Клонирование генов

N В этом случае продуктом амплификации будет ДНК только возбудителя, а не пациента.

N Подбирается последовательности, характерные для ДНК возбудителей болезни и подобрать такие праймеры, которые будут гибридизоваться с ДНК возбудителя, но не с ДНК человека

N Метод основан на том, что первичная структура ДНК разных видов организмов различна

N С одной стороны, молекулы ДНК животных и человека имеют большие размеры

Методы работы с генным материалом

N Например активные формы кислорода связываются с участками ДНК, где находятся гены, кодирующие все антиоксидантные ферменты

N существуют особые участки ДНК, с которыми связываются гормоны, чаще стероидной природы, усиливающие транскрипцию

n 3. механизм координированного усиления биосинтеза или координированного ослабления биосинтеза

n Трудности в изучении ДНК заключаются в следующем:

n Такие молекулы неудобны для исследования и их предварительно разрезают, фрагментируют с помощью специальных ферментов - рестриктаз, выделяемых из бактерий

n Рестриктазы «узнают» определенные последовательности и разрезают ДНК в определенных местах;

n С другой стороны, количество ДНК в клетке невелико, поэтому необходим способ умножения (амплификации) изучаемой ДНК in vitro

n Таким методом является полимеразная цепная реакция - ПЦР, которая позволяет амплифицировать ДНК или ее фрагмент в миллионы раз за несколько часов

Метод ПЦР

n Методом ПЦР осуществляют диагностику следующих заболеваний: ВИЧ –инфекции, гепатиты А, В, С, Д, цитомегаловирусную инфекцию, токсоплазмоз, хламидии, то есть многие вирусные и бактериальные инфекции.

n ПЦР осуществляют в пробирке с помощью термостабильной ДНК-полимеразы при участии дезоксинуклезидтрифосфатов - субстратов и коротких олигонуклеотидных затравок - праймеров

n Праймер - короткие, длиной в 20-30 нуклеотидов одноцепочечные фрагменты ДНК, комплементарные 3’-концевым последовательностям копируемой ДНК-матрицы

n Реакция происходит в несколько стадий:

Стадии одного цикла ПЦР:

· Денатурация.

· Инкубационную смесь нагревают до 90о

· При этом происходит разрушение слабых связей в ДНК и из одной двухцепочечной молекулы образуются две одноцепочечные

· Гибридизация праймеров

· Температуру снижают до 50о

· При этом происходит гибридизация цепей ДНК с праймерами

· Полимеризация

· Инкубационную смесь нагревают до 70о

· При этой температуре полимераза удлиняет оба праймера с их 3’-концов

· Праймеры дорастают до размеров матрицы

· В результате количество ДНК удваивается

n Фрагменты ДНК можно вырезать из генома эукариот специально подобранными рестриктазами и встроить в ДНК плазмиды или вируса вскрытую (разрезанную) теми же рестриктазами

n Образуется гибридная плазмида или рекомбинантная ДНК