилбензоат а не толуол або ксилол.
Шляхи вирішення цього такі.
Було обрано іншу плазміну в неї вбудовано ген стійкості до ампіциліну та тетрацикліну отримано ще 1 плазміду з геном стійкості до канаміцину і геном Xyl. Цими двома плазмідами трансформовано E.coli . Відібрали позитивні трансформанти з обома плазмідами одночасно, використав. Стійкі до ампіциліну і канаміцину. Додатково обробляють мутагеном ( етил метан сульфонал) і провели культивування на середовищі з тетрацикліном і 4-етил бензоатом. Клітини що виросли містять Xyl. Ген і регуляторний білок який дає можливість використовувати 4-етилбензоат як єдиний субстрат. Для запобігання інактивації кате хол 2.3-дезоксигенази було обрано мутантний ген xylS. Його вбудовано в плазміду що несе ген стійкості до канаміцину .Сконструйовану плазміду ввели в культуру Pseudomonas putida, що вже містить плазміду pwwo після чого провели відбір за стійкістю до канаміцину і отримані клітини містили рекомбінантну плазміду завдяки чому штами здатні до синтезу модифікованої кате хол 2.3 –дезоксигенази, що не інгібується етилбензоатом.
Ще один варіант зміни генів є використання інших більш сильних промоторів або модифікації наявного промотора.
Отримання штамів Pseudomonas putida що здатні руйнувати 3-хлоретилен накопичений у воді та грунті., що частково може під дією ґрунтових бактерій перетворюватися на вініл хлорид- є канцерогеном. Для руйнування 3-хлоретилену необхідні всі ті ж самі ферменти що і для розщеплення толуолу та ксилолу або 2-й шлях руйнування, коли необхідний ген толуол дезоксигенази під контолем tac-промотору
todC1,-todC2,todC3,todC4-це 4 ферменти що необхідні для перетворення толуолу або 3-хлоретилену в флавопротеїн що є нетоксичним. Цю конструкцію експресували в E.coli .
tac-промотор-активується ізопропіл β-D-тіогалактопіранозидом внаслідок чого відбувається послідовне в 4 етапи розкладання 4-хлоретилену . Швидкість деградації 3-хлоретилену зо доп. E.coli з такою плазмі дою нижча але плазміни зберігаються набагато довше ніж в Pseudomonas putida.
Схожі конструкції створюються для отримання штамів Pseudomonas putida здатних до руйнування біфенілу . Основний фермент біфініл дезоксигеназа,що складається з 2-х субодиниць . Шлях деградації біфенілу склад. З поступової деградації біфінілдезоксигеназою ферезоксином і ферезоксиредуктазою. Оскільки біфінілдезоксигеназа за структурою і функціями схожа на толуолдезоксигеназу то було замінено ген що кодує велику субодиницю біфінілдиоксигенази . Отримано штам що має вищу ефективність руйнування біфінілу здатний до деградації 3-хлоретилену та здатний рости на більшій кількості субстратів.
Утилізація крохмалю та цукрів
Крохмалвміщ. І цукровміщуючі середовища використ. для виробництва етанолу і фруктози. Основний ферменти гідролізу крохмалю α-амілаза ,глюкоамілаза та глюкоізомераза –їх у вигляд. ферм. препаратів викорст. у промисловості . Витрати на ці ферменти 30 % витрат на будь-які ФП взагалі . Виробництво фруктози і етанолу починається з подрібнення зерна або інш. сировини. При цьому найбільш дорогими є наступн етапи на яких використ. ФП
Подрібнену сировину обробляють паром отрим. желеподібний продукт, що охолоджують обробляють α-амілазою , далі оброб. глюкоамілазою отримують оцукрюваний продукт –суміш моно та дицукрів . Якщо на цю суміш подіяли глюкоізомеразою то отрим. фруктозу , якщо використ. дріжджі то етанол .
Основні напрямки підвищення ефективності цих процесів
1. використовувати в якості продуцентів ФП швидкоростучих штамів здатних до утилізації широкого спектру субстратів не дорогих.
2. отримувати α-амілазу з більшою активністю , що дозволило б провести етап зрідження при нижчих температурах +80,90 С, а не більше 100. Це прискор процес і зменш. Час охолодження .
3. Можна модифікувати гени α-амілази і глюкоамілази так щоб отрим. ферм. мали однакові оптимуми рН і температури, що дозволить етапи зрідження та оцукрювання проводити одночасно.
4. знайти або створити ферменти, що ефективно розщеплюють крохмал без попередньої обробки паром .
5. створити м/о що були б здатні до синтезу глюкоамілази. Тобто отрим. дріжджі , що будуть вироб. етанол з розрідженого продукту або з крохмалю.
ЛК_13 (22.11)
Способи оптимізації
1. Виділення гену α-амілази з різних мікроорганізмів, напр. Вacillus amyloliquefaciens, Вacillus stearothermophilus – термофільні м/о, амілази яких діють в інших температурних оптимумах. Ген α-амілази є ядерним, а не плазмідним. Ядерну ДНК з бактерій виділяли обробленням рестриктазою і вбудовували в плазміду pHB110. Маркером в цій плазміді є ген стійкості до канаміцину. Плазміди вносили в Вacillus subtilis. Проводили культивування позитивні трансформанти відбирали на середовищі з канаміцином. А потім відбирали трансформанти здатні до гідролізу крохмалю, відбір здійснювався на середовищі з крохмалем. Після інкубування обробляли розчином йоду: клони, що містили необхідний α-амілази, відбирали за відсутністю синього забарвлення. Такий метод має практичне застосування. Ген, який був відібраний з м/о, додатково модифікували будуванням в інший м/о.
2. Глюкоамілаза. Видалення етапу оцукрювання у виробництві етанолу.
З Aspergillus awamori виділено кДНК глюкоамілази і вбудовували в плазміди S. cerevisiae. Промотор та регуляторна послідовність цієї плазміди були використані з S. cerevisiae.
Плазміду вносили в звичайний штам S. cerevisiae. Отриманий трансформант може перетворювати крохмаль на етанол. Недоліком отриманого штаму була висока чутливість до етанолу, низька експресія глюкоамілази, необхідність постійного відбору клонів з необхідною плазмідою, яка втрачається без відбору. Недоліки вдалося усунути: підвищували експресію гену глюкоамілази видаленням з плазміди послідовності, що відповідає за негативну регуляцію промотора ENO1 (фермент енолаза дріжджова).
Це дозволило підвищити ефективність експресії глюкоамілази більше ніж в 10 раз. Вбудовували послідовність ДНК гетерологічну ділянці дріжджової хромосоми, що перетворило плазміду на інтегрований вектор (має здатність вбудовуватись в дріжджову хромосому). Це призвело до зникнення необхідності відбору.
3. В якості клітини-хазяїна був обраний штам S. cerevisiae стійкий до етанолу (результат промисловий штам).
Іноді в плазміду вбудовують декілька копій генів глюкоамілази з Aspergillus niger, але встановили, що підвищення ефективності більше залежить від місця куди ген вбудований, ніж від кількості копій.
Окремим питанням є використання замість Sacch.cerevisiae Г-негативних бактерій Zimomonas mobilis. Позитивною якістю бактерії є більша швидкість зброджування. Негативні якості: невелика кількість субстратів, які може використовувати бактерія; природна стійкість до поширених антибіотиків, що заважає використовувати в експериментах стандартні маркерні гени стійкості; проблеми підтримки клонуючих векторів широкого кола господарів.
Незважаючи на це, в Z. mobilis вже було вбудовано гени, що дозволяють розширити спектр субстратів (глюкозоізомеразу, ксилулокіназу – для утилізації ксилози; ферменти, необхідні для гідролізу лактози, целюлози, целобіози, крохмалю). Основним недоліком отримання продуценту було те, що вони не могли рости на субстраті з єдиним джерелом вуглецю, необхідні були додаткові компоненти.
Процес силосування
Традиційний метод підвищення ефективності силосування – це додавання препаратів, що містять лактобактерії. Але для нормального розвитку лактобацил необхідно, щоб у субстраті була невелика кількість водорозчинних вуглеводів, а основною сировиною є рослинна (целюлоза, геміцелюлоза, пектин). В основний діючий м/о (Lactobacillus plantarum) було введено ген альфа-амілази, виділений з несилосного штаму L. amilovorus. Отриманий штам з більшою ефективністю силосував рослинну сировину, що містила крохмаль.
Вбудовування різних целюлаз.
Отримання фруктози
Основні ферменти при виробництві фруктоз є глюкоізомерази . Основні реакції цього ферменту це перетворення ксилоз в ксилулозу а необхідна при виробництві реакція перетворення Д-глюкози в Д-фруктозу є побічною при цьому пр наявності хоть невеликої кількості ксилози ізомеризація глюкози у фруктозу не відбувається. Чим більша температура тим більша ступінь ізомеризації глюкози і фруктози. Оптимальна- 160 С тому для збільшення виходу фруктози необхідно підвищити температурний оптимум а з іншого підвищити термостабільність глюкозоізомерази
Наприклад термофільна бактерія Thermus thermophilus.Ген глюкоізомерази був виділений і вбудований в E. Coli I B. Brevis. При цьому використ. різні промотори вбудовані в різні сайти та відібрали штам В. Brevis з продуктивністю цього ферменту більшою в 100 разів ніж у Thermus thermophilus. Можна підвищ активність збільшуючи субстратну специфічність .
Використовують сайт специфічного мутагенезу гену отриманого з Clostridium thermosulfurogenes де було замінено триптофан 139 на фенілаланін, або валін 186 на треонін або одночасно 2 заміни – каталітична активність відносно ксилози знизилазь в 4-5 р. і підвищ. Відносно глюкози в 6 р.