План лекции

Гаплоидная технология

Лекция 19

Форма проведения лекции:лекция-конференция

1. Получение гаплоидных растений в культуре женского гаметофита

2. Женский гаметофит растений и его развитие in vitro

3. Факторы, влияющие на гиногенез

1Работы по культивированию женских репродуктивных органов с целью получения гаплоидных растений начались еще в 50-е годы, и в последние годы интерес к культуре женского гаметофита особенно возрос. Это, во-первых, обусловлено тем, что культивирование неоплодотворенных семяпочек мужских стерильных растений является единственной возможностью получения у них гаплоидов. У мужских стерильных линий табака и сахарной свеклы эти методом получены гаплоидные растения. Во-вторых, женский гаметофит может быть источником получения гаплоидов у тех растений, у которых каллусная ткань обладает низким морфогенетическим потенциалом либо регенерирует растения-альбиносы. У некоторых растений в культуре семяпочек частота регенерации зеленых растений значительно выше, чем из пыльников. Например, у ячменя все гаплоидные растения, индуцированные через гиногенез, оказались хлорофиллоносными, в то время как при андрогенезе 99 % растений-регенерантов были альбиносами.

Индуцирование гаплоидов в культуре семяпочки называется гиногенезом и является одной из форм апомиксиса. Апомиксис – это размножение организмов, не сопровождающееся половым процессом. В зависимости от того, дает начало новому организму половая или вегетативная клетка, различают две основные формы апомиксиса партеногенез и апогамию.

Партеногенез – это форма полового размножения организмов, при которой женские половые клетки (яйцеклетки, яйца) развиваются без оплодотворения. Партеногенез – половое, но однополое размножение, потомство повторяет генотип матери. Зародыш может быть как гаплоидный, так и диплоидный. Апогамия (апогаметия) – гаметы не образуются, а зародыш (гаплоидный или диплоидный) развивается из синергиды или антиподы.

2 Женский гаметофит растений – зародышевый мешок располагается в семяпочке и окружен нуцеллусом и интегументами (покровами), образующими при смыкании узкий канал – микропиле, противоположная микропиле часть семяпочки называется халазой (рис.12). Халазной стороной семяпочка через семяножку прикрепляется к плаценте.

Семяпочки цветковых растений образуются в завязи. Типичный зародышевый мешок, так называемый нормальный тип, развивается из одной мегаспоры, дифференцирующейся в нуцеллусе семяпочки, которая разрастаясь, трижды делится и превращается в 7-клеточное 8-ядерное тело с упорядоченным расположение клеток.

Зародышевый мешок состоит из крупной яйцеклетки и прилегающих к ней двух менее развитых вспомогательных клеток – синергид. Ближе к центру располагается двуядерная центральная клетка, у халазального полюса – три одинаковые клетки – антиподы. В нормальном типе зародышевого мешка ядра всех клеток, за исключением центральной, гаплоидные. Центральная клетка содержит два гаплоидных ядра, которые затем сливаются и образуют диплоидное ядро. В результате двойного оплодотворения из яйцеклетки образуется диплоидная зигота, дающая начало зародышу, а из центральной клетки развивается триплоидный эндосперм.

Зародышевый мешок в морфологическом и физиологическом отношении представляет собой более сложную структуру, чем пыльцевое зерно. В связи с этим индукция гаплоидных растений в культуре женского гаметофита имеет свои особенности.

В ранних работах по культивированию завязей и семяпочек наблюдалась только пролиферация соматических тканей, окружающих зародышевый мешок. Впервые гаплоидный каллус был получен Тулеком в 1964 г. в культуре женского гаметофита представителя голосеменных растений –гинкго.

Гаплоидный набор хромосом в каллусе свидетельствует о том, что каллус индуцирован из гаплоидных клеток зародышевого мешка. Однако попытки индуцировать органогенез в этом каллусе не увенчались успехом.

Рисунок 12. Поперечный срез семяпочки ортотропного типа

У покрытосеменных гаплоидный каллус был индуцирован японскими исследователями в 1971 г. в культуре неоплодотворенных семяпочек баклажана и в культуре завязи кукурузы. Но они тоже не смогли получить растения-регенеранты. Получить нормальные зеленые гаплоидные в культуре неоплодотворенных завязей ячменя впервые удалось Сан Ноуму в 1976 г. С тех пор проведены многочисленные эксперименты по индуцированию гаплоидных растений в культуре неоплодотворенных завязей и семяпочек различных видов покрытосеменных растений.

Показано, что формирование гаплоидных растений является результатом аномального развития женского гаметофита и осуществляется двумя способами: через эмбриоидогенез и каллусогенез. Как и в культуре пыльников, получение гаплоидных растений в культуре семяпочек предпочтительнее через эмбриоидогенез.

В норме новый организм возникает из зиготы, но явление апомиксиса, наблюдаемое в природе, свидетельствует о том, что начало новому организму может дать и неоплодотворенная яйцеклетка (партеногенез), а также и другие клетки зародышевого мешка (апогамия).

Видимо, при создании в завязи и семяпочке каких-то, пока неизвестных, условий в клетках зародышевого мешка нарушается генетически запрограммированный цикл развития. В результате отдельные клетки выходят из состояния тупиковой дифференцировки и приобретают способность к дальнейшему развитию, образуя апомиктические зародыши. Ценность этих зародышей состоит в том, что они наследуют только признаки материнского растения. По-видимому, такие же процессы протекают в культурах in vitro у изолированных неоплодотворенных завязей и семяпочек.

Гаплоидные эмбриоиды или каллус также могут иметь различное происхождение, то есть возникать сразу из нескольких или только из единственной клетки зародышевого мешка. Развитие эмбриоидов из клеток зародышевого мешка отмечалось у ячменя, риса, пшеницы, кукурузы, сахарной свеклы, табака, гевеи.

Сан Ноум, изучая индукцию гаплоидных растений в культуре неоплодотворенных завязей ячменя, обнаружил, что эмбриоиды образуются различными путями: из яйцеклетки и антипод, из антипод, из яйцеклетки и одной синергиды, из яйцеклетки и двух синергид, из одной или двух синергид, из синергид и антипод, из яйцеклетки и антипод. Он полагает, что гаплоидные эмбриоиды у ячменя формируются преимущественно из антипод, а клетки каллусного типа образуются из синергид.

В культуре неоплодотворенных завязей риса наблюдали индукцию гаплоидного эмбриогенеза и каллусогенеза в основном из синергид, антиподы при этом не изменялись, но затем они несколько раз делились или совсем дегенерировали. У табака в культуре неоплодотворенных семяпочек гаплоидные эмбриоиды возникали в результате деления яйцеклетки, а у скерды – из антипод. Причины или факторы, побуждающие элементы зародышевого мешка in vitro дедиференцироваться или переключаться на незапрограммированный путь дифференцировки, остаются пока не выясненными.

Цитогенетические исследования культивируемых завязей и семяпочек показали, что in vitro индуцируются к пролиферации и клетки соматических тканей, окружающие зародышевый мешок. Из нуцеллуса и интегументов формируются диплоидные и полиплоидные растения. Нуцеллярная эмбриония (развития зародыша из нуцеллуса) часто встречается в природе у цитрусовых и манго. Полиэмбрионию в культуре нуцеллуса удалось индуцировать у несколько видов лимона, а также у винограда.

С.К. Мухамбетжанов в Институте физиологии, генетики и биоинженерии растений НАН РК изучал рост им морфогенез в культуре неоплодотворенных завязей пшеницы. Он показал, что программа морфогенеза реализовалась на основе процессов каллусогенеза, органогенеза и эмбриоидогенеза. Апомиксис у пшеницы in vitro осуществляется на основе «переключения» клеток женского гаметофита на спорофитный путь развития. При этом в клетках зародышевого мешка и окружающих его тканей могут протекать следующие морфогенетические процессы: гиногенез (из яйцеклетки) , апогаметия (из синергид и антипод), адвентивная эмбриония (из клеток нуцеллуса или интегументов).

Таким образом, при культивировании неоплодотворенных завязей и семяпочек не исключена возможность индукции каллуса из диплоидных клеток соматических тканей. Конечно, лучше было бы культивировать непосредственно зародышевый мешок, но вычленить его без повреждения очень трудно. Выделить семяпочку в зависимости от вида растений можно механическим либо ферментативным путем, растворяя окружающие ткани пектиназами. Однако до настоящего времени попытки не увенчались успехом в связи с тем, что выделенный зародышевый мешок характеризуется низкой жизнеспособностью. Возможно, окружающие зародышевый мешок соматические ткани способствуют повышению жизнеспособности зародышевого мешка и даже оказывают положительное влияние на индукцию гаплоидного эмбриоидо-и каллусогенеза.

В связи с вышеизложенным, в некоторых случаях более эффективно получение гаплоидных растений с материнскими свойствами не путем гиногенеза, то есть в культуре семяпочки, а в процессе псевдогамии. Это специфический случай гаплоидного партеногенеза, когда для индукции гаплоидного развития необходимо опыление пыльцой. Вследствие селективной элиминации хромосом дикого ячменя растение-регенерант развивается фактически из яйцеклетки и обладает всеми материнскими признаками. Партеногенетическое развитие яйцеклетки возможно также при опылении пыльцой, обработанной ионизирующим излучением.

3 На процесс индукции гаплоидных растений влияет целый комплекс лимитирующих факторов. Среди них можно выделить факторы эндогенные (генотип исходного растения, степень развития зародышевого мешка) и экзогенные (состав питательной среды, условия культивирования).

При разработке методов получения гаплоидных растений в культуре завязей и семяпочек, как и при культивировании пыльников, необходимо учитывать эффект генотипа донорного растения. Эмпирически подобранные условия получения гаплоидов для одного сорта оказываются непригодными для других и требует существенных модификаций.

Другим фактором, определяющим развитие неоплодотворенных завязей и семяпочек в культуре, является стадия развития женского гаметофита.

Правильный подбор питательных сред является важным фактором. Чаще всего используются среды МС, Миллера, Нича, № 6. Определяющее значение имеет тип и количество фитогормонов. Для одних видов необходимы в определенном сочетании ауксины и цитокинины, очень высокие концентрации фитогормонов в питательной среде в большей степени стимулируют каллусогенез из соматических тканей завязи, чем из гаплоидных элементов зародышевого мешка.

Определенную роль играют витамины, гидролизат казеина, дрожжевой экстракт и другие натуральные экстракты. Существенное значение имеет присутствие в среде углеводов.

Таким образом, при культивировании завязей и семяпочек подбор оптимального уровня компонентов питательной среды, особенно стимулирующих рост веществ, осуществляется эмпирически для каждого конкретного вида и даже сорта растения.

Обычно завязи и семяпочки выращивают поверхностным способом, но в опытах на рисе, хлопчатнике показана возможность их культивировать в жидких средах. Культивирование осуществляют при температуре 23-28 ^оС при освещении или в темноте с подбором оптимального температурного и светового режима для каждого конкретного эксперимента.

Контрольные вопросы

1. Методы гаплоидии.

2. Развитие микроспор in vivo и in vitro.

3. Какие факторы влияют на андрогенез in vitro.

4. Развитие женского гаметофита in vitro.

5. Влияние факторов на гиногенез.

6. Что называется эмбриокультурой?

7. Как получить культуру растительных эмбриокультур?

8. Какие вопросы можно решить с использованием методов гаплоидной технологии?

9. Какие процессы можно наблюдать при культивировании пыльников?