Учет ризосферной и корневой микрофлоры методом последовательных отмываний корней (по Теппер)
Из выкопанных монолитов почвы с растениями стерильными пинцетом и ножницами отбирают I г молодых корней примерно одного диаметра с приставшими к ним частицами почвы. Одновременно берут навеску для определения влажности почвы.
Корни помещают в -ю колбу со 100 мл стерильной водопроводной воды и взбалтывают 2 мин. Стерильным крючком, сделанным из обычной бактериологической иглы, корни извлекают и переносят последовательно во 2-ю, 3-ю и т. д. до 7-й колбы, также содержащие по 100 мл стерильной водопроводной воды. В каждой колбе корни отмывают по 2 мин. Желательно в последнюю 7-ю колбу перед стерилизацией добавить в воду 3—5 г песка.
Из каждой колбы отдельно стерильной пипеткой берут 0,05 мл отмывной воды, наносят на поверхность питательной пластины (МПА) и отдельным шпателем Дригальского, держа полуоткрытую чашку около пламени горелки, втирают в среду досуха. Чашки помешают в термостат при 28—30 °С. Спустя 3—5 сут чашки можно анализировать.
По мере отмывания корней численность бактерий не убывает, а в ряде случаев — даже увеличивается. Это свидетельствует о тесной связи эпифитных микроорганизмов с тканями растений, для которых они служат естественным защитным барьером. В чашках с посевом из первых отмываний много крупных колоний спороносных форм бактерий — это могут быть и почвенные обитатели. По мере отмывания количество колоний бациллярных форм уменьшается и возрастает число мелкоточечных колоний неспорообразующих форм рода Pseudomonas.
Для определения количества микроорганизмов в ризосфере и на корнях суспензию из 1-й колбы (1-го отмывания) дополнительно взбалтывают 5 мин. Затем из нее готовят разведения, из которых делают поверхностные посевы. Содержимое остальных 6 колб сливают вместе и, также приготовив последовательные разведения, проводят из них поверхностные посевы на МПА.
Для подсчета клеток в 1 г абсолютно сухой почвы ризосферычисло колоний на чашке умножают на 20 (чтобы определить их число в 1 мл) и на степень разведения, а затем делят на массу абсолютно сухой почвы ризосферы. Количество ризосферной почвы, попавшей с корнями в 1-ю колбу, находят по разности первоначальной навески и навески отмытых корней (для чего из последней порции отмывной воды корни извлекают, помешают на фильтровальную бумагу для удаления волы и взвешивают).
При определении количества микроорганизмов на 1 г корней число колоний, выросших в чашке, умножают на 20, на степень разведения и на 600 (6 смывов по 100 мл в каждом) и делят на величину массы сырых корней.
В зависимости от задач, поставленных исследователем, можно использовать различный набор сред для культивирования микроорганизмов, развивающихся в корневой зоне растений.