В. Сверхэкспрессия белков
Для лечения тех или иных заболеваний необходимы белки, например белковые гормоны, которые у животных присутствуют в малых количествах и поэтому труднодоступны. В настоящее время такие белки можно получать в больших количествах при помощи сверхэкспрессии в бактериальных или эукариотических клетках. Для этого необходимо выделить соответствующий ген из ДНК человека и клонировать его в составе плазмиды. Кроме этого гена плазмида должна содержать последовательность ДНК, которая делает возможной репликацию и транскрипцию плазмидной ДНК в клетке-хозяине. Как только подходящие клетки трансформированы плазмидой и произойдет репликация, транскрипция гена инициируется путем индукции. Трансляция образовавшейся мРНК в клетке-хозяине позволяет производить необходимый белок в достаточном количестве.
Случайный мутагенез с использованием «вырожденных» олигонуклеотидных праймеров.
К сожалению, обычно бывает неизвестно, какую нуклеотидную замену в клонированном гене нужно произвести, чтобы получить белок с нужными свойствами. Поэтому часто приходится изменять один определенный нуклеотидный сайт всеми возможными способами. Например, можно синтезировать олигонуклеотидные праймеры, в одном из сайтов которых находятся разные нуклеотиды. Такие «вырожденные» олигонуклеотиды обычно получают, добавляя в автоматически синтезатор ДНК на определенном этапе, когда к цепи должен присоединяться специфический нуклеотид, небольшое количество (до несколкьих процентов) трех других нуклеотидов. В результате получается гетерогенный по одному сайту набор олигонуклеотидных праймеров, с помощью которых можно получить соответствующий набор мутантных генов-мишеней с нуклеотидными заменами в специфическом сайте.
Этот подход имеет два преимущества: 1) не нужно в точности знать, какую роль играет тот или иной аминокислотный остаток в функционировании белка; 2) поскольку в данном сайте происходят разные аминокислотные замены, могут случайно синтезироваться белки с разнообразными интересными и полезными свойствами. Конечно, если ни один из образующихся белков не обладает нужными свойствами, приходится начинать все сначала, синтезировав новый набор «вырожденных» праймеров, комплементарных другой области гена.
