План лекции

Принципы культивирования клеток растений

Лекция 6

Форма проведения лекции:обзорная лекция

1 Факторы культивирования.

2 Основные компоненты питательной среды.

1 Изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах. Они могут существенно различаться по своему составу, однако, в состав всех сред обязательно входят необходимые растениям макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, регуляторы роста, аминокислоты. Клетки в культуре нуждаются в углеводах, потому что в этих условиях они питаются гетеротрофно. Источник углерода вводится в состав среды в виде сахарозы или глюкозы, обычно в концентрации 20-40 г/л (2-3 %). Другие углеводы хотя и используются для некоторых видов растений в культуре, в целом являются менее пригодными. В качестве источников углерода были также испытаны некоторые органические кислоты и спирты, которые однако уступали углеводам. Углеводы необходимы в качестве питательного компонента, так как большинство каллусных тканей лишено хлорофилла и не способны к автотрофному питанию. Поэтому их выращивают в условиях рассеянного освещения или в темноте.

Основой всех питательных сред для выращивания изолированных тканей растений является смесь минеральных солей, представленных как макро- так и микроэлементами. Азот входит в среды в виде нитратной или аммонийной соли, фосфор – в виде фосфата, сера – в виде сульфата, железо вводится в виде неорганических солей и солей органических кислот и в форме хелата. Последний обеспечивает доступность железа при рН до 8,0 в течение всего периода роста культуры. В отсутствие хелатирующего агента недостаток железа может возникнуть очень быстро. Все среды содержат также ионы Ca²⁺, K⁺, Mg²⁺. Почти все среды содержат ряд микроэлементов: B, Mn, I, Cu, Zn, Mo, Co.

В состав некоторых сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кис-лота) или ее натриевая соль, которые улучшают доступность железа для клеток.

В состав большинства сред входят витамины. Особенно важны витамины группы В: тиамин (В₁), рибовлафин (В₂), пиридоксин (В₆). Многие культуры нуждаются также в никотиновой, фолиевой, пантотеновой кислотах, мезоинозите. Хотя большинство тканей в культуре способно к биосинтезу витаминов, но этого количества оказывается недостаточно для выполнения метаболических функций. Поэтому дополнительное внесение витаминов в питательную среду стимулирует рост тканей. Необходимым компонентом любой питательной среды являются фитогормоны – соединения, которые участвуют в регуляции физиологических процессов у растений. Для роста и дифференциации растительных клеток необходимы ауксины и цитокинины. Ауксины – гормоны растений, производные индола. Образуются в апикальных меристемах и стимулируют клеточное растяжение.

2 Цитокинины – гормоны растений, производные 6-аминопурина. Индуцируют в присутствии ауксина деление клеток и дифференцировку каллуса. Следовательно, ауксины вызывают дифференцировку клеток экспланта, и цитокинины индуцируют клеточные деления. Только культура тканей опухолей и культура «привыкших» тканей способны расти на средах без регуляторов роста. В качестве ауксинов для получения каллуса и его поддержания используются: b-индолилуксусная кислота (ИУК), a-нафтилуксусная кислота (НУК), 2,4 –дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д). Природный ауксин ИУК легко окисляется в клетках, поэтому ее вводят в среду в больших количествах и, кроме того, редко добавляют в среду в качестве единственного ауксина для того, чтобы вызвать образование каллуса, обычно используют более высокие концентрации ауксинов, чем для его последующего роста. Наиболее выраженный эффект ауксина проявляется в стимуляции роста. Ауксин играет важную роль в процессах регенерации при размножении каллусных клеток; в процессе образования придаточных и боковых корней, луковиц, при заложении вегетативных почек. Для практических целей в сельском хозяйстве часто применяют не ИУК, а синтетические ауксины, так как они в растениях не разрушаются ИУК-окси-дазой. Молекулы синтетических ауксинов имеют разную структуру, они содержат ароматическое или гетероциклическое кольцо, боковая часть которого представлена остатком алифатической кислоты. Это –индолил-3-масля-ная кислота (ИМК), a-нафтил-1-уксусная кислота (НУК), 2,4 –дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4 -Д), фенилуксусная кислота (ФУК), фенилмасляная (ФМК).

2,4-Д применяют для индукции каллуса у злаков, бобовых, томатов, для роста суспензионных культур, в сочетании с другими фитогормонами для формирования у протопластов клеточной стенки.

ИУК, ИМК, НУК, ФУК И ФМК применяют в качестве индукторов образования корней, а в сочетании с цитокининами эти фитогормоны могут быть использованы для развития проростков при культивировании изолированных зародышей.

ИУК необходима для индуцирования каллусогенеза.

В качестве источников цитокининов в искусственных питательных средах используют кинетин (6-фурфуриламинопурин), 6-бензиламинопурин, зеатин, которые представляют собой N-замещенные производные аденина.

Действие цитокининов проявляется прежде всего в ускорении клеточных делений, что опосредуется усилением синтеза ДНК и РНК и белков. Благодаря этому замедляется старение клеток и повышается их устойчивость к неблагоприятным условиям среды.

Кинетин (6-фурфуриламинопурин) вводится в среду как обязательный компонент для индукции деления клеток. Некоторые другие адениновые производные могут быть более активны, например природный цитокинин – зеатин. Однако это очень дорогой и дефицитный фитогормон, к тому же он термолабилен, поэтому его нельзя автоклавировать. Другой цитокинин – это широко применяемый 6-бензиламинопурин (БАП), который активнее кинетина на много порядков.

Гиббереллины оказывают множественные действия: стимулируют рост в фазе растяжения и деления клеток (например, камбия), вызывают рост плодов. Важное свойство гиббереллинов – вызвать вытягивание стебля у розеточных растений или у растений с укороченным стеблем, т.е. устранять физиологическую и генетическую карликовость.

Для практических целей наиболее часто используют гибберелловую кислоту, которая производится в промышленности. Обработка гибберелловой кислотой семян и клубней приводит к снятию у них покоя и стимулирует быстрое прорастание. Для образования первичного каллуса и реже с целью поддержания его роста в питательную среду вносят комплексные органические добавки. Это могут быть различные экстракты (солодовый экстракт, дрожжевой экстракт, картофельный, вытяжки из разных органов растений, из опухолевых тканей), соки (березовый, томатный, апельсиновый), незрелые эндоспермы кокосового ореха, кукурузы, других злаков, гидролизат казеина, смесь аминокислот. Небольшим стимулирующим действием обладают незрелые эндоспермы ряда растений, особенно кокосового ореха, так называемое кокосовое молоко. Это связано с особой ролью эндосперма, который служит питательным субстратом и источником гормонов для развивающего зародыша. Однако в последнее время таких добавок стараются избегать в связи с трудностями воспроизведения результатов и наличия в них неизвестных факторов роста.

Важное значение для нормального роста и развития растений in vitro как на агаризованных, так и в жидких средах имеет ее рН. В нативных (врожденных, естественных) условиях растительная клетка функционирует в узких границах концентрации водородных ионов. От величины рН зависит структура и активность макромолекул, прежде всего белков-ферментов в самой ткани. Кроме того, рН влияет на устойчивость и усвояемость компонентов питательной среды, в первую очередь регуляторов роста и витаминов. При низких рН не желатинизируется агар, поэтому рН питательных растворов обязательно доводится до требуемого уровня путем добавления щелочей и кислот.

Оптимальный рост культуры клеток растений обычно происходит на среде с начальными значениями рН от 5 до 6. Среды, содержащие такие неопределенные органические компоненты, как гидролизат казеина и дрожжевой экстракт, обычно хорошо забуферены, поэтому рН среды в процессе роста культуры меняется слабо. В средах без этих веществ сдвиги рН в ходе культивирования могут быть весьма значительными. Особенно важно учитывать это обстоятельство для суспензионной культуры клеток.

В качестве гелеобразующего вещества для приготовления твердых питательных сред используется агар-агар. Агар – полисахарид, содержащий целый ряд примесей, поэтому его промывают проточной водой в течение 4-6 часов. Содержание агара в питательных средах колеблется в зависимости от требований культивируемой ткани. Первые успешные результаты по культивированию тканей растений были получены именно на агаризованных средах в 30-х годах нашего века Р. Готре во Франции и Ф.Уайтом в США.

Каллусные ткани можно выращивать сколько угодно долго, если пересаживать их через каждые 3-4 недели на свежую питательную среду. Именно в такой длительной пересадочной культуре выращиваются клетки и каллусные ткани. И сейчас в некоторых лабораториях мира сохраняются штаммы клеток, полученные в 1938 году из корнеплода моркови Р.Готре.

В таблице 1 приведены составы различных сред. Эти среды оказались эффективными для культивирования in vitro различных видов как однодольных, так и двудольных растений. Сложные добавки (например, кокосовое молоко) и регуляторы роста, используемые с этими средами, не приведены в таблице.

В настоящее время некоторые фирмы выпускают готовые питательные среды Мурасиге-Скуга, Уайта, Хеллера в виде сухих порошков, содержащих все необходимые компоненты – за исключением регуляторов роста, сахарозы и агара. Однако их применение ограничено для исследований, в которых необходимо варьирование компонентов среды. Обычно, начиная работать с новым объектом, авторы модифицируют состав стандартных сред, особенно часто изменяя концентрацию и набор органических компонентов.

Таким образом, питательные среды для культивирования клеток имеют сложный состав: макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, аминокислоты, фитогормоны. При соблюдении условий стерильности успех в культивировании клеток определяется прежде всего составом питательной среды. Изменяя состав питательной среды, можно индуцировать морфогенез и вырастить растение-регенерант. Внешними факторами, влияющими на культивирование клеток, являются температура, свет, осмотическое давление, аэрация.

Контрольные вопросы:

1. Перспективы развития биотехнологии в Казахстане.

2. Что такое культура клеток растений.

3. Что такое тотипотентность? Кому принадлежит идея тотипотентности?

4. Что называется каллусом?