ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНФТГУРАЦИИ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ.
Здесь много методов их вариантов, но наиболее надежны данные, получаемые методом КД.
Возможности применения метода КД для исследования вторичной и третичной структуры белков основывается на следующих фактах и постулатах:
1. Рентгено-структурный анализ показал, что основными структурными элементами пептидной цепи являются три модельных структуры: α-спираль, β-структура с параллельными цепями и неупорядоченные участки в виде клубка (ρ-структура);
2.
 |
Исследование спектров КД полипептидов с модельными структурами в области p p* и n p* переходов (195 – 240 нм) показало, что различные структуры имеют различные характеристические спектры:
3. Установлена корреляция между содержанием в одной молекуле белка трех модельных структур и его спектром КД. Вклады трех модельных структур в спектр считают аддитивными, поскольку они подчиняются уравнению:
Del = DeaРa + DebРb + DerРr ,
где Dea , Deb и Der - соответственно круговой дихроизм чистых a, b и r
форм, Р – доля этих форм в структуре белка.
4. Считая, что наблюдаемый спектр КД белка определяется пропорциональными вкладами спектров КД трех модельных структур, определяют вклад этих структур и их %-ное содержание в белке.
Существует несколько методов расчетов содержания модельных структур в белке. Остановимся на наиболее удобном изодихроическом методе, основанном на определении кругового дихроизма при трех длинах волн для трех так называемых изодихроических точек, в которых пересекаются характеристические кривые спектров двух структурных форм (см. спектр, представленный в пункте 2).
Ниже в таблице представлены значения кругового дихроизма для изодихроических точек, по которым и проводят расчеты:
| Опреде- ляемая конфор- мация | l изодихроичес- кой точки, при которой проводят определение, нм | Del для измеряе- мой конформации | Del для изодихроических точек |
| a b r | 200,5 | Dea209= -9,39 ± 0,45 Deb202=2,02 ± 0,15 Der200,5= -2,02 ± 0,15 | Deb209=Der209= -0,85 ± 0,06 Dea202=Der202= -1,81 ± 0,15 Dea200,5=Deb200,5=2,57 ± 0,15 |
 |
Для l изодихроических точек строится три калибровочных прямых, при помощи которых по значениям De для реальных структур рои этих длинах волн определяют % содержания каждой конформационной структуры:
. Можно также проводить расчеты по уравнениям:
%a = (De209 + 0,85)/(- 9,39 + 0,85);
%b = (De202 + 1,81)/(2,02 + 1,81);
%r = (De200,5 - 2,57)/(-2,02 -2,57).
Этот метод является самым доступным, быстрым и удобным, но в интервале l (200 – 210 нм) кривые КД сильно чувствительны к влиянию среды, к строению аминокислотных остатков (особенно ароматических). Разница в l очень небольшая, поэтому требуется очень высокая точность экспериментальных измерений спектров КД.