Биосинтез белков

Лекция 11.

Как и обещано, начнём с повторения центральной догмы молекулярной биологии. Итак, информация хранится в ДНК, а воплощается в белках, промежуточным звеном на этом пути выступает РНК. Коротко ее можно сформулировать так «ДНК-РНК-белок». Сначала по матрице ДНК (по участку, соответствующему данному гену) синтезируется мРНК. Этот процесс, переписывания нуклеотидной последовательности с ДНК на РНК называется транскрипцией. Здесь меняется только физический носитель, язык остается тем же. Затем, по данным мРНК на рибосомах происходит синтез белка. Этот процесс перевода с языка нуклеотидной последовательности в последовательность аминокислот называется трансляцией. Именно этот процесс и будет предметом нашего сегодняшнего рассмотрения. Белки – конечные продукты информационных путей в клетке. Обычной клетке требуются тысячи различных белков, количество их регулируется в зависимости от сиюминутных потребностей клетки. Синтез белков – самый сложный из биосинтетических механизмов. В эукариотической клетке требуется около 70 рибосомальных белков, не менее 20 ферментов для предварительной активации аминокислот, более 10 дополнительных белковых факторов для инициации, элонгации и терминации синтеза, более 40 тРНК. На этот процесс затрачивается огромный процент клеточных ресурсов – до 90%, всей энергии затрачиваемой на биосинтез. В простейшей бактериальной клетке содержится 20000 рибосом, 100000 факторов и ферментов, 200000 тРНК и всё это в объеме 0.1 мкм3. Это богатство составляет 35% сухого веса клетки.

Итак, мы говорим, что трансляция – это процесс перекодирования из нуклеотидной последовательности в аминокислотную. Как же устроен генетический код? Оснований в РНК 4:A, C, G, U, с их помощью надо закодировать 20 аминокислот. Попробуем использовать пары, получим 4^2=16 – не хватает. Возьмем по 3, получим 4^3 = 64 – более чем достаточно. Генетические эксперименты доказали, что генетический код действительно: во-первых – троичен, во-вторых, не перекрывается, в третьих – лишен пунктуации.

Чтобы осуществить перекодирование, нужен адаптер, который ставил бы в соответствие каждой тройке нуклеотидов (триплету), одну определенную аминокислоту. Роль такого адаптера выполняет тРНК, которая, с одной стороны, узнает соответствующий кодон, пользуясь всё тем же принципом комплиментарности, а с другой стороны, может ковалентно связывать аминокислоту, соответствующую данному кодирующему триплету, или кодону. тРНК, связанная с аминокислотой, называется аминоацил-тРНК.

Аминокислотная последовательность определяется непрерывной последовательностью триплетов. Вопрос, как разбить последовательность на триплеты? Есть три способа. Способ разбиения называется рамкой считывания и определяется первым нуклеотидом. Если добавить или выкинуть в последовательности нуклеотид, произойдет сдвиг рамки считывания и ак-последовательность изменится.

Генетический код был расшифрован. Его можно изобразить в виде таблицы. Присмотревшись, можно заметить, что нескольким кодонам соответствует одна и та же аминокислота, т.е. код вырожден. То, что соответствие не является взаимооднозначным, не страшно, потому что для точности воспроизведения требуется, чтобы каждому кодону соответствовала одна ак, что выполняется. С одной стороны, это не удивительно, кодонов 64, а аминокислот – 20. Несколько кодонов имеют специальные функции, например UAA, UAG, UGA – это стоп-кодоны, не кодирующие никакой ак. Кодон AUG не только кодирует Met, а и является старт-кодоном, т.е. сигналом начала синтеза. В случайной последовательности кодонов в среднем один из 20 будет оказываться стоп-кодоном, и синтез будет прекращаться. Если хотя бы на протяжении 50 кодонов стоп не встречается, такая рамка называется открытой рамкой считывания.

Как тРНК узнает кодон? За счет спаривания комплиментарных оснований кодона с ее последовательностью, называемой «антикодон». Последовательности спариваются антипараллельно, 1 основание кодона (с 5’ конца) с 3 основанием антикодона. По логике вещей мы ожидаем, что каждый антикодон в тРНК узнает только один кодон мРНК, диктуемый принципом комплиментарности. Как тогда быть с вырожденностью? Надо делать разные тРНК для каждого кодона, соответствующего данной ак. Однако это не так. Число тРНК для каждой ак НЕ равно числу кодонов, которыми она кодируется. В чем разгадка? Многие тРНК содержат нестандартные основания, например инозин I (похож на G). Он может образовывать пары со всем тремя основаниями: A, C, U. Однако такие связи оказываются гораздо слабее, чем связи в Вотсон-Криковских парах. Такой антикодон может узнавать три разных кодона. I встречается на 1 месте в антикодонах, т.е. спаривается с 3 нуклеотидом в кодоне. Проанализировав генетический код, Крик высказал wobbling гипотезу, согласно которой:

1. Первые два основания всегда образуют прочные Вотсон-Криковские пары, обеспечивающие основную специфичность кода. Действительно, если присмотреться, основное вырождение приходится на 3 нуклеотид.

2. Первое основание антикодона (спаренное с 3 основанием кодона) определяет, сколько кодонов он может узнать. Если это C или A, то только один кодон, и все пары будут В-К. Если это U или G, то два кодона, т.к. возможны пары UA и UG, GU и GC. Если это I – то три.

3. Если ак соответствует нескольким кодонам, причем различие заключено в первых двух нуклеотидах, для нее требуются разные тРНК.

4. Для узнавания 61 кодона требуется как минимум 32 тРНК.

Для чего такая сложность? Грубо говоря, основная специфичность заложена в первых двух основаниях, третье основание связывается слабо и болтается. Это уменьшает энергию связи и позволяет тРНК быстро высвобождаться после образования пептидной связи. Если бы все три пары были ВК, высвобождение бы требовало больших энергетических затрат и шло бы медленно. Кодон-антикодон взаимодействие обеспечивает компромисс между точностью и скоростью.

Перейдем к самому процессу синтеза белка. Так же как и в случае с репликацией и транскрипцией трансляцию можно поделить на стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. После этого белок еще сложиться и подвергнуться процессингу. Стадии инициации предшествует активация аминокислот.

Активация ак. происходит независимо от рибосом и заключается в том, что ак должна ковалентно связаться с тРНК. На эту реакцию требуется затрата энергии в виде АТР. Ферменты, осуществляющие эти реакции, называются аминоацил-тРНК синтазы. Для каждой ак своя синтаза. Если для одной ак существует несколько тРНК, обычно одна и та же синтаза сажает ак на все ее тРНК. тРНК похожа на клеверный лист, имеет длину 73-93 нт. АА ручка (ак ручка) находится на 3’ конце и содержит последовательность ССА. Далее происходит реакция ATP+ак = аминоацил-AMP + PPi, потом аминоацил-AMP реагирует с тРНК, давая аминоацил-тРНК и АМР. Как мы увидим позднее, когда тРНК узнает кодон и попадает в рибосому, рибосома уже не проверяет, правильно ли ак соответствует антикодону, поэтому вся ответственность за правильность лежит на аминоацил-тРНК синтазах. Некоторые из них могут проверять свои ошибки. Введем обозначения: в верхнем индексе пишется, для какой ак предназаначена данная тРНК, тРНК ^Leu, узнает кодон, соответствующий Leu. Перед тРНК пишут ту ак, которая входит в состав аминоацил-тРНК. Например, Ile-тРНК ^Leu означает ошибку, что к тРНК для Leu присоединился Ile. В чем критерий «правильности» связи? В энергии связи. Если разницы в энергии связи не достаточно для того, чтобы различить, например, два изомера (Leu Ile), тогда этот фильтр применяется дважды. У некоторых синтаз есть специальный сайт для тестирования. Если ак-АМР не подходит, она гидролизуется. В среднем при синтезе белков совершается одна ошибка на 10^-4. Аминоацил-тРНК синтазы должны узнавать свои тРНК. Как? Соответствие между ними получило название «второй генетический код», правила которого гораздо сложнее. Некоторые синтазы узнают сам антикодон, некоторые (Ala) – G-U пару (можно взять коротенькую шпильку и ее тоже узнают).

Инициация трансляции. Откуда начинается синтез? мРНК читается с 5’ конца, а белок начинает синтезироваться с N-конца.

В какой точке он начинается? Со старт-кодона AUG. Он соответствует ак Met. Для Met есть 2 тРНК, одна используется, когда он выступает в роли первой ак, а другая, когда в середине. Первым остатком во всех вновь синтезируемых пептидах оказывается производная метионина N-формилметионил. В рибосому он попадает в виде N-фомилметионил-тРНК ^FMet . Сначала Met присоединяется к тРНК ^FMet, потом делается формилом. В эукариотах используется Met, но тРНК тоже особая.

Синтез белков осуществляется на рибосомах. Что это такое? Это очень сложная молекулярная машина. Рибосомы есть как у про- так и у эукариот. Грубо рибосомы состоят из двух субъединиц разного размера. У бактерий это 30S и 50S (в сумме 70S), 40S и 60S (в сумме 80S).

Рассмотрим инициацию на примере бактерий. Для образования инициирующего комплекса необходимо: мРНК, 30S субъединица рибосомы, N-фомилметионил-тРНК ^FMet , набор инициирующих факторов IF1, IF2, IF3, GTP, 50S и Mg²⁺. Сначала 30S связывается с IF3, что предотвращает преждевременное связывание 30S и 50S. Потом мРНК связывается с 30S так, что AUG занимает определенное положение на 30S. В 30S есть 16S рРНК, содержащая последовательность, узнающую и комплиментарно связывающую последовательность Shine-Dalgrano, расположенную за 8-13 нт до инициирующего кодона. (Заметим, что мРНК не начинается с инициирующего кодона, а между ним и кэпом еще 25-30 нт.) Это взаимодействие обеспечивает правильное положение мРНК для начала трансляции. Благодаря последовательности Shine-Dalgrano трансляция не может начаться с AUG, находящегося в середине.

В рибосомах есть два сайта, куда могут связываться тРНК: сайт P и сайт А. В образовании их принимают участие обе субъединицы. fMet-тРНК ^FMet , связывается с Р сайтом. Будучи исключением она не может сесть на А сайт.

На следующей стадии комплекс еще увеличивается: антикодон fMet-тРНК ^FMet связывается с AUG, к ней присоединяется IF2, уже связанный с GTP. На последней стадии к ним добавляется 50S, при этом GTP гидролизуется, а IF2 и IF3 диссоциируют (покидают комплекс). Получается 70S рибосома, и всё это называется инициирующий комплекс. Правильное положение первой ак, регулируется в двух точках: связыванием с рибосомой и с AUG.

Элонгация. Пептидные связи образуются на стадии элонгации. Для элонгации надо: инициирующий комплекс, следующая аминоацил-тРНК, набор факторов элонгации (EF-Tu, EF-Ts, EF-G), GTP. На первом шаге аминоацил-тРНК связывается с EF-Tu, содержащим GTP, а потом они вместе садятся на А сайт рибосомы. Это возможно, если она узнает следующий кодон. GTP гидролизуется, а EF-Tu-GDP высвобождается, а потом регенирируется. На втором шаге образуется пептидная связь, а связь между ак1 и тРНК разрушается. Этот процесс катализируется в том числе 23S рРНК. Третий шаг – транслокация, т.е. перемещение рибосомы на один кодон к 3’ концу. При этом дипептидил-тРНК оказыватеся в Р сайте. Для транслокации необходим фактор EF-G и энергия, извлекаемая из гидролиза GTP. Далее цикл повторяется. Растущий пептид всегда остается связанным с самой последней пришедшей тРНК. Эта связь необходима для образования новых пептидных связей.

Как рибосома проверяет правильность соответствия кодон-антикодон? Ждет. «Неправильный» комплекс должен развалиться до того, как образуется пептидная связь. На это отводится время жизни комплексов EF-Tu-GTP и EF-Tu-GDP. Здесь опять же возникает компромисс между точностью и скоростью. Если заменить GTP на плохо гидролизуемый аналог, скорость синтеза замедлится. В ходе эволюции этот процесс был оптимизирован. Если же заменить химическим путём ак на несоответствующую данной тРНК, рибосома этого не заметит.

Терминация трансляции. Элонгация продолжается до тех пор, пока рибосома не натыкается на стоп-кодон (UAA, UAG, UGA), идущий сразу после кодона последней аминокислоты. Вместо аминоацил-тРНК этот кодон узнает один из факторов терминации (RF release factor). У прокариот их 3. RF1 узнает UAG и UAA, RF2 UGA и UAA. Они заставляют трансферазу перенести растущую цепь не на новую ак, а на молекулу воды. Таким образом, пептид диссоциирует. Рибосома распадается и готова к образованию нового инициирующего комплекса.

В целом, на образование одной связи тратится 4 фосфатных связи, как минимум (две на активацию, одна на посадку аминоацил-тРНК и одна на транслокацию рибосомы). Это дорого! Потери свободной энергии колоссальны: 4x30.5 кДж/моль – 21 кДж/моль = 101 кДж/моль

РНК транслируется одновременно многими рибосомами, образуя полисомы. У бактерий сопряжение между транскрипцией и трансляцией очень плотное. Трансляция начинается еще до окончания транскрипции. У эукариот всё иначе. Им требуется сплайсинг и процессинг. Чтобы защитить незрелые транскрипты от рибосом и предотвратить напрасный синтез бессмысленных последовательностей, эти процессы разделены пространственно: транскрипция протекает в ядре, а трансляция в цитозоле, где находятся рибосомы.

Свежие пептиды сворачиваются в нативную конформацию, но некоторые из них сначала подвергаются посттрансляционной модификации. Что это за процесс?

1. концевые модификации. Первым остатком оказывается F-Met, что не всегда нужно белку, поэтому его ферментативно убирают. N-концевые аминогруппы часто ацетилируют.

2. утрата сигнальных последовательностей, которые направляют белок к месту назначения.

3. модификация отдельных аминокислот. Это может быть кинирование (фосфорилирование) с помощью АТР (Ser, Thr, Tyr).

4. присоединение боковых полисахаридных цепей.

5. присоединение простетических групп

6. протеолитический процессинг. Многие протеазы синтезируются в виде неактивных предшественников. При расщеплении они превращаются в активную форму.

7. образование дисульфидных сшивок

Некоторые антибиотики могут блокировать трансляцию, вызывая ее преждевременную терминацию. Могут блокировать А сайт.