Інші ферменти, що мають безпосереднє відношення до генної інженерії.

Лігази та дезоксинуклеотидилтрансфераза.

Одержані за допомогою рестриктаз фрагменти використовують для створення рекомбінантних молекул.

Існують різноманітні методи з'єднання нарізаних рестриктазами фрагментів у цілісну структуру. Фрагменти з липкими кінцями, які одержані за допомогою однієї рестриктази, можуть гібридизуватися один з одним або їх зшивають кінцевою дезоксинуклеотидилтрансферазою. Фрагменти з рівними краями з'єднують Т—4-лігазою (див. рис. 97). Вдається також зшивати фрагменти з рівними і липкими кінцями (рис. 100). Спочатку за допомогою ДНК-полімерази липкий кінець добудовується і стає рівним, а потім з'єднується з іншим Т—4-лігазою.

Отже, проблема нарізування генетичного матеріалу та його зшивання успішно розв'язана.

Давно було помічено. Що бактерії здатні руйнувати (гідролізувати) чужу ДНК, що потрапляє в клітини. Гідроліз здійснюють ендонуклеази. Вони зв’язуються з чужою ДНК в специфічних ділянка – сайтах розпізнавання і розщеплюють (ріжуть) її на фрагменти (рестрикти). Ці фрагменти були названі рестриктазами. Постає питання: чому вони не ріжуть власну ДНК. Власну ДНК вони не руйнують тому, що їхня ДНК захищена певним чином від дії рестриктаз. Для того, щоб рестриктаза не різала власну ДНК природа придумала одну хитрість: сайти розпізнавання модифікуються за допомогою метилаз. Цей процес називають метилюванням. Він полягає в тому, що до одного з нуклеотидів А або Ц приєднується метильна (-СН3) група і модифікована таким чином ДНК клітини не «боїться» своїх власних рестриктаз. Цікаво, що кількість метильованих основ ДНК дуже мала – 1 на тисячі.

Виявилося, що за допомогою метилази бактерія мітить (метилює) також ДНК фага, який дозріває в ній. Бактерія робить це немовби собі на шкоду. Якщо метилазу вивести з ладу (шляхом мутації відповідного гена), то фаги, що дозрівають усередині клітини, виявляються неіенфекційними.

ДНК-полімераза складається з 1 поліпептидного ланцюга. Він здатен синтезувати ланцюг ДНК на однонитчастій матриці в напрямку від 5 до 3 кінця в присутності відповідних нуклеотидів в реакційному середовищі. Вперше виділений з E. coli. Використаний у 1957 р. для синтезу ДНК in vitro (Корнберг, Нобел. премія).

ДНК-лігази складаються з 1 поліпептидного ланцюга і «зшивають» розриви ДНК, використовуючи енергію АТФ. Використовують для з’єднання рестриктів з тупими кінцями.

Дезоксинуклеотидилтрансфераза використовується в генній інженерії для «зшивання» фрагментів з «липкими кінцями».

 

Лекція №4 (4 год)

 

Питання для самоконтролю та самоперевірки:

  1. Що означають терміни реплікон, реплікація?
  2. Як відбувається реплікація ДНК в еукаріотів?
  3. Що таке помірні фаги? Яка різниця між фагами, що викликають специфічну та загальну трансдукцію?
  4. Яку роль виконують плазміди в життєдіяльності бактеріальних клітин? З якою метою їх використовують в генетичній інженерії?