Определение азотфиксирующей активности ацетиленовым методом

Нитрогеназа азотфиксирующих микроорганизмов способна восстанавливать ацетилен (С₂Н₂) до этилена (С₂Н₄). Оба не­предельных углеводорода легко идентифицируют при помощи газового хроматографа. Поскольку процессы восстановления молекулярного азота и восстановления ацетилена аналогичны, второй широко применяют для моделирования и изучения азотфиксации. Если в газовой среде присутствуют одновремен­но N₂ и С₂Н₂, то в первую очередь произойдет восстановление ацетилена вследствие большего сродства электронов к атому углерода.

Ацетиленовый метод определения азотфиксирующей ак­тивности бактерий разработан Харди в соавторстве.Чувствительность метода позволяет обнаружить до 10^-12 М этилена и превосхо­дит чувствительность масс-спектрометрического определения ^I5N в 10³ раз, а метода определения азота по Кьельдалю — в 10⁶ раз. Поскольку азотфиксацию осуществляют аэробные и анаэробные свободноживущие и симбиотические бактерии, схема экспериментов должна быть различной.

Используют несколько вариантовэтого метода:

1. отбор проб почвы (воды, других анализируемых суб­стратов или чистой культуры микроорганизма) с последующей инкубацией в атмосфере ацетилена;

2. способ почвенных монолитов, при котором часть поч­вы (с растением или без него) инкубируют с ацетиленом в га­зонепроницаемом контейнере;

3. полевой диффузионный метод «колпаков», заключаю­щийся в том, что поверхность почвы накрывают газонепроницаемым колпаком, под который вводят ацетилен;

4. выдерживание монолита почвы с растением в проду­ваемой через почву ацетилен-воздушной смеси.

Во всех случаях ацетилен вводят в воздушное простран­ство в количестве 10% от объема сосуда, или «колпака», или с заведомым избытком.

Применение ацетиленового метода в полевых условиях сопряжено с некоторыми сложностями: введение в почву ацетилена может сопровождаться его адсорбцией или, напротив, затрудненной диффузией. Образующийся этилен также способен адсорбироваться почвой, а при отсутствии аце­тилена, напротив, выделяться ею. В герметичной камере, осо­бенно при длительной экспозиции, возникает парниковый эффект— увеличение концентрации СО₂ в составе газовой смеси. Следствием его является активизация фотосинтеза, в результате чего усиливается отток корневых выделений, спо­собствующий повышению активности микроорганизмов; кро­ме того, может учитываться не только азотфиксации в почве и ризосфере, но и в филлосфере растений.

В соответствии с метолом Харди с соавт. питательную среду с культурой помешают и шприцы фирмы Chirana на 10 мл. Атмосферный воздух удаляют вакуумным насосом, со­единенным со шприцем и манометром, а содержимое шприца (инокулят) трижды промывают аргоном (Аг). Затем шприцы заполняют газовой смесью Аг + 2% С₂Н₂ (для анаэробов). Для аэробных микроорганизмов в неё вводят 2—10% О₂. После за­полнения шприца газовой смесью иглу снимают и отверстие закрывают силиконовой пробкой, через которую впоследствии берут газовые пробы инсулиновым шприцем дли анализа на газовом хроматографе.

Продолжительность опыта определяется его целями и ак­тивностью культуры: острый опыт идет до 3 сут.

В конце опыта реакцию восстановления С₂Н₂ прекраща­ют, добавляя к культуральной среде 0,2 мл 40%-ного NaOH. Газовую смесь готовят в газометрах заранее (за 24 ч до опыта), чтобы обеспечить наиболее полную диффузию газовых состав­ляющих.

Ацетилен и этилен определяют на газовом хроматографе с пламенным ионизационным детектором по времени выхода каждого газа, сравнивая его со временем выхода известною стандартного газа. Колонку (1,5 м длиной и 4 мм диаметром) заполняют сорбентом (силикагелем АСК). В качестве газа-носителя используют водород, устанавливая его расход рав­ным 36 мл/мин (хроматограф «Bеcher Delft»). Температура ко­лонки — 50°С, объем вводимой газовой пробы — 0,5 мл. Ко­личество С₂Н₂ и С₂Н₄ рассчитывают по калибровочной кри­вой. В длительных экспериментах для определения азотфиксирующей активности почвы пользуются флаконами из-под пенициллина или стеклянными сосудами на 16 см³ с силиконовой пробкой и боковым отростком, перекрываю­щимся притертым стеклянным затвором. В последнем случае через боковой отросток легко удалить необходимый инертный газ и наполнить им сосуд.