Білкова інженерія

Використання методів генетичної інженерії в створенні ферментних препаратів

Для отримання продуцентів використовують:

- селекція

- мутагенез

- генетично-інженерні методи

Генна інженерія. Три напрямки:

- збільшення копійності генів

- використання сильних промоторів

- модифікація білків

Збільшення копійності генів – це використання багатоколійних плазмід, які вводять в продуцент.

Модифікація білків:

1). Модифіковані ферменти отримують сайт-спрямованим мутагенезом вихідних генів, тобто заміна однієї або декількох амінокислот на рівні генів.

Для цього in vitro хімічно синтезують необхідну ДНК-послідовність і цю послідовність вбудовують в необхідний ядерний геном продуценту або в плазміду, яку вносять в продуцент.

Приклади:

- якщо в молекулі фосфоліпази замінити аспарагін на аспарагінову кислоту та глутамін на лізин, то підвищується специфічна активність даного ферменту.

- заміна однієї амінокислоти тирозину тРНК-синтази в Bacillus збільшила спорідненість цього ферменту до АТФ в 100 разів.

- заміна амінокислоти на інші, що призводить до збільшення термостабільності, до граничних значень рН, це досягається змінами третинної структури, яка обумовлена сульфгідридними зв’язками ( цистеїн або додається, або забирається).

2). Модифікація ферменту також здійснюється за допомогою вбудовування або виключення субстрат зв’язуючого домену ферменту (замінюється послідовність амінокислот). Приклад: в результаті введення в молекули глікозилтрансферази, целюлозозв’язуючого домену, фермент набуває здатності зшивати розриви молекул в аморфних ділянках целюлози.

3). Конструювання гібридних молекул полягає в створенні гена, що складається з ділянок, що кодують функціональні домени двох близьких або різних білків. В результаті розширюється субстратна специфічність, або 2 біохімічні ланцюга поєднуються в один.

Конструювання таких гібридних молекул здійснюють за допомогою:

- трансдукція

- класична трансформація

- кон’югація

- метод злиття протопластів

Продуцент – E. coli

Продукуються ферменти як бактеріальні, так і грибні.

Також використовують бактерії: Bacillus subtilis, гриби: Asp.niger, Thrihoderma.

Отримані продукти (рекомбінантні ферменти) мають більшу чистоту; легше виділяються та очищуються; мають кращі фізико-хімічні властивості; вищу активність.

Білкова інженерія – комплекс методичних заходів, які дозволяють реконструювати молекулу білку, шляхом спрямованого введення певних мутацій в структурний ген. Тобто заміна амінокислот в білку.

Білкова інженерія вирішує завдання:

1). Зміна структурних властивостей білку (підвищення стабільності в органічних розчинниках, підвищення термостабільності, модифікація специфічності зв’язування лігандів, зміна внутрішньо молекулярної динаміки білку).

2). Зміна специфічності ферментів та їх каталітичних характеристик (зміна рН оптимуму, зменшення константи Міхаеліса-Менте, підвищення швидкості каталізу, видалення сайту інгібіювання).

3). Створення нових білкових систем (химерні та мультифункціональні білки, введення фрагментів для полегшення очищення білків).

4). Підвищення ефективності білків як терапевтичних макромолекул для застосування у фармакології і медицині.

Головні напрямки білкової інженерії:

1. Структурно-функціональний аналіз білків методами сайт-специфічного мутагенезу.

2. Випадковий мутагенез, з наступною селекцією білків з певними функціями (молекулярна еволюція).

3. Створення штучних білків de novo.

4. Створення химерних та мультифункціональних білків.

Сайт-специфічних аналіз та сайт-специфічний мутагенез

- спочатку визначають точну нуклеотидну послідовність тієї ділянки ДНК, яка відповідає мРНК, що потребує зміни

- далі визначають які саме зміни необхідно провести

- проведення змін

Принципова схема введення мутації в структурний сайт білку

1). Ген відповідного білку виділяють або синтезують і вбудовують в одноланцюгову ДНК ага М13 або відповідну плазміну.

2). Синтезують олігонуклеотидний фрагмент цього гену, в якому змінений кодон для однієї амінокислоти, яку потрібно замінити. Такий олігонуклеотид називається мутатор, складає 12-20 нуклеотидів.

3). Олігонуклеотид – мутатор поєднують з фагом М13 (або плазмідою). При цьому відбувається часткове з’єднання комплементарних ДНК, в середовище додається ДНК-полімераза та ДНК-лігаза, які добудовують ДНК з утворенням гетеродуплексу, що містить початкову ДНК та мутантну ДНК.

4). E. coli трансформують таким гетеродуплексом і отримують клони, що несуть як нормальні так і мутантні гени білку.

5). Відбирають клони мутантів використовуючи гібридизацію міченого радіоактивного фосфору олігонуклеотиду-мутатора з ДНК мутанта.

Частота мутації – від 1 до 50%.

Цим методом крім точкових замін можна проводити делеції, вставки, інверсії, злиття генів.

Цими ж методами можна проаналізувати функції білку; проаналізувати механізм каталітичної активності (замінити одну амінокислоту і подивитись чи буде білок виконувати свої функції).

Білкова інженерія крім генно-інженерних методів також застосовує рентгеноструктурний аналіз, ЯМР-спектроскопію, біосенсор.

Об’єкти білкової інженерії:

- E. coli

- Sacch. cerevisiae

Білкова інженерія займається ферментами, цитокінами, антитілами, клітинними рецепторами, імуномодуляторами та протипухлинними білками, білками здатними нейтралізувати певні сполуки та м/о, створення нових варіантів біосенсорів.