МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ


Морфогенез в каллусных тканях

Клетки каллусной ткани, готовые отвечать на факторы питательной среды называют компетентными или инициальными. Инициальная клетка под воздействием питательной среды вступает в морфогенез. Морфогенез может проходить 2-мя путями: 1) органогенез; 2) соматический эмбриогенез. Органогенез может быть стеблевым (в этом случае из каллусной ткани дифференцируется вегетативная почка) , корневым ( в этом случае возникает корень, но получить целое растение при корневой органогенезе невозможно), флоральным (сразу формируется цветочная почка) или листовым (формируются листья).

Соматический эмбриогенез – развитие зародыша из соматической клетки, в том числе из каллусной.

При органогенезе в каллусной ткани (или непосредственно в клетка экспланта) формируется монополярная структура (рис.1). Монополярная структура возникает путем деления инициальной клетки на изодиаметриальные дочерние клетки. Инициальная клетки отличается от клеток прилежащих большими размерами, крупным ядром; эта клетка обособляется от остальных утолщенной оболочкой, между прилежащими клетками начинают формироваться плотные межклеточные контакты, которые обеспечивают приток питательных веществ к меристематическому очагу. Т.о. меристематический очаг превращается в аттрагирующий центр.

При соматическом эмбриогенезе вместо монополярной формируется биполярная структура (рис.2). Биполярная структура имеет 2 меристематических очага, в которых развиваются зачатки стебля и корня.

1. Преимущества этого метода: получение генетически однородного посадочного материала, освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры, высокий коэфф.размножения (для травянистых растений коэф.=105 , 106, для древесных 104 105 , для хвойных 104 ), сокращение продолжительности селекционного периода, ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития, возможность размножения растений трудноразмножаемых обычными способами, возможность проведения работ в течение круглого года и экономия площадей для получения посадочного материала, возможность автоматизации процесса выращивания.

Ювенильная фаза длится от момента прорастания семени до репродукции. В условиях in vitro с момента появления проростка до репродукции.

2. Этапы и методы клонального микроразмножения растений.

Этапы:

1) Выбор растения донора, изолирование экспланта, получение хорошо растущей стерильной культуры

2) Собственно микроклональное размножение. Здесь достигается максимальное получение меристематических клонов (мериклонов)

3) Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией растений к почвенным условиям, температурным факторам.

4) Выращивание растений в условиях теплицы, подготовка к посадке или реализации

Методы микроклонального размножения:

1) Активация развития уже существующих в растении меристем (точек роста). Рис. 3. Для получения безвирусного посадочного материала чаще всего используют стеблевую меристему. В меристеме содержится минимальная концентрация вирусных частиц (или их нет вовсе). В этих клетках содержится минимальная концентрация токсинов. Эти клетки программированы на получение клеточной массы. (рис. 4). Суть метода заключается в последовательном переносе в новую питательную среду вновь возникающих побегов и почек следующего порядка. Чтобы активировать появление новых побегов, почек в питательную среду вносят цитокинин. Можно активировать развитие боговых побегов, удаляя верхушечную почку побегов, от которых отбирают побеги нового порядка. Метод разработан на сахарной свёкле, табаке, картофеле, томатов, перца, тыкве, огурце, гвоздике, хризантеме, розе, гербере, чае, яблоне, сливе, вишне, винограде, смородине, малине, тополе, березе, рябине, можжевельнике и др.

На производственную основу метод поставлен на картофеле, из одной меристемы картофеля можно получить 100 тыс. растений в год. Разработанная технология позволяет получить микроклубни в качестве ценного безвирусного посадочного материала. Избавиться от вирусной инфекции можно только методами микроклонального размножения, такой посадочный материал дает урожайность на 40-50% больше зараженного.

2) Индукция возникновения адвентивных почек тканями экспланта. Адвентивные почки возникают из любого фрагмента растения, в том числе из тех фрагментов, которые в условиях in vivo не закладывают почек. Этот метод основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и регенерировать целые растения. Питательная среда должна содержать только цитокинин или цитокинин и ауксин в соотношении 10:1 или 100:1. Метод разработан на многих луковичных растениях (из луковичных чешуй получены растения нарцисса, лилии, гладиолусы, тюльпаны; из фрагментов донца луковиц получены лук, чеснок; луковичные растения получают из верхушечной меристемы, фрагментов листьев, из фрагментов листьев получены капуста цветная, кочанная, брюссельская, листовая, фиалки, из фрагментов зародышей получают представителей древесных растений). На промышленную основу поставлено получение безвирусной земляники. Меристематические верхушки изолируют от здоровых растений выращивают в среде М-С. содержащий цитокинин. Через 3-4 недели меристема развивается в проросток, в основании проростка формируются адвентивные почки, они быстро растут и дают начало новым почкам, почки связан между собой соединительной тканью, почки развиваются в листья на коротких черешках. У основания черешков снова формируются адвентивные почки. Почки рассаживают в свежую питательную среду. Если в питательную среду не включать цитокинин, то через 4-6 недель формируются нормальные растения с корнями и листьями. Если же почки пересаживают в среду с цитокинином индукция адвентивных почек продолжается. Морфогенетическая активность экспланта сохраняется в течение 3-4 лет. За один год можно получить несколько млн. растений земляники

3) Индукция соматического Эмбриогенеза. Соматический эмбриогенез приводит к появлению в клетках экспланта или каллуса эмбриоидов (зародыше подобные структуры). Эмбриоиды возникают неполовым путем, развиваются в питательной среде, а не в семяпочке, не переходит в состояние покоя, а дают начало проростку.

Питательная среда содержит ауксин, под влиянием которого клетки репрограммируются в эмбриональные. На последующих этапах концентрацию ауксина снижают или полностью его исключают из среды. В безгормональной среде после индукции двух меристемных очагов происходит дифференциация зародыша. В двух точках меристематического роста в достаточных количествах синтезируются ауксины и циоткинины, обеспечивающие дифференциацию зачатков зародыша.

Заключается в индукции эмбриоидов в тканях экспланта или в каллусе. В отличие от остальных методов, соматический эмбриогенез позволяет получить растения с корнями сразу с момента прорастания зародыша (не требуется 3 этап микроклонального размножения). Т.о. из соматического зародыша можно получить растения в кратчайшие сроки. Эти растения отличаются повышенной способностью в адаптации.

Для того, чтобы инициировать эмбриогенез в клетках в питательную среду вносят аналог ауксина 2,4 – Д, под действием этого фактора соматические клетки репрограммируются в эмбриональные. Инициированная клетка ведет себя как зигота. В процессе формирования первичных структур зародыша формируются два меристемных очага. Возникшую биполярную структуру переносят в среду без гормонов. В точках меристемного роста активно синтезируются ауксины и цитокинины. Т.о. зародыш в безгормональной среде развивается самостоятельно без участия аналогов фитогоромнов

4) Дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной тканях

Основан на регенеративной способности растений. Используется редко, т.к. каллусная ткань не стабильна, и , являясь основой для растений, формирует сомаклоны, которые отличаются от исходных растений. Этот метод может быть рекомендован для размножения культур, у которых вариабельность признаков растений ретордантов подобно вариабельности признаков растений in vivo. К таким культурам относят сахарную свёклу, томаты, рис, подсолнечник, лён, пшеница, некоторые древесные формы. Преимущество этого метода – возможность размножения растений в тех случаях, когда остальные методы поставить невозможно. Например, если в качества экспланта используется небольшой фрагмент редкого растения. Метод используется в клеточной селекции для получения разнообразных вариантов исходного растения, в том числе мутантных.

Почки переносят в питательную среду, если в питательной среде не содержится аналоги фитогормонов, то на таких средах появляются нормальные растения с корнями и листьями; если же в питательной среде содержится аналог цитокинина БАП, то пролиферация (размножение) адвентивных почек.

29.09.11