Калус. Загальні принципи одержання калусної тканини

РЕГЕНЕРАЦІЯ РОСЛИН ШЛЯХОМ СОМАТИЧНОГО ЕМБРІОЇДОГЕНЕЗУ

У деяких наукових посібниках використовують термін «соматичний ембріогенез».

Явище соматичного ембріоїдогенезу (СЕ) характеризується утворенням зародкоподібних структур (ембріоїдів) нестатевим шляхом із соматичних клітин рослин. Розрізняють прямий та непрямий шляхи соматичного ембріоїдогенезу.

Прямий СЕ – процес формування вегетативного зародка з тканин експлантат без проміжної стадії утворення калусної тканини. Такі зародки в природних умовах розвиваються за рахунок клітин нуцелуса, а інколи й покривів (без будь-якого зв’язку із зародковим мішком) і носять характер додаткової (адвентивної) ембріонії. Такий вид апоміксису (аспорія) зустрічається у мандарина, лимона, апельсина і зумовлює багатозачатковість (поліембріонію), внаслідок чого утворюється до 20 зародків, але нормально розвивається 1-4, решта – відмирають. Це явище використовується в умовах ін вітро: нуцелус незрілих плодів Citrus lemon L. звільняють від інтегументіва і висаджують халатною частиною на агари зоване поживне середовище. Соматичні зародки утворюються безпосередньо з культивованих клітин нуцелуса.

Методи ефективного одержання зародкоподібних структур шляхом прямого СЕ знаходяться на стадії пошуку.

Непрямий СЕ передбачає утворення ембріоїдів з клітин калусної тканини і складається з таких етапів:

- введення експланта в культуру ін вітро;

- стимуляція росту калуса і формування презародків;

- індукція формування біполярних зародків з пре зародків.

Індукція соматичних ембріоїдів вже апробована в культурах клітин і тканин близько 140 видів рослин.

Калус (від лат. calus – мозоль) – це особливий тип тканини рослин, яка утворюється на місці поранення і сприяє загоюванню. Тканина закриває місце поранення і накопичує поживні речовини, необхідні для регенерації спеціального захисного шару. В калусній тканині можуть утворюватися зачатки органів, що доповнюють або відновлюють цілісність організму.

Калусні клітини – це дедиференційовані клітини, в які перетворюються спеціалізовані і меристематичні клітини при їх культивуванні на специфічних поживних середовищах ін вітро. Казусна тканина має вигляд аморфної маси тонкостінних паренхімних клітин без визначеної анатомічної структури. Клітини калусу мають велике ядро, високий вміст ДНК і РНК; деякі клітини здатні накопичувати крохмаль і речовини вторинного метаболізму. Колрі тканин може бути білим, жовтим, зеленуватим, червонуватим, що залежить від виду рослини, типу експлантат, умов культивування.

Калусні клітини можна невизначено довго вирощувати ін вітро. Для цього необхідні періодичні пересадки (пасажі) невеликої частини утворених клітин на свіже поживне середовище через кожні 3-4 тижні. Найбільш «старим» вважають штам клітин, одержаний з коренеплода моркви Роже Готре ще у 1938 році і який по сьогоднішній день вирощують у багатьох лабораторіях світу.

Для індукції калусоутворення стерильні експланти (листки, черешки, сегменти стебел, корінців тощо) нарізують і поміщують на поживне середовище з високим значенням співвідношення ауксин/цитокінін: ауксину в середовищі повинно бути у 5-10 разів більше, ніж цитокініну. Наприклад, концентрація 2,4Д (1-3 мг/л), а БАП (0,1-0,5 мг/л). Експлант трохи вдавлюють в агар для забезпечення надійного контакту. Кінчики коренів легко утворюють калус при їх горизонтальному розміщенні в агарі, тоді як сегменти листка – при вертикальному. Пробірки, склянки або чашки Петрі витримують у темноті при 25^оС (інколи вирощують при світлі). У перші 4-5 днів спостерігається розтягування клітин і збільшення розмірів експланта, а потім за рахунок інтенсивних мітотичних поділів починає утворюватися калусна тканина.

Перехід спеціалізованих клітин у стан неорганізованого росту пов’язаний із синтезом білка в клітинах, збільшенням вмісту РНК, зникненням хлоропластів і хромопластів. При оптимально підібраному середовищі сегменти утворюють калус через 3-8 тижнів.

Шляхи регенерації (рис. 1) знаходяться у безпосередній залежності від типу експлантат і складу поживного середовища.

Рис. 1. Схематичне зображення місця і ролі калусної тканини