АНАЛИТИЧЕСКИЙ СКРИНИНГ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ, ИМЕЮЩИХ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

· Необходимость разработки аналитического скрининга.

· Понятие «скрининга»; область применения, возможности.

· Требования к аналитическому скринингу.

· Методы аналитического скрининга: хроматография (ТСХ, ВЭТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ), абсорбционная спектроскопия (УФ, видимая, ИК, ЯМР, МС), иммунохимические методы (РИМ, ИЭМ).

Необходимость разработки скрининговых методов анализа вызвана многообразием лекарственных соединений, которые при определенных обстоятельствах могут стать источником отравлений. Круг этих веществ постоянно расширяется по мере синтеза новых соединений.

Рост числа отравлений лекарственными препаратами связан с самолечением (бесконтрольный прием лекарственных веществ), в результате чего имеют место случаи передозировки лекарств, проявление их побочного действия и развитие идиосинкразии.

Большую долю в общем числе отравлений лекарственными средствами составляют детские отравления. Определенный вклад вносят отравления, связанные с наркоманией и токсикоманией.

Клиническая диагностика острых отравлений лекарственными средствами затруднена из-за нехарактерных симптомов. Особенно трудно идентифицируются комбинированные и детские отравления, где природа яда чаще неизвестна. В связи с этим возникает необходимость в разработке «скрининговых» методов анализа, которые позволяли бы за короткое время выбрать из большого числа потенциальных ядов одно или несколько веществ, послуживших причиной отравления.

Слово «скрининг» в переводе с английского означает - отсеивание (просеивание). Таким образом,

СКРИНИНГ - это научно обоснованная система поиска неизвестного яда, когда в процессе последовательных операций поэтапно «отсеиваются» (или определяются) отдельные группы веществ или индивидуальные соединения.

Аналитический скрининг (АС) наиболее удобен и эффективен в случае аналитической диагностики комбинированных отравлений, а также при ненаправленном анализе, когда неизвестна природа искомого вещества. Применение аналитического скрининга позволяет систематизировать исследование и направить его в нужное русло, сократив тем самым время анализа и материальные затраты на его выполнение.

К аналитическим скрининговым методам предъявляются определенные требования:

-универсальность (возможность подвергнуть исследованию большое количество веществ);

- достаточная специфичность (чаще групповая);

- высокая чувствительность (мкг и десятые доли мкг);

- экспрессность (возможность выполнения серийных анализов);

- точность (+_10 %) и воспроизводимость;

- простота и доступность;

- лабильность (возможность оптимизации и модернизации за счет введения новых соединений, материалов, реагентов и оборудования в существующую систему скрининга);

- возможность сочетания с другими методами анализа.

Перечисленными требованиями удовлетворяют, в основном, современные физико-химические методы анализа, такие как:

1. Хроматографические

2. Спектроскопические

3. Иммунохимические

Эти методы могут быть использованы в системе как общего, так и частного скрининга.

Общий скрининг - предусматривает химическое исследование веществ, отличающихся по своему строению и принадлежащих к различным фармакологическим группам. В основном здесь применяется групповая идентификация (например, выделяется группа барбитуратов, производных фенотиазина и др.).

Частный скрининг - направлен на исследование веществ внутри группы и идентификацию отдельных ее представителей. Примером может служить хроматографическое исследование на производные барбитуровой кислоты, позволяющее идентифицировать конкретного представителя в группе барбитуратов.

Хроматографические скрининговые методы

В настоящее время в качестве методов хроматографического скрининга наибольшее применение нашли:

1.ТСХ - тонкослойная хроматография (хроматография в тонких слоях сорбента).

2. ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография.

3. ГЖХ - газожидкостная хроматография.

4. ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография.

Хроматографию можно рассматривать как метод разделения веществ, в основе которого лежит разница в коэффициентах распределения этих веществ между подвижной и неподвижной фазами.

Тонкослойная хроматография (ТСХ)

В тонкослойной хроматографии роль неподвижной фазы выполняет фиксированный тонкий слой сорбента (0,1-0,5мм), содержащий определенное количество воды, нанесенный на хроматографическую пластинку из стекла, фольги, полимера. В качестве сорбентов чаще используют силикагель и окись алюминия. Для лучшего удерживания на пластинке в сорбент добавляют связующий компонент – гипс, крахмал и др. Роль подвижной фазы выполняет индивидуальный растворитель или их смесь, так называемая « хроматографическая система».

В процессе хроматографирования, по мере того как растворитель поднимается вверх по пластинке за счет капиллярных сил, происходит разделение смеси веществ согласно их коэффициентам распределения между подвижной и неподвижной фазами.

Детектирование (обнаружение) веществ на хроматограмме проводят, в основном, следующим образом:

- визуально, если вещество имеет собственную окраску,

- облучая пластинку УФ-светом - для веществ, обладающих флуоресценцией (свечением), или способных поглощать УФ-излучение (темные пятна на флуоресцирующем фоне),

- с помошью хромогенных реакций: бесцветные вещества переводят в окрашенные соединения, обрабатывая хроматографическую пластинку соответствующими реагентами.

Идентификацию веществ на хроматограммах проводят по коэффициенту R_f - («эр эф», скорость фракционирования).

R_f - это величина, численно равная отношению длины пробега анализируемого вещества к длине пробега растворителя.

R_f - является константой вещества в заданных хроматографических условиях при строгом их соблюдении. Однако, в практике соблюдение всех условий хроматографирования затруднено. Величина R_f - может колебаться в зависимости от целого ряда факторов:

- техники работы,

- качества и активности сорбента,

- толщины слоя,

- чистоты растворителей,

- степени насыщения камеры парами растворителей,

- температуры,

- присутствия балластных веществ и т.д.

Таким образом, чаще пользуются не абсолютным, а относительным значением R_f, которое обозначается R_st.

Относительный коэффициент R_st численно равен отношению абсолютной величины R_f вешества к величине R_f метчика.

R_st = R_f вещества/ R_f метчика

В качестве метчика используется вещество, принятое за стандарт. Относительное значение R_f более воспроизводимо, т.к. с изменением хроматографических условий синхронно меняются значения R_f как исследуемого вещества, так и вещества-стандарта, а их отношение остается более или менее постоянным. При совпадении величин R_f исследуемого вещества и вещества, используемого в качестве свидетеля, можно предположить их идентичность. В условиях скрининга R_f исследуемого вещества сравнивают с табличными данными, полученными в аналогичных условиях.

Метод ТСХ получил наиболее широкое распространение из перечисленных выше хроматографических методов благодаря своей доступности и простоте выполнения, и в то же время высокой эффективности, чувствительности, экспрессности, достаточной избирательности (специфичности).

Тонкослойная хроматография применяется в системе общего и частного скрининга и разработана для многих лекарственных средств, имеющих токсикологическое значение.

Хроматографический скрининг на основе ТСХ для большого ряда лекарственных веществ, имеющих токсикологическое значение, был разработан на кафедре токсикологической химии I ММА Гладких Г.М.

В качестве неподвижной фазы используется силикагель, подвижной фазы - 7 различных систем растворителей. В общем скрининге чаще используют следующие системы растворителей:

1) для веществ кислотного, нейтрального и слабоосновного характера, извлекаемых органическим растворителем из кислого водного раствора (первая подгруппа), - хлороформ-ацетон (9:1);

2) для веществ основного характера, извлекаемых органическим растворителем из щелочных растворов (вторая подгруппа), - диоксан-хлороформ-ацетон-25% раствор аммиака (47,5:45:5:2,5);

3) в последнее время при анализе наркотических и одурманивающих веществ, а также в экспресс-анализе острых интоксикаций используют универсальную систему растворителей толуол-ацетон-этанол-25% аммиак (45:45:7,5:2,5)

Для обнаружения (детектирования) веществ на хроматогаммах разработана схема последовательного их проявления:

Для веществ первой подгруппы:

УФ ¾® ДФК + HgSO₄ ¾¾¾® FeCl₃ ¾¾¾® р-в Драгендорфа

(барбитураты) (производные (N-содержащие вещества пиразолона, слабоосновного характера)

салицил.к-та,

фенотиазины)

Для веществ второй подгруппы:

УФ ¾® FeCl₃ ¾¾® HClO₄ + NaNO₂ ¾¾® р-в Драгендорфа

(пиразолоны, (фенотиазины, (N-содержащие вещества

фенотиазины) бензодиазепины, основного характера)

тиоксантены)

При обнаружении веществ в общих системах переходят к исследованию в частных. Примеры частных систем:

Для барбитуратов - хлороформ - н-бутанол - 25% раствор аммиака (70:40:5), детектор – ДФК (дифенилкарбазон) и HgSO_4.

Для алкалоидов опия - этилацетат-метанол-25% раствор аммиака (17:2:1), детектор - реактив Марки.

Разработанная методика проста, универсальна и может быть использована как в клинических лабораториях при экспресс-анализе интоксикаций, так и в БСМЭ при судебно-химических исследованиях.

Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ)

ВЭТСХ возникла в начале 70-х годов как новое направление в ТСХ. По сравнению с ТСХ имеет ряд преимуществ:

-более высокая эффективность (за один прием можно разделить до 40 веществ)

-высокая чувствительность и экспрессность.

Высокая эффективность данного метода достигается за счет применения высокодисперсного сорбента, а более высокая чувствительность и экспрессность - более тонкого слоя сорбента (10-15 нм).

В ВЭТСХ так же, как и в ТСХ, в качестве сорбентов применяют силикагель, окись алюминия, целлюлозу, метилцеллюлозу, полиамид, инактивированный силикагель и др.)

Ввиду более высокой чувствительности метода и малого количества наносимого образца стремятся, чтобы первичная зона адсорбции (размер пятна) на старте не превышала в диаметре 2мм. Методы хроматографирования в ВЭТСХ существенно не отличаются от ТСХ. Методы обнаружения так же идентичны, только должны быть более чувствительными. Количественное определение веществ на хроматограмме проводят методом сканирующей денситометрии, дающей точные результаты и не требующей элюирования вещества с пластинки.

ВЭТСХ, так же как и ТСХ, может сочетаться с другими физико-химическими методами анализа – спектральными, ГЖХ, ВЭЖХ, что повышает надежность определения.

Газожидкостная хроматография (ГЖХ)

Теоретические основы метода и его возможности были рассмотрены ранее в лекции «Группа «летучих» ядов». ГЖХ нашла применение в анализе лекарственных веществ в качестве скринингового метода благодаря своей универсальности.

Необходимым условием является переведение исследуемого вещества в летучее состояние. Метод используется в анализе барбитуратов, алкалоидов и других лекарственных веществ в качестве общего и частного скрининга

Идентификация веществ проводится по относительным временам удерживания (или по индексам удерживания Ковача). Количественное определение - по высоте или площади пика с использованием метода внутреннего стандарта.

Достоверность определения повышается за счет хроматографирования на колонках, обладающих различной полярностью. Комитет по судебной токсикологии предлагает использовать колонки с неподвижными жидкими фазами - SE - 30 и OV 17 и 225. Детектор - пламенно-ионизационный.

Подтверждающие исследования лучше проводить методами, отличающимися от скринингового, с равной или большей чувствительностью: тонкослойной хроматографии, масс-спектрометрии.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

ВЭЖХ, или жидкостная хроматография высокого давления, является вариантом колоночной жидкостной хроматографии, где элюент подается на колонку под большим давлением, что ускоряет проведение анализа. Разделение веществ проводится на колонках, заполненных мелкодисперсным сорбентом (силикагель, окись алюминия) или полимерным сорбентом.

При работе с колонками, заполненными силикагелем, в качестве элюента используются углеводороды, иногда с добавлением небольшого количества спирта или других растворителей (нормальнофазный вариант).

В обращеннофазном варианте к силикагелю прививают гидрофобную фазу - обычно это углеводороды с большим числом углеродных атомов, например, С₁₈ (торговые названия сорбента - Сепарон С_18, Силасорб С₁₈). В этом случае в качестве элюента используют смеси метанола или ацетонитрила с водой или буферными растворами.

В качестве детекторов обычно применяют спектрофотометрический детектор с переменной (от 190 до 900 нм) или с фиксированной (чаще 254 нм) длиной волны. Могут быть использованы и другие детекторы - рефрактометрический, флуорометрический, ионизационно-пламенный, масс-спектрометрический, электрохимический и т.д.

Выходящие из колонки вещества регистрируются на хроматограмме в виде ряда хроматографических пиков. Идентификацию веществ проводят по параметрам удерживания и спектрам (при детекторе с переменной длиной волны). Количественное определение - по площади пика, которая пропорциональна количеству вещества в пробе. При этом предварительно строится калибровочный график с использованием методов абсолютной калибровки или внутреннего стандарта.

Метод ВЭЖХ может быть использован в качестве общего и частного скрининга. Он позволяет сочетать изолирование и очистку вещества с его идентификацией и количественным определением.

Значительным преимуществом этого метода перед ГЖХ является возможность анализа термолабильных нелетучих соединений как с малой, так и с большой молекулярной массой. Особенно удобен метод ВЭЖХ для работы в клинических лабораториях токсикологических центров при исследовании биологических жидкостей.

Спектральные скрининговые методы

Для скрининга лекарственных веществ могут быть применены:

1. Абсорбционная спектроскопия в видимой и УФ областях

2. ИК-спектроскопия

3. Спектроскопия ЯМР (ядерного магнитного резонанса)

4. МС (масс-спектрометрия)

Из перечисленных методов более доступным и в то же время достаточно информативным и чувствительным является метод абсорбционной спектроскопии в видимой и УФ областях.

Абсорбционная спектроскопия

С точки зрения квантово-механических представлений поглощение (абсорбция) веществом света, т.е. потока фотонов или электромагнитного излучения, в видимой и ультрафиолетовой областях связано с переходом электронов внешних орбиталей (валентных электронов) из основного состояния (с меньшей энергией) в возбужденное состояние (с большей энергией). При этом энергия поглощенного фотона:

DЕ= Е₁-Е₀, где

DЕ - энергия поглощенного фотона

Е₁ - энергия электрона в возбужденном состоянии

Е₀ - энергия электрона в основном состоянии

DЕ= h*n или DЕ= h*c/l, где

h -постоянная Планка

n - частота излучения

с - скорость света

l - длина волны

Поскольку h и c величины постоянные, очевидно, что энергия поглощенного излучения будет обратно пропорциональна l.

Согласно хромофорно-ауксохромной теории избирательным поглощением в видимой и УФ областях спектра обладают вещества, имеющие в своей структуре определенные группы атомов - хромофоры.

Хромофоры содержат одну или несколько кратных (двойных) связей, или неподеленные пары электронов. Например:

С=С этиленовая группа

С=О карбонильная группа

N=О нитрозогруппа

N=N диазогруппа

С=N азометиновая группа

С₆ Н₆ бензольное ядро

Иногда в молекуле наряду с хромофорами находятся ауксохромные группы, которые не обладают собственным поглощением, но усиливают поглощение хромофоров. К таким группам относятся:

- NH₂ аминогруппа

- ОН гидроксильная группа

- ОСН₃ метоксигруппа

- N(СН₃)₂ диметиламиногруппа

- CL, Br, F,I –галогены

Идентификацию веществ в условиях скрининга проводят по спектрам поглощения. Кривая зависимости светопоглощения от длины волны (l) называется спектром поглощения и является качественной характеристикой вещества.

Характер спектра может меняться в зависимости от:

- природы растворителя (тонкая структура в неполярных растворителях);

- рН раствора для веществ, способных к ионизации, если молекулярная и ионизированная формы обладают различным светопоглощением.

Получение спектров поглощения в различных условиях повышает информативность метода.

Наряду с идентификацией веществ по характеру спектра можно провести их количественное определение, измеряя интенсивность поглощения в области максимума. Расчет концентрации вещества проводят по уравнению Бугера-Ламберта-Бера:

Д=Е^1%* l * C, где

^{1 см}

Д - оптическая плотность,

Е- удельный показатель поглощения

l - толщина светопоглощающего слоя

С - концентрация вещества (в %)

Измерение абсорбции (Д) проводят на спектрофотометрах различных марок, дающих монохроматическое излучение, т.к. закон Бера справедлив только для монохроматического излучения.

В условиях скрининга сравнивают спектры поглощения исследуемого вещества со спектрами эталонов (стандартов).

В настоящее время предложен групповой скрининг для 450 лекарственных веществ.

К достоинствам спектральных методов анализа следует отнести:

- универсальность, что позволяет анализировать различные классы химических соединений

- высокую чувствительность (мкг)

- достаточную информативность

К недостаткам - необходимость высокой степени чистоты исследуемых веществ, поэтому рекомендуется сочетать спектральные методы анализа с предварительной очисткой веществ, например, с помощью ТСХ или других методов.