Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК
Молекулярно-генетический метод
Биохимический метод
Биохимические методы основаны на изучении активности ферментных систем (либо по активности самого фермента, либо по количеству конечных продуктов реакции, катализируемой этим ферментом). Биохимические методы позволяют выявить генные мутации, которые являются причиной заболевания обмена веществ (например, фенилкетонурия). Фенилкетонурия наследуется по аутосомно-рецессивному типу больные являются рецессивными гомозиготами (аа). Ген (картирован 12q22-q24), мутации которого приводят к заболеванию, кодирует фермент фенилаланин-гидроксилазу, катализирующей превращение фенилаланина в тирозин. В результате у больного происходит накопление фенилаланина, который превращается фенилпировиноградную кислоту, которая в больших концентрациях является нейротропным ядом. С помощью нагрузочных тестов можно выявлять гетерозиготных носителей патологических генов, например фенилкетонурии. Исследуемому вводят внутривенно определенное количество аминокислоты фенилаланина и через равные промежутки времени определяют его концентрацию в крови. Если человек гомозиготен по доминантному аллелю (генотип АА), то концентрация фенилаланина быстро возвращается в контрольному значению, а если гетерозиготен (генотип Аа), то снижение концентрации фенилаланина идет вдвое медленнее. Аналогично проводят тесты, выявляющие предрасположенность к гипертонии, сахарному диабету и т.д.
В основе всех молекулярно-генетических методов лежит изучение структуры ДНК.
Этапы анализа ДНК:
1. Выделение ДНК из клеток, содержащих ядра (крови, тканей, спермы, костей, волос и др. биологических материалов), включая трупный материал и ископаемые останки;
2. Обнаружение и размножение (копирование) небольшого интересующего фрагмента из тотальной ДНК методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР);
3. Анализ последовательности нуклеотидов интересующего фрагмента ДНК: регистрация результатов ПЦР обычно с помощью электрофореза.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации (размножения) ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выявить и размножить интересующий фрагмент ДНК размером от 80 до 3000 пар нуклеотидов (пн).
Исходные компоненты ПЦР:
1. ДНК-матрица (тотальная ДНК);
2. Праймеры (однонитевые синтетические фрагменты ДНК размером 20-30 нуклеотидов), строго комплементарные правой и левой границам интересующего фрагмента ДНК).
3. Нуклеотиды, являющиеся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК);
4. Фермент - ДНК-полимераза, катализирующий удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидов к растущей цепи синтезируемой ДНК.
ПЦР–анализ включает 30 циклов амплификации. Каждый цикл состоит из трех стадий:
1. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, разрыв водородных связей между комплементарными нуклеотидами). Проходит при температуре 93-95оС в течение 1 мин.
2. Отжиг (присоединение) праймеров (50-60оС, 1 мин).
3. Синтез ДНК - достраивание одноцепочечных участков ДНК по принципу комплементарности (72оС, 1 мин).
К концу ПЦР происходит накопление нужного участка ДНК до 2n фрагментов, где n-число циклов амплификации. Этого количества достаточно для точной детекции этого фрагмента методом электрофореза.