РЕПЛИКАЦИЯ ДНК ПАРВОВИРУСА (ААV-2)
Варианта вирусных частиц
РЕТРОИДНЫЕ (ПАРАРЕТРО) ВИРУСЫ.
( СОДЕРЖАТ ДНК, НО КОДИРУЮТ ОБРАТНУЮ ТРАНСКРИПТАЗУ)
Эти вирусы используют матричную РНК, построенную на матрице ДНК не только для синтеза белков, но и для репликации дочерних геномов вируса.
Общие свойства параретровирусов:
Кольцевая частично двунитевая геномная ДНК: т е есть одно кольцо полностью и второе, комплементарное ему, незамкнутое и не соответствующее полностью по длине (-)ДНК.
• Небольшой размер генома – примерно 3000-8000 нуклеотидов.
• Обратная транскриптаза (RT) присутствует в составе вирионов.
• Нет необходимости встраиваться в хозяйскую хромосому для успешной репликации. Репликация происходит в цитоплазме, ДНК при этом образует в ядре зараженной клетки эписому – сверхспирализованную замкнутую 2-цепочечную структуру, которая необходима для транскрипции.
• Группа VII ( по Балтимору)
Обнаружены и у животных и у растений. Организованы в 2 семейства:
• Семейство Hepadnaviridae,(заражают только гепатоциты), передаются через кровь, половым путем и вертикально (от матери к ребенку)
род Orthohepadnavirus (млекопитающие) и
род Avihepadnavirus (птицы).
HBV, вирус гепатита B. Вирионы – икосаэдр,
покрытый липидной оболочкой.
• Семейство Caulimoviridae, 7 родов. CaMV,
cauliflower mosaic virus, вирус мозаики цветной капусты. Икосаэдрической или бацилловидной формы, липидная оболочка
отсутствует, заражают растения
род Badnavirus
• 1 – инфекционные частицы Дейна ~42 нм;(70% приходится на белок S). Австралийский ген, или HВsAgв крови говорит о носительстве вируса гепатита В и о риске образования карциномы печени.
К 5 концу (-)цепи присоединен белок Р (полимераза, по сути ревертаза). На 5 конце (+) цепи находится фрагмент РНК, т о + и – цепи используют различные затравки для своей репликации.
• 2 – неинфекционные сферические 20нм, это HВsAg (почти только S белок) и мембрана и все. Они накапливаютя, 10 тыс – 1 млн на 1 частицу Дейна, полезно для диагностирования.
• 3 -нитевидные различной длины диаметром 20нм.
Вирионы 2 и 3 содержат только поверхностный антиген HBsAg (S-белок) без геномной ДНК и белка сердцевины (core) и
присутствуют в большом избытке.
Еще раз о белках: HВsAg
3 поверхностных антигена – L(39кДа),M(31кДа),S(24кДа).
• Антиген S – основной компонент оболочки: L и M составляют 2% и 5-10% от общего количества.
• Антиген L необходим для связывания с клеточным рецептором и для созревания вирусных частиц. Взаимодействует с коровой частью вириона и приводит к его переносу через мембрану эндоплазматической сети.
· После попадания в ядро неполная (+) нить ДНК достраивается до полного размера, рибонуклеотидный праймер удаляется с ее 5 конца.
· С 5 конца (-) ДНК удаляется молекула полимеразы
· Все разрывы в молекулах лигируются с помощью ферментов клетки
· Двуцепочечная ДНК вируса гепатита В сверхспирализуется тоже с помощью ферментов клетки, находящихся в ядре
· Итак, в виде такой эписомы ДНК служит матрицей для транскрипции
· Эта эписома в ядре может реплицироваться, но в незначительном количестве, основная репликация вирусного генома будет происходить в цитоплазме
ORF – открытая рамка считывания, HВsAg – зеленый
Есть несколько ORF:
ORF P - revertase.
ORF S/preS - гликопротеиды оболочки
ORF C - белок нуклеокабпсида, С-белок
ORF X HBX, 17 кда, неструктурный белок, трансактиватор экспрессии
генов, основной фактор онкогенного потенциала гепатита Б. Геном
вируса гепатита Б 3.5 кб - небольшой. Здесь опять используется
перекрывание генов - все гены перекрываются. Транскрипция на
эписоме идет с помощью клеточной РНК полимеразы. ранскрибируется
4 мРНК, все кэпировано, полиаденилировано.Промоторы, с которых идет образование этих матричных РНК ,находятся в разных участках генома, а 3 концы идентичны. Начинается их синтез в разных точках, но оканчивается в одной, они котерминальны.
С самой маленькой м-РНК транслируется белок Х.
АУГ белка S находится ближе всего к 5 концу и кэпу, а АУГ М белка находится чуть дальше в другой рамке считывания, а т к эукариотические рибосомы предпочитают 1ый АУГ , белка S на капливается очень много, а белок М инициируется от случая к случаю и его образуется меньше. Аналогично происходит при трансляции прегеномной РНК.
Итак, вот эта РНК является матрицей для белка кора и ревертазы и матрицей для репликации белка.
Оказывается, что длина прегеномной РНК больше самого генома! С нее транслируется тоже 2 белка НВс и полимераза.
В вирусную частицу входит около 200 копий корового белка и всего одна молекула полимеразы. АУГ С белка находится ближе к 5 концу и происходит нормальная кэп-зависимая инициация, эффективная, а АУГ полимеразы находится на некотором расстоянии, тоже со сбоем рамки, и полимеразы образуется очень мало, где-то 1 молекула на вирусную частицу.
Для того ,чтобы начать процесс обратной транскрипции обратная транскриптаза взаимодействует с прегеномной РНК и блокирует трансляцию прегеномной РНК. Трансляции не происходит и начинается формирование кора, в котором и происходит обратная транскрипция. пгРНК длиннее, т к участок геномной РНК при ее транскрипции прочитывается дважды, что приводит к образованию повторов на 5 и 3 концах пг РНК. Повторы довольно крупные, примерно 200нуклеотидов(R-повторы) внутри них более короткие повторы - DR1 (всего несколько нуклеотидов). Кроме того, на 5' 3'-концевого R повтора есть DR2 повтор. Рядом с короткими повторами DR1 есть эпсилон-шпилька на 3 конце. Первый акт при начале репликации – связывание полимеразы со структурой эпсилон инициирует инкапсидирование РНК в капсидный белок и формирование сердцевины вириона и одновременно инициируется процесс обратной транскрипции с образованием короткого фрагмента (-)цепи ДНК (всего несколько нуклеотидов), при этом молекула полимеразы выполняет роль затравки, через тирозин ковалентно связывается с первыми нуклеотидами ДНК, СВЯЗЬ ОСТАЕТСЯ НА ВСЕ ВРЕМЯ И ИМЕННО В ТАКОМ ВИДЕ ПОЛИМЕРАЗА ПОПАДАЕТ В ВИРУСНУЮ ЧАСТИЦУ.
| Р.прямоугольники с циферками - это повторы, по порядку слева направо: 1, 2, 1 |
Итак, на пгРНК строится участок, комплементарный боксу DR1, происходит прыжок полимеразы ,
она транслоцируется в область другого DR1
повтора. Обратная транскриптаза обладает РНКаза Н активностью и постепенно удаляет РНК в гетеродуплексе РНК-ДНК. По непонятным причинам остается небольшой участок прегеномной РНК, ее 5 конец.
Происходит второй прыжок полимеразы между DR2 и DR1, (они комплементарны). Т о образуется свободный 3 конец, необходимый для синтеза (+)ДНК, т е затравкой для синтеза (+)цепи ДНК является фрагмент прегеномной РНК. Ну и происходит синтез этого небольшого участка (+)ДНК с помощью полимеразы. Дальше за счет той же комплементарности (-)ДНК образует кольцо, благодаря этому полимераза переходит на 3 конец (-)цепи и продолжается синтез (+)ДНК. (+)цепь наращивается полимеразой до тех пор, пока сердцевина вириона, в которой идет этот процесс, не связывается с L белком на мембране (он находится в составе мембранной эндоплазматической сети), это связывание ведет к небедленной остановке синтеза (+) нити. Процесс может быть растянут по времени, поэтому разные вирионы могут иметь (+)ДНК разной длины, но никогда (+)ДНК не успевает сделать полный круг. А кусочек пгРНК остается ковалентно связанным с (+)ДНК вируса и в составе вириона.
Итак, репликация идет в цитоплазме, внутри коровой частицы,
которая параллельно формируется из продуктов трансляции. В образовании этих коровых частиц участвуют шапероны клетки, более того часто сами входят в состав созревших вирусных частиц (БТШ 90).
Суммируем: частица взаимодействует с неизвестным пока рецептором, ДНК идет в ядро, там происходит изменение 5' концов, ДНК достраивается, лигируется и образуется эписома, с нее идет транскрипция, затем с прегеномной РНК в цитоплазме связывается обратная транскриптаза и идет
репликация, одноврменно при участии клеточных шаперонов
образуется кор, он связывается с HBS L на ЭПР и репликация
преркащается, при этом +цепь не успевает достроиться. Важно, что
гепатит б распространен неравномерно, очень много его в Китае.
Заражается только один тип клеток, в патогенезе важна иммунная система, 95 процентов излечивается самостоятельно с помощью цитотоксических Т-лимфоцитов. При этом больные теряют часть печени - отсюда симптомы. У 5 процентов слабый иммунный ответ и они становятся хрониками. Сейчас в мире 300млн носителей. Это огромный резервуар и среди них 10 процентов
получают рак печени.
Почему вирус онкогенный? Геном вируса способен интегрировать в клеточный геном. И при этой случайной интеграции вирус нарушает транскрипцию клеточных генов, что очень часто приводит к потере контроля над клеточным делением. Есть другая версия: при интеграции ген Х никогда не теряется, он является транскрипционным активатором, помимо своих, активирует факторы транскрипции самой клетки, ну и, соответственно, белков, которые регулируют клеточные деления.
Семейство Parvoviridae
Около 50 представителей, образуют 2
подсемейства: Parvovirinae (позвоночные) и Densovirinae (насекомые).
• Геном – линейная ssДНК
• Группа II (по Балтимору)
• Различают автономные и дефектные или
ассоциированные парвовирусы (род Dependovirus, аденосателлит AAV2).
Наиболее известный парвовирус, заражающий человека – это парвовирус В-19, он вызывает инфекционную эритему, а у младенцев – пятую болезнь, размножается в крови, костном мозге, в тканях эмбриона, около 70% людей – носители этого вируса.
• Автономные парвовирусы размножаются только в S- фазе клеточного цикла, но не способны стимулировать деление зараженной клетки, они имеют все компоненты для самостоятельного размножения.
• Ассоциированным (дефектными) парвовирусам необходим помощник – адено- или герпесвирус, в его отсутствие способны встраиваться в геном
клетки-хозяина (провирус) и таким образом спасаются(очень четко, в 19 хромосому человека и поэтому к образованию опухолей не приводит). Помощник стимулирует транскрипцию клетки.
Структурные белки крупные, сходные по аминокислотному составу, отличаются только «эн» - концевыми последовательностями.
Дальше все обсуждаем на примере AAV2.
Инвертированные повторы образуют либо Т – образные, лиюо У – образные шпильки. «У» еще называют «заячьи уши».
2 открыты рамки считывания (регулят и структур белки).
Проникают в различные типы клеток посредством эндоцитоза.. В кислой среде эндосомы вирионы претерпевают конформационные изменения,выходят в цитоплазму. Терминальный участок белка VP1 обладает активностью фосфолипазы и обеспечивает транспорт фирусных частиц через эндолизосому.
Оказавшись в цитоплазме, вирусные частицы транспортируются по микротрубочкам к ядру и проникают через ядерные поры (размер позволяет). В ядре ДНК освобождается от капсида и начинается репликация, она осуществляется ДНК-полимеразой клетки.
Прописная и заглавная буквы на картинке – это участки, комплементарные между собой. Благодаря вторичной структуре мол-лы не нужно никакой затравки, полимераза сразу же может начинать свою работу.
И это называется «самозатравочный механизм». По ходу работы фермента 5 концевая шпилька расплетается и полимераза доходит до 5 конца материнской молекулы, образуется т н репликативная форма 1(РФ1), она в свою очередь служит матрицей для транскрипции и образования вирусспецифических м-РНК при репликации вируса. Если же ферменту не удастся расплести шпильку, то такие структуры фиксируются при инфекции, однако, это абортивный путь репликации.
РФ1 – транскрипция – образование вирусных белков – комплекс функциональных белков парвовируса, которые называются REP, это 4 белка; 2 из них обладают активностями сайтспецифической эндонуклеазы и хеликазы. Они делают точечный разрыв между 125 (длина инвертир повторов 125) и 126 нуклеотидом и освобождают 3 конец материнской цепи. В результате в составе дочерней цепи оказывается фрагмент материнской. Затем клеточный фермент достраивает последовательность генма парвовируса. Такая структура называется репликативная форма 2 (РФ2), которая тоже может служить матрицей для транскрипции. Затем, за счет хеликазной активности бедков REP концы двуцепочечной ДНК вследствие наличия концевых повторов образуют «заячьи уши», и в результате образуются свободные 3 концы, на которых снова путем самозатравки может продолжаться дальнейшая репликация генома парвовируса.
-Половина дочерних нитей ДНК аденосателлита имеет положительную, а другая – отрицательную полярность.
• Часть материнской молекулы входит в состав дочерней молекулы ДНК.
• Нуклеотидная последовательность концевых повторов у дочерних молекул ДНК отличается от последовательности родительской ДНК.
• Происходит инверсия нуклеотидной последовательности внутри концевого повтора.
• Структура концевой последовательности (инвертированный повтор) сохраняется
• Изменения не затрагивают смысловых нуклеотидных последовательностей (как кодирующих, так и регуляторных) и не влияют на репликацию вируса.