Мутации ДНК.

ДНК.

Лекция №7

Нуклеиновые кислоты: ДНК и РНК.

Отличаются структурой составом, нахождением и функциям.

По составу:

· При гидролизе РНК образуется углевод рибоза, азотистые основания аденин, гуанин, урацил и цитозин и фосфорная кислота.

· При гидролизе ДНК образуется углевод дезоксирибоза, аденин, гуанин, цитозин и тимин.

Нахождение:

· ДНК на 99,9% находится в ядре клетки.

· РНК может быть и в ядре клетки, где она образуется на соответствующем участке ДНК, в цитоплазме, в рибосомах.

Функции:

· ДНК – носитель информации клетки, на ней находится вся информация. Это хранительной информации о организме.

· РНК (транспортные – в цитоплазме транспортируют аминокислоты к месту синтеза белка, матричные – является матрицей для синтеза белка, рибосомальные – являются составной частью рибосом).

ДНК была впервые открыта Фридрихом Мишером в 1869 г. Более подробно ДНК изучено ещё в XX веке.

Первые работы, которые приводят к решению Чаргаффом и его сотрудниками в колумбийком университете. Выводы:

· Нуклеотидный состав ДНК является характеристикой данного биологического вида.

· В различных клетках и тканях одного и того же организма ДНК имеет идентичный состав, на него не оказывает влияния ни стадия развития, ни возраст, ни рацион питания, ни другие факторы и условия.

· У близкородственных организмов близок и нуклеотидный состав ДНК.

· Относительное содержаний различных оснований в ДНК колеблется у разных организмов колеблется в широких пределах (речь идет об отношении A+T к Г+С, может быть от 0,9 до 1,7). Наименьшие колебания у высших организмов.

· Химический состав всех типов ДНК обнаруживает определенные закономерности, выраженные правилами Чагаффа

Правила Чаагаффа:

1. Сумма пуриновых оснований равна сумме перимидиновых.

2. А=Т, Ц=Г

3. A+C=Г+Т

· Если ДНК не соответствует правилам Чагаффа, то она должна обладать какими-то необычными структурными особенностями.

В 1953 году Уотсон и Григ и независимо от них Уилкинс (занимался рентгеноструктурными исследованиями ДНК), эти авторы сделали вывод, что ДНК это двухцепочечная молекула, представляет собой двойную правозакрученную спираль. Азотистые основания располагаются внутри спирали в виде стопки, причем две полинуклеотидные цепи антипараллельны. Фосфатные гидроксилы находятся снаружи спирали и сообщаются с окружающей средой. Азотистые основания с остатками дезоксирибозы располагаются внутри спирали. Комлементарные по отношению друг другу азотистые основания.

В силу пространственных ограничений соединяться водородными связями могут только вполне определенные основания А с Т и Г с Ц.

По модели Уотсона и Крига ось спирали находится перпендикулярно к плоскости азотистых оснований. Это жесткая спираль. Разрыв одной водородной вязи не приводит к разрушению структуры. Уилкенс на основании РСА пришел к выводу, что ДНК имеет такую структуру. В зависимости от условий выделения ДНК может бить и другая структура белка. Существует A, B, C, T и Z форма. B-форма – это структура Уотсона и Крига. При дегидратации образуется структура A, она предполагает длину витка 2,8 нм и 11 пар азотистых оснований. Угол между осью и азотистыми основаниями 20◦. Z(T)-форма это левозакрученная двойная спираль, предложена Александром Ритчем на основании изучения кристаллической ДНК.C-форма сходна с B-формой, только там 9 пар азотистых оснований. В зависимости от условий изучения структуры форма может быть разной.

Это изменение в последовательности оснований в ДНК. Мутации могут происходить либо в результате замещения одного основания на другое либо вставки других оснований. Наиболее распространено одной пары оснований на другую.

Ошибки могут быть вызваны изменением структуры оснований, например таутомерным сдвигом от кето- к енольной форме в момент спаривания. Измененное основание может присутствовать в матрице ДНК либо в поступающем для синтеза дезоксирибонуклиотиде.

Например, вследствие редкой лактимной форме Тимина давать пару не с аденином, а гуанином.

Денатурация ДНК.

Молекула представляет собой спираль. При определенных условиях (нагревании, действии агрессивных сред) происходит денатурация – расплетание двойной спирали, разрываются водородные связи. Происходит плавление ДНК, изменяется плотность раствора и свойства растворов. Процесс сплетания происходит очень медленно, но как только на каком-то фрагменте будет найдено соответствие, то восстановление структуры происходит очень быстро.

Процесс транскрипции – это расплетание молекулы ДНК в размерах определенного гена и снятие информации с цепочки при синтезе матричной (информационной) РНК. По принципу комплементарнойсти подходят азотистые основание за счет образования водородных связей. Фермент полимилаза сшивает эти нуклеотиды и получается информационная РНК. Информация в ней также, что и в цепочке ДНК, транскрипция гена с определенного участка ДНК, дальше в рибосомы.

По принципу комплементарности на каждой из материнских цепей строятся дочерние молекулы ДНК, новая цепь, которая содержит материнскую ДНК при делении клетки

В клетке человека в 600 раз больше ДНК, чем в бактерии кишечной палочки. Общая физическая длина человеческой ДНК составляет 2*10^(10) км. Вся ДНК больше, чем расстояние от земли до солнца. Вся информация находится в гена. Большая часть ДНК непонятно, что собой представляет.

Секвенирование – определение нуклеотидных последовательностей. К концу XX века полностью секвенированы геномы почти 50 видов живых организмов. Определены нуклеотидные последовательности во всех транспортных РНК. Полная нуклеотидная последовательность ДНК была определена в 1977 году для мелкого бактериофага ФX174 (баткриальный вирус) Сенджером. Это открытие знаменовало собой начало новой эры в биохимической генетике. Размер ДНК этого бактериофага 5386 аминокислотных остатков. ДНК фага содержит 9 генов, имеются перекрывающиеся гены и гены внутри генов.

В настоящее время можно определить последовательность нуклеотидов в любой ДНК. Для этого есть соответствующие методы, компьютерные программы. Роботы и особый изощренный математический аппарат.

Успехи были достигнуты в результате трех открытий:

1. Выделение особых рестриктирующих эндонуклеаз, т.е. ферменты, расщепляющие полинуклеотидные цепи в определенном месте, например между A и T, между пуриновым и перимидиновым основанием. Разная нуклеаза расщепляет в определенном месте, известно более 150 таких эндонуклеаз. Имея только две эндонуклеазы моно расщепить разными способами с образованием перекрывающихся последовательностей.

2. Усовершенствование электрофоретических методов разделения фрагментов ДНК в соответствии с числом содержащихся в них нуклеотидных остатков. Эти методы обладают настолько высоким разрешением, что позволяют разделить ДНК размером 200 нуклеотидов. Электрофоретическое разделение производят на пластинке полиакриламидного геля (РИС 5).

полиакриламид

Чем короче олигонуклеотид, тем быстрее он движется к положительному электроду, изменяя плотность полиакриламидного геля данную процедуру можно использовать для разделения длинных олигонуклеотидов.

3. Разработка методов клонирования ДНК. Эти методы сделали возможным получение достаточно больших количеств чистых генов, т.е. исходного материала для секвенирования. В настоящее время существует два метода (биологический (Сенджера) и химический (Максама-Гилберта)).

Принцип метода Максама-Гилберта.

Олигонуклеотид состоит из 10 нуклеотидов.

Г-А-Т-Ц-А-Г-Ц-Т-А-Г.

Вводим радиоактивную метку на 5’ конец (P³²):

Ф-Г-А-Т-Ц-А-Г-Ц-Т-А-Г.

Меченый олигонуклеотид разделяют на 4 порции: первую порцию подвергают химической обработке, в результате которой олигополинуклеотид распадается на небольшие куски со статистическим выщепленеим по С, при таком расщеплении можно получитьследующую цепь:

ФГ, АГЦ, АГЦ, ТАГ;

ГАГ ЦАГ, ГАГ, АГ.

Вторую порцию исходного плинуклеотида подвергают другой химической обработке, в результате которой расщепляються только остатки по гуанидину.

ГАТЦА, ГАТЦАГЦТА.

Третья порция – статистическое выщепление по А:

ГАТЦ, ГАТЦАГЦТ Г

Высщепление по Т

Имеем четыре различных смеси меченых фрагментом. Каждую из четырех этих смесей подвергают электрофорезу на пластинке геля. Обеспечивающей четкое разделение по количеству нуклеотидов в фрагменте независимо от качества.