Экспрессия генов.

Биосинтез белка.

Принцип комплементарного спаривания азотистых оснований нуклеотидов лежит в основе реализации генетической информации в процессе биосинтеза белка.

Главные условия для биосинтеза белка похожи на условия репликации ДНК.

1. Наличие исходной матрицы – участка молекулы ДНК- гена. Ген имеет строго определенную последовательность нуклеотидов, а значит определяет точную последовательность аминокислот в полипептидной цепочке собираемого белка.

2. Наличие строительного материала. Строительным сырьем для РНК являются отдельные рибонуклеотиды с азотистыми основаниями: аденин, гуанин, цитозин, урацил.

3. Наличие энергии АТФ.

4. Наличие ферментов (например, РНК-полимеразы).

5. Наличие места для синтеза. Местом первого этапа биосинтеза белка является ядро эукариотической клетки или цитоплазма (прокариоты), а второй этап протекает на рибосомах гранулярной эндоплазматической сети.

Как известно, в ДНК содержится определенная генетическая информация:

- о структуре всех белков и РНК организма,

- о порядке реализации этой информации в разных клетках в процессе онтогенеза (индивидуального развития) и при различных функциональных состояниях.

Поскольку во всех соматических клетках организма один и тот же набор из 46 хромосом, то, несмотря на подчас сильные отличия между клетками, все они содержат в своих ДНК одну и ту же генетическую информацию. (Некоторое исключение составляют лимфоциты, в процессе формирования которых происходит перестройка генов иммуноглобулинов - антител.)

Данное обстоятельство - генетическая эквивалентность ядер всех соматических клеток организма послужило основанием для клонирования животных. В процессе репликации ДНК генетическая информация воспроизводится целиком, чтобы затем передаваться дочерним клеткам.

Но, кроме того, эта информация экспрессируется (реализуется) в клетке, обуславливая все проявления ее жизнедеятельности. Однако экспрессии подвергается отнюдь не вся имеющаяся в ядре генетическая информация, а лишь какая-то (обычно весьма небольшая) ее часть.

Этим-то и обусловлены особенности тех или иных клеток тем, каков спектр (набор) функционирующих генов и каковы при этом уровни их активности.

Экспрессия информации о структуре определенного белка включает 4 этапа: транскрипция, процессинг, трансляция и фолдинг.

Первый этап — транскрипция: образование в клеточном ядре на соответствующем гене (локализующемся в одной из хромосом) специального посредника — матричной РНК (м-РНК). Дословно "транскрипция" переводится, как "переписывание".

Последовательность событий транскрипции:

- Расхождение нитей двойной спирали ДНК, как испорченной застежки – молнии. При этом "старые" водородные связи между комплементарно спаренными азотистыми основаниями параллельных цепочек разрываются и цепочки отходят друг от друга. Формируется «репликационный глазок» - ДНК разрываются не с конца молекулы, а с любого участка.

- Свободные рибонуклеотиды комплементарно спариваются с освободившимися на ДНК азотистыми основаниями нуклеотидов "новыми" водородными связями.

- Фермент РНК-полимераза сшивает рибонуклеотиды ("наживленные" водородными связями) в цепочку м-РНК прочными ковалентными связями.

- Новая и-РНК отходит от участка ДНК, а цепочки ДНК восстанавливают "старые" водородные связи.

Смысл этого процесса — переписывание информации о структуре белка с огромного неподвижного носителя (ДНК в составе хромосомы) на небольшой подвижный носитель - м-РНК. Примерно так же обстоит дело, когда с жесткого диска компьютера, содержащего тысячи файлов, переписывают один из них на флешку. С той лишь разницей, что м-РНК в процессе записи информации образуется из новых нуклеотидов. Следовательно, м-РНК, считанные с разных генов, должны отличаться друг от друга — как отличаются друг от друга сами гены. Другое важное обстоятельство: непосредственный продукт транскрипции гена правильней называть предшественником м-РНК (пре-м-РНК). Дело в том, что новообразованная м-РНК проходит, тут же (в ядре) созревание.

Рисунок 1. Транскрипция, процессинг и трансляция.

Второй этап биосинтеза белка - процессинг. При этом пре-м-РНК претерпевает существенную модификацию. В результате процессинга из и-РНК вырезаются "технологические" участки нуклеотидов, не содержащие информацию о строении синтезируемого белка (интроны). Относительно недавно установлено, что эти «обрезки» являются важными участниками регуляции работы клетки (микро-РНК). Далее происходит сшивание (сплайсинг), оставшихся после вырезания участков и-РНК, содержащих информацию о синтезируемом белке (экзоны) и формирование зрелой м-РНК. И лишь после того зрелая м-РНК (видимо, в комплексе со специальными белками) поступает из ядра в цитоплазму.

Тре6тий этап — трансляция: процесс сборки молекул белка из аминокислот на рибосомах по программе, диктуемой м-РНК. Суть этой программы - определение очередности, в которой аминокислоты должны включаться в строящуюся пептидную цепь. Трансляция -. это перевод информации с "языка" нуклеиновых кислот на "язык" белков.

Причем в процессе участвуют не свободные, а активированные аминокислоты: каждая из них связана с транспортной РНК (т-РНК), т. е. находится в виде аминоацил-т РНК (аа-т РНК). Для каждой из 20 аминокислот имеется своя специфическая форма т-РНК, а чаще — даже не одна, а несколько форм.

Рибосомы же играют в трансляции роль молекулярных машин, обеспечивающих правильное взаимодействие участников. В состав рибосомы входят четыре молекулы т. н. рибосомной РНК (р-РНК) — по одной молекуле каждого из 4-х видов р-РНК. Объединяясь с рибосомными белками, они образуют две субъединицы рибосомы и выполняют в них структурную, а также, возможно, каталитическую функции.

Последовательность событий трансляции:

- К рибосомам с помощью т-РНК транспортируются аминокислоты, фиксированные на "черешке клеверного листа" т-РНК.

- Антикодоны т-РНК комплементарно взаимодействуют с триплетными кодонами и-РНК и образуют водородные связи.

- В начале процесса трансляции с активным центром рибосомы связывается инициирующая часть и-РНК. У эукариот инициирующий кодон всех и-РНК всегда кодирует аминокислоту метионин (стартовый кодон АУГ).

- Две соседние молекулы т-РНК, связавшиеся на рибосоме с и-РНК приобретают возможность для образования пептидной связи между аминокислотами, фиксированными на их "черешках".

- После образования пептидной связи первая т-РНК, "отпускает" свою аминокислоту, а сама разрывает водородные связи и уходит с рибосомы в цитоплазму на "охоту" за новой аминокислотой. Вторая т-РНК (с двумя аминокислотами), спаренная с и-РНК, смещается на место первой в рибосоме.

- Следующая т-РНК с третьей аминокислотой образует комплементарные водородные связи с третьим кодоном и-РНК, создавая условия для пептидной связи между второй и третьей аминокислотой. Процесс повторяется и полипептидная цепочка растет.

- Рост полипептидной цепочки продолжается до терминирующего стоп-кодона и-РНК, после которого новый белок покидает рибосому, но он еще н приобрел законченной трехмерной пространственной конформации.

Молекула и-РНК связывается сразу с несколькими рибосомами, формируя полирибосому. Это позволяет синтезировать одновременно несколько одинаковых молекул белка.

Таким образом, в трансляции участвуют РНК трех классов — м-РНК, т-РНК и р-РНК.

Четвертый этап в образовании работоспособных белков называетсяфолдинг. После окончания трансляции новый белок обычно не функционирует. Он должен приобрести рабочую (третичную или четвертичную) структуру. Этот процесс называется фолдинг(рис. 2).

Рисунок 2. Схема фолдинга.

Вместе с тем оказалось, что добавление в среду некоторых белковых фракций клетки значительно облегчает рефолдинг (восстановление активности) денатурированных белков. Отсюда возникло представление о вспомогательных белках (или факторах) фолдинга.

Затем было обнаружено, что данные факторы можно разделить на две группы.

Первая группа - это белки с каталитической активностью, т.е. ферменты фолдинга, или фолдазы. Как и прочие ферменты, они требуются лишь в каталитических количествах, т. е. в концентрациях, на порядки меньших, чем у «обслуживаемых» ими белков.

Вторая группа - т. н. молекулярные шапероны. Полагают, что сюда входят белки с самыми разными механизмами действия. Например, шапероны могут обеспечить белку удобное место для безопасного сворачивания в третичную структуру – «котел с крышкой». Шапероны они требуются в количествах, близких к стехиометрическим, т. е. сравнимых по величине с концентрацией сворачиваемых белков. Они, как и фолдазы, не входят в состав конечных продуктов фолдинга, какими бы сложными олигомерными образованиями эти продукты ни были.

Показательно в связи с этим исходное значение слова «шаперон» в английском языке: это пожилая дама, сопровождающая молодую девушку на балах. Аналогично и молекулярные шапероны: способствуя правильному фолдингу, они как бы впервые выводят «в свет» новосинтезированные белки.

Из предыдущего изложения можно представить, что фолдинг - особенно с участием фолдаз и шаперонов - всегда приводит полипептидную цепь к «правильной», наиболее оптимальной в энергетическом и функциональном отношениях, пространственной структуре.

К сожалению, фолдинг иногда нарушается. Существует группа тяжелых неврологических болезней, которые обусловлены закономерно повторяющимся «неправильным» фолдингом одного, вполне определенного белка.

Данный белок, если он находится в нормальной конформации, называется прионовым белком. Обнаруживается он в мозгу; функция его неизвестна. При ряде заболеваний тот же полипептид оказывается в другой конформации. В последней преобладают участки с бета-структурой, почти отсутствующие в нормальной нативной форме, а молекулы белка имеют повышенную склонность к агрегации. Такой белок называется прионом(от proteinaceous infection particle - белковая инфекционная частица). В данной форме он, видимо, не способен к выполнению своей обычной функции.

Но самое худшее заключается в том, что «неправильная» форма белка вызывает переход в такую же форму и «правильных» форм. Как это происходит, неясно. Возможно, имеет место захват «правильных» молекул агрегатами приона, в результате чего эти молекулы разворачиваются и организуются заново, но по подобию прионов.

Таким образом, прионы в отношении своих исходных молекул играют роль антишаперонов,осуществляющих как бы фолдинг наоборот. Более того, процесс, очевидно, является автокаталитическим: вновь образовавшиеся порции «испорченного» белка начинают «портить» очередные порции нативного белка. Процесс продолжается, пока весь белок не оказывается «испорчен». Болезнь развивается в течение нескольких лет, но неотвратимо приводит к гибели животного или человека.

Как возникают в организме первые порции приона? Иногда, чрезвычайно редко, это происходит спонтанно - в результате ошибки фолдинга. Несколько чаще встречаются мутации, тогда болезнь передается по наследству. Наиболее часто болезнь возникает в результате употребления в пищу тех тканей животного, в которых содержатся прионы. Потому-то данные белки и названы инфекционными частицами.

Их отличает еще одна очень важная особенность - устойчивость к протеазам (в частности пищеварительным ферментам). Это помогает прионам проникать в неизмененном виде из желудочно-кишечного тракта в нервную ткань, где и запускается вышеизложенный автокаталитический процесс.

Все вместе это делает прионы уникальным инфекционным агентом: это, видимо, единственный случай, когда подобный агент лишен нуклеиновой кислоты (белковая инфекция).

Вызываемые прионами болезни. У коров это т. н. губчатая энцефалопатия (BSE - bovine spongiform encephalopathy), или коровье бешенство. Употребление человеком мяса таких коров вызывает болезнь Крейнцфельда-Якоба. Использование в популярной литературе термина «вирус коровьего бешенства» неграмотно. Прионы не вирусы. Кроме того, среди туземцев Новой Гвинеи известна еще одна болезнь той же природы - куру, при которой на лице человека то и дело появляются гримасы, как при смехе. Считают, что куру передается в результате каннибализма. Наконец, у овец болезнь называется почесухой: постоянный зуд заставляет животных все время тереться о твердые предметы. Открытие прионовых болезней позволяет некоторым биологам усомнится в так называемой «центральной догме молекулярной биологии». Определяющей однонаправленность потока информации от нуклеиновых кислот к белкам (ДНК↔РНК→белок).

Регуляция активности генов. Многоклеточный организм человека возникает при слиянии сперматозоида и яйца в единственную клетку – зиготу, содержащую 46 хромосом. Затем из зиготы, путем митотического деления, вырастает полноценный организм из огромного числа разнообразных клеток. В ядре каждой их этих десятков триллионов клеток есть все те же 46 хромосом (46 молекул нуклеопротеидов). При этом последовательность нуклеотидов в ДНК ядра зиготы и ДНК ядра любой клетки (печени, кожи, мозга) одинаковы. Но тогда возникает вопрос, почему клетки нашего организма не похожи друг на друга и почему они выполняют разные функции.

Серьезный шаг по решению этой проблемы был сделан Жакобом и Моно. Они выдвинули гипотезу о том, что у бактерий гены (участки молекулы ДНК, несущие элементарную функционально значимую информацию) работают в клетке не одновременно. Большую часть времени большая часть генов выключена "отдыхает", небольшая часть генов включена "работает". Главный механизм включения и выключения генов Жакоб и Моно связали с понятием о генах-операторах, белках репрессорах и индукторах.

По гипотезе Жакоба-Моно, перед обычным структурным геном находится ген-оператор, обеспечивающий фиксацию фермента РНК-полимеразы (участок для непосредственного присоединения РНК полимеразы называется промотор) и начало транскрипции. Обычно, с геном-оператором связан белок-репрессор и в таком состоянии фермент РНК-полимераза не может связаться с геном оператором и начать считывать информацию структурных генов ДНК (рис. 1).

Рисунок 1. Выключенное (исходное) состояние структурных генов.