Методы физиологии растений
Физиология растений относится к числу экспериментальных наук. Экспериментом в физиологии называют изучение физиологического явления в искусственно создаваемых условиях. При этом может изучаться либо отдельная функция (фотосинтез, дыхание и т.д.), либо воздействие отдельного фактора на комплекс функций, или влияние комплекса воздействий на жизнедеятельность растения в целом (например, антропогенные воздействия). Опыты могут быть лабораторными и полевыми.
Лабораторные эксперименты позволяют глубоко исследовать явления, происходящие на клеточном субклеточном и молекулярном уровнях.
К современным приемам и методам исследования относятся:
Световая микроскопия – приготовление тонких окрашенных срезов (разрешающая способность – 0,2 мкм х 2000 раз).
Электронная микроскопия – обычные приемы – фиксация быстрым замораживанием, скол и травление напылением ионов тяжелых металлов (500-800 А˚, - обычно рассматриваемые объекты, разрешающая способность 3-10 А˚, увеличение 1000000 раз).
Разрешающая способность светового микроскопа ограничена длиной световых волн. Максимально возможное разрешение равно ½ λ используемого света. Средняя λ видимого света составляет примерно 550 км, поэтому удавалось получить разрешение примерно в 200 км. Однако многие клеточные структуры имеют меньший размер. Эта проблема была разрешена в 30-40 годы, когда создание электронного микроскопа произвело революцию в биологической науке. Вместо света в электронном микроскопе используют пучок электронов, у которых λ значительно меньше, следовательно разрешительная способность больше, примерно в 500 раз больше.
Подготовка материала к исследованию включает следующие приемы:
1. Срезы готовятся на ультратоме окрашиваются соединениями тяжелых металлов. Окрашенные участки становятся непроницаемыми и на микрофотографиях они выглядят темными.
2. Напыление. Образец бомбардируется атомами тяжелых металлов, например золотом или платиной, под определенным углом. Закрытые площади + «тень» за образцом остаются прозрачными для электронов.
3. Замораживание – скалывание и замораживание – травление.
Фрагмент ткани быстро замораживается при очень низкой температуре и затем разламывается с помощью острого металлического лезвия. Ткань растрескивается вдоль слабо соединенных плоскостей. В вакууме лед возгоняется, оставляя сколотую поверхность. Реплика этой поверхности создается слоем углерода. На эту реплику из углерода напыляется тяжелый металл, а также под репликой разрушаются кислотой. Этот метод удобен при изучении структуры мембран. Его преимущество состоит в том, что ткани быстро умерщвляются, не подвергаясь химической обработке, которая может повлиять на их структуру.
Дифференциальное центрифугирование. Широко используют для исследования биохимических и физиологических механизмов работы клетки. При этом клеточные фракции сохраняют свою морфологическую и функциональную целостность.
Хроматография – разделение веществ /бумажная, колоночная/.
Метод хроматографии впервые предложен русским ученым Цветом в 1906 году и сейчас широко используется.
Хроматография – это метод, применяемый для разделения различных смесей на составляющие их компоненты. Метод основан на том, что в неподвижной среде, через которую протекает растворитель, каждый из компонентов, увлекаемых растворителем, движется со своей собственной скоростью независимо от других.
В качестве неподвижной среды /адсорбента/ могут быть использованы различные вещества: сахароза, окись магния, крахмал, стекло, бумага и т.д. Подвижность вещества зависит от его растворимости в растворителе, пропускаемом через адсорбент и адсорбируемости на данном адсорбенте. Чем выше растворимость вещества в растворителе, тем хуже он адсорбируется на адсорбенте, тем больше его подвижность. Применяя разные комбинации растворителей и адсорбенты различной природы, можно добиться высокой степени разделения.
Метод меченых атомов – введение радиоактивной метки и обнаружение ее при помощи массспектрометра.
Вегетационный опыт – опыт, проводимый в сосудах, где экспериментатор дозирует и контролирует количество питательной среды для выращивания растений, ее качественный или количественный состав и т.д. Если опыт ведется в теплице, то регулированию поддается свет и температура.
Вегетационные опыты позволяют установить закономерности роста и развития растений от изучаемого фактора.
Полевой опыт – ведется в полевых условиях (природных). Ввиду пестроты природных условий: неоднородность почвы, склоны, вредители, осадки и т.д. – точность полевого опыта значительно меньшая.