Лекция 1. Введение

Важнейшие группы прокариот

Облік довгострокових фінансових інвестицій

Бутинець. Бухгалтерський фінансовий облік

Етапи та порядок загального ведення бухгалтерського обліку довгострокових фінансових інвестицій, наведено на рис.

Рис. Загальна схема бухгалтерського обліку довгострокових фінансових
інвестицій

Прокариоты. Общие представления. Прокариоты – самые мелкие из биологических объектов, обладающие клеточным строением. Размеры клетки составляют в большинстве 1‒10 мкм. Крайние вариации составляют от 0.2 мкм до 300‒750 мкм (Thiomargarita namibiensis – донная океаническая протеобактерия). Молодые клетки мелких бактерий составляют от 0.2‒0.3 мкм в длину. Плазматическая мембрана образует впячивания различной морфологии внутрь клетки (ламинарные, тубулярные, везикулярные). На таких впячиваниях обычно протекают процессы дыхания и фотосинтеза. Цитоплазма неподвижна (нет циклоза). Микротрубочки отсутствуют. Рибосомы 70S типа, располагаются в цитоплазме. Экзоцитоз, эндоцитоз и псевдоподии не обнаружены. Ядра и ядерная мембрана отсутствуют. Геном организован компактно, поскольку жизненный цикл упрощен и клетки не претерпевают на протяжении жизни сложных дифференцировок, которые требуют переключения экспрессии генов. Для кодирования белков нередко используются две или все три рамки считывания одной и той же последовательности, что повышает кодирующий потенциал генома без увеличения его размера.

Thiomargarita namibiensis (стрептококки)

Среды обитания. Среды обитания прокариот ‒ океаны, реки, озера, почва, поверхность растений, атмосфера. Основная среда обитания – почва и океаны.

Роль физиологических и морфологических признаков в определении видов бактерий. Чем проще устроен организм, тем сложнее его определить на основе морфологии. Главная особенность прокариот при определении по фенотипу до уровня вида – главное значение имеют физиологические признаки (т.е. наличие или отсутствие определенных типов ферментов). Фактически, от уровня видимой под микроскопом морфологии при определении приходится спускаться до уровня биомолекул.

Фенотипическая и филогенетическая систематика прокариот.Биологическая систематика, дисциплина, которая занимается построением систем живых организмов и вирусов – это один из самых динамичных разделов биологии. С самого своего возникновения системы предлагались, отвергались и пересматривались, и процесс разработки систем столь же бесконечен, как и само познание. Если у высоко организованных групп живого системы в последние десятилетия изменялись сравнительно мало, то у примитивных и простых организмов изменения были просто революционны.

Долгое время в микробиологии господствовала фенотипическая систематика бактерий, основанная на сходстве по совокупности морфологических признаков. Как оказалось, такая система искусственна, как когда-то была искусственна. Роль филогенетической системы: предсказание физиолого-биохимических свойств мало- или неизученных микроорганизмов по их генотипическим признакам.

Роль филогенетического подхода на основе молекулярных признаков в том, что он позволяет более точно оценить ранг таксонов (например, порядок, класс или отдел) и время их дивергенции от общего предка. В результате, как правило, количество высших таксонов по мере изучения бактериальной биоты (бактериобиоты) увеличивается. В отдельных случаях таксоны понижаются в ранге (см. упразднение отдела Thermomicrobia).

Построение естественной, филогенетической системы, т.е. отражающей наиболее вероятный ход эволюции, стало возможным на основе генотипических (молекулярно-генетических) признаков. Эти признаки (в историческом порядке) таковы.

Специфичность нуклеотидного состава (доля ГЦ-пар в геноме). Первые данные о такой специфичности появились в конце 50-х годов XX века. Процент ГЦ пар – это самая первая из разработанных характеристик генома, которая стала использоваться в систематике прокариот. Оказалось, что организмы с различающимся %ГЦ пар относятся к разным видам, а у неродственных видов могут быть сходные значения нуклеотидного состава. Поэтому метод не помогает установить связи дальнородственных видов. Тем не менее, по сей день определение %-ного содержания (молярного %) ГЦ пар является частью стандартной процедуры описания таксонов бактерий.

Метод определения: (1) по кривой плавления ДНК; (2) путем гидролиза ДК и разделение нуклеотидов; (3) путем жидкостной хроматографии; (4) путем определения плавучей плотности; (5) через бромирование. Общее число пар ГЦ является постоянной характеристикой данного вида бактерий.

Содержание ГЦ для прокариот варьирует от 20 до 80%. Показано, что микроорганизмы, различающиеся между собой более чем на 10% по доли ГЦ, не принадлежат к одному роду. Штаммы одного вида не различаются между собой более, чем на 5%.

ДНК-ДНК гибридизация (тотальной ДНК). Многочисленные данные подтверждают высокую корреляцию между результатами ДНК-гибридизации и фенотипическими характеристиками. В этом методе выделяется тотальная клеточная ДНК и фрагментируется ультразвуком на отрезки длиной 300-350 п.н. Саузерн-блот гибридизация: Фрагменты переводятся в одноцепочечное состояние (цепи реассоциируются). Одноцепочечную ДНК фиксируют на нитроцеллюлозном мембранном фильтре. ДНК сравниваемого штамма также реассоциируют, и, кроме того, каждый из фрагментов химическим путем связывается с радиоактивной меткой. Меченые радиоактивным изотопом фрагменты ДНК другого организма денатурируют и раствор (в буфере) наносят на фильтр с фиксированной ДНК. Реакцию гибридизации проводят в специальных условиях (оптимальные условия – около 25С ниже температуры плавления нативной ДНК). Негибридизировавшие фрагменты отмывают. Путем авторадиографии (в жидкостном сцинтилляционном счетчике) оценивают количество образовавшихся гибридов. Уровень гибридизации между ДНК одного и того же штамма (гомологичной ДНК) принимают за 100%.

Оказалось, что последовательности ДНК бактерий, различающиеся более чем на 20%, практически не реассоциируют. Метод также не позволяет установить отдаленные родственные связи видов, а позволяет оценить границы видов, т.е. отношения внутри рода; иногда можно оценить границы родов бактерий. При значительной выборке и для хорошо изученных видов бактерий уровень ДНК-ДНК гибридизации 70% и выше характеризует штаммы одного вида, 10-60% - виды одного рода, менее 10% - виды разных родов.

Молекулярная гибридизация 16S рРНК. Рибосома прокариот состоит из 3 субъединиц, большой (23S), (5S) и (16S). Prokaryotes have 70S ribosomes, each consisting of a small (30S) and a large (50S) subunit. Their small subunit has a 16S RNA subunit (consisting of 1540 nucleotides) bound to 21 proteins. The large subunit is composed of a 5S RNA subunit (120 nucleotides), a 23S RNA subunit (2900 nucleotides) and 31proteins. Консервативность (слабая подверженность мутациям) цистронов, кодирующих рРНК у бактерий была открыта в 1965 г. Doi, Iragashi, Dubnau.

Ген 16S рРНК обладает следующими свойствами, важными в филогении:

1. РНК рибосом универсальна для разных видов, как и сами рибосомы.

2. Молекула 16S рРНК – консервативна и наименее подвержена изменениям в ходе биологической эволюции. Скорость изменения гена 16S рРНК у различных бактерий-симбионтов составила 2-4% замен нуклеотидов в течение 60 млн. лет.

3. Ген 16S рРНК имеет как ультраконсервативные, так и вариабельные области (домены), что дает возможность оценивать отдаленные и близкие родственные отношения.

4. Кроме того, было установлено, что цистроны рРНК не вовлекаются в процессы межвидового генетического переноса.

5. Размер гена (у прокариот он примерно 1550-1640 п.н. длиной) оптимален с точки зрения снижения статистических ошибок. Полный сиквенс можно определить за одно секвенирование методом Сэнгера.

Сравнение нуклеотидных каталогов. Метод применялся в начале 80-х годов и имел большое историческое значение в систематике бактерий. При этом молекула РНК (16S рРНК) обрабатывалась рибонуклеазой Т, расщепляющей молекулу по остаткам гуанина. Размер полученных фрагментов составлял не более 20 нуклеотидов. Полученные олигонуклеотиды разделяли путем 2-мерного электрофореза, секвенировали, и составляли каталог, специфично характеризующий молекулу рРНК. При сравнении каталогов учитывались фрагменты длиной не менее 6 нуклеотидов. Путем применения коэффициентов сходства между каталогами впервые было построено общее филогенетическое дерево для прокариот.

Секвенирование ДНК. Наиболее распространенным объектом для молекулярной систематики стали сиквенсы молекулы 16S рДНК. Ее длина у разных бактерий составляет 1550-1640 п.н. Cиквенсы 16S рДНК сейчас являются общеупотребимым маркером для филогенетической систематики. Сходство сиквенсов оценивают или путем простой %-ной оценки, или после выравнивания. Было показано, что если штамм имеет менее чем 97% сходства по 16S рДНК с ближайшим филогенетическим соседом, то уровень ДНК-ДНК гибридизации между штаммами не будет превышать 70%. Отмечено также, что в ряде случаев штаммы разных видов одного рода, с уровнем ДНК сходства при гибридизации ниже 70% имели полностью идентичные 16S рДНК. Такая закономерность особенно наблюдается среди штаммов из схожих экологических ниш.

Требования к качеству сиквенсов: при описании новых таксонов рекомендуется определять не менее 1300-1400 нуклеотидов 16S рДНК, с менее чем 4% двусмысленных позиций и менее чем 10 пропущенных нуклеотидов.

Роль секвенирования в метагеномике. В последние годы начал распространяться метод прямого секвенирования образцов биоматериала, взятого из мест обитания, без выделения прокариот в культуру. На основе полученного набора сиквенсов 16S рДНК можно судить о наборе видов в сообществе, и выявлять филогенетическое положение организмов, не поддающихся культивированию вообще или не известных в культуре. Филогенетические данные могут помочь предугадать условия для культивирования таких организмов. Изучение сообществ через секвенирование и последующий филогенетический анализ называют метагеномикой.

Рибопринтинг. Метод основан рестрикционном анализе генов рРНК. Для этого выделяют тотальную ДНК из клетки. Берут два праймера, гомологичных к высоко консервативным, фланкирующим участкам 16S рРНК (small subunit - ss rDNA) гена и проводят ПЦР. Фрагменты обрабатываются несколькими эндонуклеазами рестрикции, и продукты рестрикции для каждой из эндонуклеаз разделяются в агарозном геле вместе с профилем размерного стандарта ДНК. Полиморфизм длин фрагментов возникает благодаря тому, что часть сайтов рестрикции попадают в консервативные домены гена, а часть – в вариабельные домены. При этом часть фрагментов будут общими для всех видов в выборке. По количеству общих и различающихся фрагментов можно вычислять генетическую дистанцию между видами. Применение 12 рестриктаз с сайтами узнавания длиной в 4 нуклеотида позволяет охватить анализом 10-15% длины гена 16S рРНК, не прибегая к секвенированию.

Выделение домена архей. До 1970-х годов было общепризнаным деление всего живого на прокариот и эукариот. В 1970 г. Woes и Fox на основе олигонуклеотидных каталогов 16S рРНК показали, что все прокариоты делятся на 2 домена: Archaea (Archaebacteria) и Bacteria (Eubacteria). В 1990 г. Woese, Kandler, Wheelis предложили разделять микроорганизмы на 3 доминиона (домена) - Archaea, Bacteria, Eukarya, поскольку они рассматривались как 3 самостоятельные линии развития.

Таксономический вес признаков. Как оказалось, ряд распространенных ранее в систематике бактерий признаков имеют малый таксономический вес (низкую дифференциирующую способность).

Используемые в систематике бактерий методы разрешают таксоны на следующих уровнях: