Определение вирулентности и конкурентоспособности клубеньковых бактерий

Вводные пояснения. Вирулентность клубеньковых — спо­собность этих бактерий проникать в клетки корня растения, там размножаться и вызывать образование клубеньков — оп­ределяют по времени появления первого видимого клубенька. Критерием вирулентности может быть также доза инокулюма — «инфекционная нагрузка», «запас инфицирующего нача­ла» для осуществления процесса инфицирования в макси­мально короткие сроки.

Отбор вирулентных культур ризобий мелкосемянных растений методом Фэреуса. Два предметных стекла толщиной 0,7—0,8 мм с проложенной между ними с одного конца стеклянной пластинкой располагают так, что-6ы край одною стекла выступал нал краем другого примерно на 3—5 мм, и прочно пе­ревязывают их нитками (рис. 32).

	Рисунок 32 - Образо­вание клубеньков на корнях проростков бобовых и системе стекол Фэреуса

Укачан­ное расположение удобно для дальнейшею заполнения агаром пространства между стеклами и посева семян. Стеклянные пластинки для прокладки готовят из тонких предметных стекол, разрезая их на 3 части.

Систему стекол Фэреуса ставят и чаш­ку Петри и стерилизуют в автоклаве. После стерилизации и заполнении агаризованной средой пространства между стеклами по две таких системы помешают в пробирки (180x40 мм) с жидкой питательной сре­дой (60 мл на пробирку). Состав агаризованной (0,6% агара) и жидкой среды одина­ков (г/л дистиллированной воды): СаС1₂ — 0,1; MgSO₄·7H₂O - 0.12; КН₂РО₄ - 0,1; К₂НРО₄ — 0,15; лимонно-кислое железо — 0,005; Мо, Сu, В, Fе, Мn - следы.

Предварительно рН среды доводят до 6,6 серной кислотой, затем стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. 30 мин.

Одновременно стерилизуют семена. Существуют разные способы стерилизации семян. Один из наиболее распростра­ненных способов следующий: сначала семена обрабатывают спиртом (для лучшей их смачиваемости), затем промывают стерильной водой и помещают в большие стерильные колбы с 0,1%-ным раствором сулемы (или 1%-ной бромной водой) и выдерживают мелкие семена в течение 2 - 3 мин, а круп­ные — в чеченце 4—5 мин. По прошествии срока обработки семена неоднократно промывают стерильной водой, соблюдая правила асептики. Стерилизовать, семена можно также по Nutman концентрированной серной кислотой (см. 12.5.2).

Отобранные простерилизованные семена помешают в чашку Петри с фильтровальной бумагой и оставляют в тонком слое стерильной воды. Посев проводят через сучки. К тому времени семена прорастают (длина проростков — 3—5 мм). Пространство между предметными стёклами в подготовленной системе заполняют расплавленной агаризованной минераль­ной средой с помощью стерильных пипеток. После застывания агара в каждую систему помещают по три проростка. Посев проводят асептически. Далее по две таких системы устанавли­вают в пробирки с жидкой минеральной средой. Через сутки семена и среду инокулируют 3 каплями густой суспензии двух­суточной культуры клубеньковых бактерий.

Для исследований под микроскопом через 4—5 сут после посева, соблюдая условия асептики, осторожно стерильным пинцетом вынимают одну систему. Бритвой разрезают нитки. Одно предметное стекло удаляют. На агар наносят каплю во­ды, на нее помещают покровное стекло и корни просматрива­ют под микроскопом.

Определение конкурентоспособности клубеньковых бак­терий. Конкурентоспособность — это способность вирулентно­го штамма клубеньковых бактерий в присутствии других виру­лентных штаммов обеспечивать преимущественное инфициро­вание бобового растения. Ее можно выявить только при наличии двух или нескольких штаммов в зоне корня растения.

Основное условие при определении конкурентоспособ­ности — проверка ее только у штаммов заведомо одинаково ви­рулентных или даже более вирулентных по сравнению с тем, который оценивают. Иначе можно допустить ошибку, приняв за более конкурентоспособный более вирулентный штамм.

Критерий конкурентоспособности — количество клубень­ков, образуемых каждым из вирулентных штаммов при их од­новременном воздействии на растение. Правильнее конкурен­тоспособность определять в лабораторных, строго контролируемых условиях. Для этой цели применяют серологический метод и метод метки штамма-мутанта по его антибиотикоустойчивости.

При серологическом методе оценки конкурентоспособ­ности ризобий для иммунизации кроликов в качестве антиге­нов используют суспензии 2—3-суточных культур быстрорасту­щих и 5—7-суточных культур медленнорастущих штаммов в физиологическом растворе (2 мл на скошенный агар). Для ос­вобождения от неспецифических Н-антигенов суспензии про­гревают в течение 30 мин на кипящей водяной бане и выдер­живают 1 сут в холодильнике.

Иммунизацию осуществляют в ушную вену кроликов-самцов массой 3,5—4,5 кг возрастающим количеством инфици­рующего материала. Всего вводят не менее 20 млрд. клеток с интервалом в 3 дня. Курс иммунизации — 6—8 инъекций.

Кровь у опытных животных берут на 7-й день после по­следней иммунизации из наружной краевой вены уха. Собира­ют ее в стерильный сосуд, смоченный физиологическим рас­твором, ставят на 1 ч в термостат при 37 °С.

Кровяной сгусток отделяют от стенок пипеткой Пастера и ставят сосуд на 18—20 ч в холодильник при 4—10°С. Затем пипеткой Пастера отделяют отстоявшуюся сыворотку (антисы­воротку) и переносят ее в стерильные пробирки. Консерви­ровать сыворотку можно тимолом или борной кислотой (2 г на 100 мл), но лучше хранить ее в лиофилизированном состоянии.

Для реакции преципитации методом Оухтерлони исполь­зуют максимально чистый прозрачный агар (лучше агар Дифко). В стерильные чашки Петри заливают расплавленный агар слоем 3—4 мм. После застывания при помощи специального штампа в агаре вырезают лунки диаметром 3—4 мм. Удобнее использовать штамп из 7 трубочек: 1 — центральная и 6 — по окружности на расстоянии 8 мм друг от друга. В лунки пипет­ками Пастера наливают: в центральную — антисыворотку, в периферийные — растворы антигенов. Заполнять лунки следу­ет быстро, аккуратно, не переливая жидкость через края и не касаясь их. Чашки помещают в эксикатор с водой на дне и ти­молом в качестве антисептика. Реакцию проводят при 20 °С.

Линии преципитации учитывают визуально на 2—4-й день. Если определяют долю того или иного штамма, участ­вующего в образовании клубеньков в почве, то, чтобы оценить его конкурентоспособность, в качестве антигена берут культу­ры клубеньковых бактерий, выделенные из клубеньков и при­готовленные так, как описано выше.

Для оценки конкурентоспособности клубеньковых бакте­рий методом метки исследуемые штаммы культивируют на сре­дах с возрастающими (от 10 до 1000 ед/мл) дозами антибиоти­ка, в частности стрептомицина или канамицина. При этом происходит адаптация отдельных штаммов к высокой дозе ан­тибиотика. При инокуляции такими резистентными штаммами можно определить, какое количество клубеньков образовано, и таким образом получить характеристику их конкурентоспо­собности.

Обычно исследуют не менее 100 клубеньков. После сте­рилизации поверхности клубеньков (см. 12.5.1) каждый клубе­нек отдельно раздавливают в капле стерильной воды и прово­дят посев в чашки со стрептомицином. Если клубенек образо­ван резистентным вариантом, то на среде со стрептомицином отмечают рост клубеньковых бактерий.