План лекции

Клеток растений

Теоретические и методические принципы культивирования

Лекция 5

Форма проведения лекции:проблемная лекция

1. Культура клеток растений

2. Питание культивируемых клеток. Общая характеристика питательных сред. Оптимизация состава питательных сред.

1 Культурой клеток растений (обобщенно) называется выращивание отдельных клеток, тканей и органов растений на искусственной питательной среде в асептических условиях. Кусочек простерилизованной растительной ткани помещают в чашку Петри или пробирку на агаризованную питательную среду. После этого в ткани начинается интенсивное деление клеток. Клеточная масса быстро разрастается, образуя каллус. Каллус- это особый тип ткани, представляющий собой скопления недифференцированных клеток. Если затем кусочки этого каллуса периодически пересаживать на свежую питательную среду, то они могут расти неограниченно долго. Термин «культура клеток растений» превратился в широкое и удобное понятие, охватывающее все виды работы in vitro с культурами изолированных клеток (даже части клеток - протопластов), тканей, органов, зародышей и целых растений-регенерантов. Термин in vitro (лат. «в стекле», «в склянке») используется для описания условий протекания процессов в стерильной искусственной окружающей среде: термин in vivo (лат.- «на живом») применяют по отношению к естественным нестерильным условиям протекания процессов жизнедеятельности в организме.Термин растение-регенерант означает асептически полученное растение с развитыми корнями и побегами, сформировавшееся в культуре, то есть in vitro.Теоретически любая живая растительная клетка потенциально способна развиваться в организм, из которого была изолирована и культивировалась в определенных условиях. Это свойство называется тотипотентностью. Тотипотентность (от лат. totus – «весь», «целый» и potential – «сила») – свойство клеток в полной мере реализовать присущую им генетическую информацию, обеспечивающую их дифференцировку и дальнейшее развитие до целого организма. Обычно универсальной тотипотентностью обладают оплодотворенные яйцеклетки растений и животных. Что касается соматических клеток, тотипотентностью обладают только клетки растений, и то преимущественно в условиях in vitro. Культивируемые клетки животных лишены тотипотентности. Одним из направлений совершенствования метода культуры тканей был поиск возможностей выращивания одиночных клеток, результатом которого явилась разработка метода получения и выращивания клеточных суспензий. Культура клеток, или суспензионная культура, - это выращивание отдельных клеток или небольших их групп во взвешенном состоянии в жидкой среде при использовании аппаратуры, обеспечивающей их аэрацию и перемешивание. В Алма-Ате работы с культурой тканей начались в 1975 г. в Главном ботаническом саду, а затем получили развитие в Институте молекулярной биологии и биохимии, Институте ботаники, университете им. аль-Фараби. Основателями школы биотехнологии в Казахстане являются М. Айтхожин и И. Рахимбаев. Метод культуры клеток, тканей и органов является в н.в. общепризнанным и широкоприменяется во всем мире для решения фундаментальных и прикладных вопросов биологии растений. Исследования и разработки в биологии в последние 20 лет привели к формированию и развитию самостоятельной области знаний – биотехнологии. Биотехнология – это отрасль науки и производства, использующая биологические системы и процессы для производства экономически важных веществ и продуктов. Для этого используются микроорганизмы, культивируемые клетки растений и животных, ферментные системы, искусственные формы жизни, созданные методами клеточной и генной инженерии. На основе культивируемых клеток и тканей высших растений создаются перспективные, принципиально новые технологии для различных отраслей промышленности и сельского хозяйства. Таким образом, культура клеток растений из лабораторного метода превратилась в теоретическую и технологическую основу новой отрасли промышленности – биотехнологии растений.

2Культура клеток требует стерильности самих культивируемых эксплантов, питательных сред, посуды, инструментов и лабораторию помещения. Лучше всего работу по выделению тканей из растений и их высадку на питательную среду проводить в ламинарном боксе. Из простерилизованных различными способами и тщательно промытых в стерильной дистиллированной воде объектов изолируют нужные ткани и помещают их на предварительно проавтоклавированную питательную среду (твердую агаризованную или жидкую).Возможно культивирование любых тканей и органов растений. Успех в культивировании клеток, тканей и органов прежде всего определяется составом питательной среды. Культура клеток каждого вида растений и даже разных органов и тканей одного и того же вида требует питательной среды определенного состава. Более

того, для инициации каллуса, поддержания его роста, для индукции органоге-

неза нужно в каждом из этих случаев изменять состав среды. Почти любой исследователь пытается разработать оптимальную среду для своего объекта, поэтому количество рецептов питательных сред с каждым годом все возрастает.

Выбор питательной среды определяется видом растения, которое вводится в культуру, а также задачами эксперимента. Если в литературе не имеется необходимой информации, работу начинают с применения таких широко используемых сред, как среда Мурасиге-Скуга, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга Эвелага (В₅), Блейдза, Уайта, Нича и Нич, Лисмайера-Скуга, а затем подбирают концентрации регуляторов роста и органических добавок. Перечисленные среды оказались эффективными для культивирования in vitro различных видов как однодольных, так и двудольных растений.

В настоящее время некоторые фирмы выпускают готовые среды МС, Уайта, Хеллера в виде сухих порошков, содержащих все необходимые компоненты – за исключением регуляторов роста, сахарозы, агара. Однако их применение ограниченно для исследования, в которых необходимо варьирование компонентов среды. Обычно, начиная работать с новым объектом, авторы модифицируют состав стандартных сред, особенно часто изменяя концентрацию и набор органических компонентов. Оптимизацию состава среды по многим компонентам целесообразно проводить с применением метода математического планирования эксперимента. Основным преимуществом метода математического планирования по сравнению с классическими методами исследований является возможность одновременного изучения большого числа факторов, действующих в системе. Это позволяет наряду с количественным учетом влияния каждого отдельного фактора установить наличие в системе межфакторных взаимодействий и оценить эффекты последних. Таким образом, метод математического планирования дает ответ не только на вопрос о том, какие компоненты питательной среды оказывают положительное влияние, но и показывает оптимальные соотношения этих компонентов.