Определение общей численности микроорганизмов в почве методом прямого счета под микроскопом

Материалы и оборудование (к 10 2 10.3.Л)

Питательные среды (МИА и КАА), жидкие среды в пробирках; среда для аэробных целлюлозоразрушающих бактерий; среда для анаэробных азотфиксаторов; гелевые пластины, пропитан­ные питательной средой для азотобактера и аэробных целлюлозоразрушающих бактерий; стерильные чашки Петри, колбы со стерильной водопроводной водой по 90 мл, стерильные пипетки Мора на 10 мл, стерильные градуированные пипетки на 1 мл, стерильные шпатели Дригальского, часовые стёкла, стеклянные палочки с оттянутыми концами; свежие пробы почв разных типов; чайные ложки, пинцеты, трафареты, лупы, микроскопы, предметные стекла и все необходимое для приготовления окрашенных препаратов в раздавленной капле и микроскопирования.

Метод прямого счета стали применять после того, как обнаружили, что кислые красители хорошо прокрашивают на препарате вегетативные клетки микроорганизмов и слабо - почвенные частицы.

Наиболее точно численность микроорганизмов в почве определяют методом Виноградского. Исследования, проведен­ные этим методом, показали, что разные почвенные фракции содержат неодинаковое чисто микроорганизмов. Меньше всего их во фракции крупных частиц почвы, больше всего — в дисперсной фракции, содержащей максимум органического вещества. Метод имеет ряд достоинств, но достаточно труден и поэтому широко не используется.

Метод Виноградского в модификации Шульгиной чаще применяют и лабораторной практике. Сущность его в следую­щем. Из средней почвенной пробы (см. 10. 1.1) берут 5 г и вно­сят в колбу Эрленмейера на 250 мл, содержащую 50 мл сте­рильной водопроводной воды. Навеску почвы предварительно растирают в стерильной агатовой или фарфоровой ступке с не­большим количеством стерильной воды. Дли черноземных и темно-каштановых почв навеску растирают с 0,1%-ным рас­твором пирофосфата натрия. Затем 5 мин встряхивают и в те­чение 2—5 с дают осесть грубым частицам.

Из полученной взвеси стерильной градуированной пи­петкой берут 0,01 мл и переносят на хорошо обезжиренное стекло. Одновременно с суспензией на стекло помещают кап­лю 0,1%-ного раствора агара (хорошо отмытый агар готовят на дистиллированной воде). Агар и суспензию на стекле переме­шивают и стерильным покровным стеклом распределяют по трафарету на 4 см². Трафарет — заштрихованный тушью на миллиметровой бумаге квадрат площадью 4 см², приклеенный к предметному стеклу с нижней стороны.

Препарат сушат, фиксируют 96%-ным спиртом и красят карболовым эритрозином (от 30 мин до одних суток). При ок­рашивании стекла погружают в раствор эритрозина. Остаток красителя смывают, опуская стекла в воду тыльной стороной. Затем препарат снова сушат и просматривают под микроско­пом с иммерсионной системой.

Для получения более точных результатов подсчитывают 10 полей зрения и определяют среднее число клеток в одном поле зрения. Одновременно устанавливают площадь поля зре­ния: р =πr ² (см. 5.1.3). Диаметр поля зрения измеряют при по­мощи объектного микрометра. Затем находят, сколько полей зрения (К) размещается на площади мазка (Р), равной 400 мм² по формуле:

Пример расчета. Если диаметр поля зрения равен 0,16 мм, а площадь поля зрения соответствует 0,02 мм², то

К = 400 : 0,02 = 20 000 (полей зрения).

Среднее число клеток в поле зрения умножают на К и устанавливают число клеток в 0,01 мл суспензии. Для оп­ределения количества клеток в 1 мл суспензии полученное число умножают на 100, для подсчета в 1 г абсолютно сухой почвы — на степень разведения и делят на навеску абсолютно сухой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы.

Использование метода прямого учета почвенных микро­организмов по Виноградскому в модификации Шульгиной по­казало, что в почве содержится в сотни и тысячи раз больше клеток микроорганизмов, чем удается учесть методом пита­тельных пластин.

Метод учета численности бактерий в почве при помощи люминесцентной микроскопии по Звягинцеву и Кожевину дает еще более достоверный результат по сравнению с методом Ви­ноградского. Суть его в том, что приготовленные из почвенной суспензии препараты окрашивают специальным красителем — акридином оранжевым (флуорохромом). Окрасившиеся в яр­ко-зеленый цвет клетки хорошо заметны на темном или красном фоне почвенных частиц и препарата, причем микроско­пия в отраженном свете позволяет учитывать и адсорбирован­ные почвенными частицами клетки, которые, как правило, не видны в проходящем свете.

Порядок подготовки препарата:

1) почвенную суспензию с соотношением почвы и во­ды 1 : 10 (10 г почвы на 90 мл воды) обрабатывают на ультра­звуковой установке УЗДН-1 с диспергирующей насадкой в те­чение 3 мин при силе тока 0,40 А и частоте 15 кГц. Обработ­ка почвы ультразвуком способствует не только разрушению почвенных агрегатов и десорбции микроорганизмов, но и дез­агрегации микроколоний в почве. Затем почвенную суспензию переносят в мерный цилиндр на 100 мл. После от­стаивания (2 мин) пипеткой отбирают 2 мл суспензии из средней фракции, т. е. возле отметки на цилиндре «50 мл», и переносят в колбу с 18 мл воды;

2)колбу энергично встряхивают, суспензию из неё нано­сят микропипеткой на тщательно обезжиренное предметное стекло (0,01 мл на препарат) и равномерно распределяют пет­лей по площади 4 см² (квадрат 2x2). На каждом стекле можно приготовить 3 препарата. Удобнее предварительно начертить расположение квадратов в натуральную величину на бумаге и класть на нее предметные стекла для приготовления препа­ратов;

3)препараты высушивают на воздухе при комнатной температуре. Затем после фиксации легким нагреванием на пламени газовой горелки препараты окрашивают водным рас­твором акридина оранжевого (разведение 1 : 10 000) 2—4 мин;

4)избыток красителя удаляют в процессе промывки, для чего стекла погружают на 10 мин в стакан или кювету с водо­проводной водой. Окрашенные препараты высушивают при комнатной температуре;

5)для микроскопии на препарат наносят каплю воды и покрывают покровным стеклом. Приготовленный препарат не должен содержать пузырьков воздуха, лишнюю воду снима­ют фильтровальной бумагой. Препарат просматривают на лю­минесцентном микроскопе МЛ-2 или МЛ-4 (фильтры ФС-1-2, ЖЗС-19, ЖС-18, объектив 90хЛ, окуляры 4х или 5х).

Число клеток микроорганизмов, содержащихся в 1 г поч­вы (М), определяют по формуле

где 4 — площадь квадрата, см²; а — среднее число клеток в поле зре­ния; р — площадь поля зрения (мкм²); Н — показатель разведения (в данном случае Н = 100, что приемлемо для поверхностных горизон­тов почв основных типов, однако степень разведения может быть из­менена в зависимости от численности микроорганизмов в конкретном образце; желательно подобрать разведение таким образом, чтобы сред­нее число клеток в поле зрения составляло 5—10); 10¹⁰ — коэффици­ент, который получается при измерении площади мазка в мкм и расчете Н в мл.

Из каждого почвенного образца готовят два препарата и на обоих препаратах подсчитывают клетки в 5 полях зрения. Поля зрения выбирают не произвольно, а переходят к новому полю зрения, поворачивая микровинт столика на определенную величину.

Учет при помощи люминесцентной микроскопии требует соответствующего оборудования. При его отсутствии следует применять метол Виноградского в модификации Шульгиной.