Криосохранение клеток

Лекция 15

Цель:рассмотреть методы хранения культуры клеток, преимущества криосохранения клеток растений, основные этапы, а также трудности, возникающие в связи с особенностями растительных клеток.

План лекции:

1. Замедление роста клеток

2. Основные этапы криосохранения

2.1 Подготовка культуры

2.2 Замораживание и хранение

2.3 Оттаивание и удаление криопротектора

2.4 Рекультивирование клеток и их оценка после криосохранения

1 В настоящее время осуществляется создание новых сортов растений и регулярная смена, что связано, в первую очередь, с утратой сортом ценных признаков, появлением новых попу­ляций вредителей и возбудителей болезней, изменением климата, поч­вы и множеством других причин. Средний срок жизни сорта пшеницы и других зерновых культур обычно 5-10 лет. Для выведения новых сор­тов и улучшения старых требуется разнообразный генетический матери­ал. В целях сохранения генофонда редких и исчезающих видов, цен­ных селекционных объектов и штаммов - продуцентов экономически важ­ных веществ разрабатываются методы создания коллекций и банков генов in vitro.

Основным источником генов являются семена. Для создания новых клеточных линий. синтези­рующих ценные продукты, необходимо хранение коллекции клеток, то есть эталонов клеток-продуцентов, обладающих определенными характерис­тиками. Для исследования физиологических и биохимических процессов в культивируемых клетках возникает необходимость длительного сохра­нения исходных стандартных линий клеток. Таким образом, для решения задач требуются методы хранения культуры клеток. Есть два подхода в решении данной проблемы: замедление роста клеток и хранение в замороженном состоянии, то есть крио­сохранение (от греч. kгyos - «мороз», «лед»). Задача состоит в том, чтобы изменить кинетику роста культуры и уве­личить время между пересадками. Это позволило бы пересаживать куль­туры раз в 3-4 месяца, год и даже реже. В настоящее время замедление роста под влиянием факторов, ограничивающих рост, достигнуто лишь для культур побегов и растений-регенерантов.

Наиболее действенный путь замедления роста состоит в снижении тем­пературы культивирования в сочетании с пониженным освещением. Вы­бор температуры определяется холодостойкостью вида растения. Так, для депонирования коллекций картофеля использовалась температура 10 ^оС, а яблони 1 ^оС. Рекомендуют для культур, нормально растущих при 20 – ­25 ^оС, использовать 4-10 ^оС.

Рост растения можно также замедлить добавлением к питательной сре­де осмотиков - маннита и сорбита, повышением концентрации сахарозы или внесением в питательную среду веществ, тормозящих рост. В качес­тве последних были использованы гидразид малеиновой кислоты, 2,2­-метилгидразид янтарной кислоты, хлорхолинхлорид, абсцизовая кисло­та. В крайне редких случаях для за­медления роста используют снижение содержания кислорода - гипоксию. Условия гипоксии создают применяя смесь 90% азота и 10% кислорода. Иногда уменьшают концентрацию кислорода и одновременно снижают атмосферное давление. Во избежание истощения питательных веществ и обезвоживания объем агаризованной среды для медленно растущих куль­тур увеличивают. Если используется жидкая питательная среда, ее время от времени доливают, поскольку она активнее испаряется.

2 Криосохранение - это глубокое замораживание и хранение при сверхнизких температурах, например при температуре жидкого азота (-196°С). Такая температура гарантирует стабильное сохранение генетических характеристик объектов практически в течение любого срока. Данный метод позволяет хранить самый разнообразный материал - от изолированных протопластов до зародышей и семян. В настоящее время глубокое замо­раживание клеток, тканей и органов получило широкое распространение в медицине и животноводстве. Иначе обстоит дело с растительным мате­риалом. Главные трудности связаны со спецификой растительных клеток и с самим процессом глубокого замораживания. Растительные клетки, имеющие большие размеры, большие вакуоли и много воды, сильнее повреждаются при замораживании и последующем оттаивании. Поврежде­ние клеток связано с образованием льда как внутри клеток, так и снару­жи. Лед обычно образуется сначала во внешнем растворе вокруг клеток. Точка замерзания цитоплазмы минус 1 ^оС, но клетки остаются не замер­зшими до -10-15 ^оC, так как до этого плазмалемма еще предотвращает проникновение внутрь кристаллов льда, растущих во внешнем растворе. Рост кристаллов льда внутри клетки разрушает ее мембраны.

Если температура снижается медленно, то клетка успевает потерять часть свободной воды, которая выходит из нее и замерзает на поверхнос­ти медленно растущих кристаллов во внешнем растворе. Очень быстрое замораживание не сопровождается дегидратацией и приводит к возник­новению кристаллов льда в цитоплазме. Медленное замораживание мо­жет полностью исключить кристаллизацию воды в клетке, но при этом неизбежно происходит значительная дегидратация и сжатие протоплаз­мы. Обезвоживание клетки происходит вследствие концентрирования внешнего раствора из-за образования в нем льда. Чрезмерный плазмо­лиз и вызванный им осмотический стресс (особенно при последующем деплазмолизе) приводит клетку к гибели.

Таким образом, причиной гибели клеток при замораживании является образование льда внутри клетки и механическое повреждение ее мембран, а также осмотический стресс, обусловленный сильным обезвоживанием клетки. Следовательно, все приемы, используемые в криосохранении, на­правлены на определенную сбалансированность обоих повреждающих фак­торов. Выживание клеток растений зависит от целого ряда условий: гене­тических и морфофизиологических их особенностей и способности к холо­довому закаливанию, состава и количества природных или искусственно добавляемых криопротекторов, уровня проницаемости этих веществ и воды, скорости снижения температуры и условий оттаивания.

Работа по криосо­хранению культуры клеток состоит из следующих этапов (рис.18): - подготовка культуры клеток,

- добавление криопротектора,

- программное замораживание,

- хранение в жидком азоте,

- быстрое оттаивание,

- удаление криопротектора,

- рекультивирование и регенерация растений.

Рис.18. Этапы криосохранения культуры клеток

2.1 Остановимся на основных этапах криосохранения клеток. Экспериментально показана возможность хранения при сверхнизких температурах культивируемых клеток, изолированных меристем, кончи­ков побегов, зародышей, пыльцы. Однако для криосохранения столь раз­личающихся между собой объектов, конечно, требуются различные подходы и условия начиная с самого начального этапа работы. Лучше всего методы криосохранения разработаны для суспензионных культур. Мелкие меристемоидные клетки более устойчивы к замораживанию, чем крупные вакуолизированные клетки. То же касается мелкодис­персных суспензий с рыхлыми агрегатами клеток по сравнению с больши­ми плотными массами клеток. Клетки тропических видов растений могут оказаться менее устойчивыми, чем клетки растений умеренной зоны. Для более сложно организованных структур, таких, как меристемы, зароды­ши, эмбриоиды, требуется оптимизация условий каждого этапа. Особое значение имеет специальная подготовка культуры, целью ко­торой является обогащение ее клетками меристематического типа. Длительное культивирование в осмотике, синхронизация деления клеток, сокращение сроков пересадки способствуют уменьшению размеров клет­ки и увеличивают их выживаемость. На отдельные культуры положитель­ное влияние на жизнеспособность клеток оказывает пред

варительное куль­тивирование с некоторыми аминокислотами, благодаря увеличению уровня эндогенных сахаров в клетках. Для суспензионных культур важным мо­ментом подготовки является концентрирование.

2.2 Криопротекторы - это вещества, которые снижают точку за­мерзания, связывают внутриклеточную воду и защищают клетки от механического и осмотического стресса. К ним относятся диме­тилсульфоксид (ДМСО), глицерин, пролин и сахароза, которая является для растений естественным криопротектором. Сами криопротекторы тоже могут вызвать осмотический стресс, поэтому подбираются их оптималь­ные концентрации и сочетания.

ДМСО обладает уникальной проникающей способностью, это особен­но важно для крупных плотных организованных структур, например ме­ристем. Для них этап подготовки заключается, главным образом, в пред­варительном культивировании с добавлением в среду 5% ДМСО. Это обес­печивает создание эффективных криозащитных концентраций по всему апексу, размер которого около 0,3-0,5 мм.

Наряду с выбором криопротекторов, причем именно для данных кле­ток, очень важно найти оптимальную программу замораживания. Разли­чают медленное постепенное замораживание, быстрое и сверхбыс­трое. При медленном постепенном замораживании температура в интер­вале от 0 ^о до - 40^о снижается со скоростью 0,5-1 ^о в мин. При быстром замораживании объект в ампуле с криопротектором погружается сразу в жидкий азот. При сверхбыстром замораживании сам объект непосред­ственно вводится в жидкий азот. Пыльцу можно замораживать в сухом виде, запечатанную в специальные пластмассовые ампулы, погружая их в жидкий азот. Данные, полученные криобанком ИФР в Москве: показывают, что бо­лее успешные результаты дает программированное замораживание. Для этого требуются специальные конструкции с рабочей камерой, охлаждае­мой с запрограммированной скоростью введением паров жидкого азота.

2.3 Оттаивание и восстановление роста культур - ответственные и часто критические этапы процесса. При слишком медленном оттаивании клеток в них происходит повторное образование льда, оказывающее поврежда­ющее действие. Быстрое оттаивание предотвращает это. Оттаивание про­изводят погружая ампулы в теплую баню (+40 ^оС) либо капая на замороженные объекты теплую воду или среду для культивирования. Однако в исключительных случаях более целесообразным оказывается медленное оттаивание.

После оттаивания удаляется криопротектор, что обычно делается на холоде. Основная часть физических изменений в клетках происходит при замораживании и оттаивании, однако только что оттаявшие клетки силь­но предрасположены к дальнейшим повреждениям и поэтому требуют тща­тельного «выхаживания». Это начинается с прямого пересаживания кле­ток на восстанавливающую среду без промывки с сохранением в клетках криопротекторов. Часто криопротектор удаляется специальными ус­ловиями отмывки.

2.4Состояние культур оце­нить очень сложно, когда материал находится на криосохранении. Оценка проводится после оттаивания и нужна для ис­пользования культур. Для быстрой оценки культур наиболее пригодны тес­ты на

жизнеспособность. Тесты желательно проводить не сразу после оттаивания, а на следующий день. Тесты проводят периодически в процессе возобновления роста для контроля за увеличением содержания жиз­неспособных клеток или живой ткани.

Для образцов, видимых под микроскопом в проходящем свете, т. е, клеточных суспензий, протопластов, небольших каллусных и организован­ных структур, используют окрашивание флуоресцеиндиацетатом, феносафранином. Для каллусов и плотных крупных организо­ванных структур используют соли тетразолия.

Количественной оценкой выживания является рост. Изучают рост культивируемых клеток используя любые стандартные методы измерения роста, включая прирост сырой и сухой массы, объем осевших клеток, оп­тическую плотность клеток, прямое микроскопическое наблюдение. Стан­дартные цитологические методы позволяют оценить степень поврежде­ний и восстановительных процесса в, происходящих в тканях. Еще более точные данные получают при исследовании ультраструктуры в электрон­ном микроскопе.

Учитывая гетерогенность культур клеток, их подготовку к заморажива­нию, нельзя полностью исключить возможность проявления селективных преимуществ для какой-нибудь субпопуляции, в особенности при низкой выживаемости после оттаивания. Поэтому бывает нужна генетическая, физиологическая и биохимическая проверка.

На этапе рекультивирования иногда применяют известные приемы ин­тенсификации роста клеток во избежание селекции возможных мутантных холодоустойчивых клеток. Установлено, что хранение в жидком азоте не влияет на выживание и возобновление клеточных культур. Рекультивированные после хранения в жидком азоте клеточные культуры идентичны исходным и пригодны для биотехнологического применения.

Таким образом, криобанк клеток, меристем, пыльцы обеспечивает сохранение генофонда не только культивируемых in vitro штаммов-продуцентов, но и редких и исчезающих видов, что особенно важно для вегетативно размножаемых растений.

Контрольные вопросы:

1. Способы сохранения генофонда in vitro.

2. В чем преимущество криосохранения клеток?

3. Что такое криопротектор?

4. Подготовка клетки к криосохранению.

5. Как осуществляют замораживание и оттаивание клеток?

Список использованной литературы

1. Валиханова Г.Ж. Биотехнология растений. –Алматы: Конжык, 1996.- 272 с.

2.Андреева А. Биотехнология. –Караганда, 2000.

3. Приходько Н.А., Зимина В.Н. Биотехнология микроорганизмов.-Шымкент, 2006.-204 с.

4. Мухаметжанов С.К., Валиханова Г.Ж., Ережепов А.Е. Методическое руководство к лабораторным занятиям по культуре тканей и биотехнологии растений.-Шымкент, 2007.-108 с.

5. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.В. Методы культуры
тканей и клеток в физиологии и биохимии растений. –Киев: Наукова Думка,
1980.

6.Валиханова Г.Ж., Рахимбаев И.Р., Каржасова А.В., Бишимбаева Н.К.
Методическое руководство к практическим занятиям по культуре тканей
растений. -Алма-Ата: КазГУ, 1983.

7.Катаева П.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений.-
М.: Наука, 1983.

8.Глеба Ю.Ю., Сытин к К.М. Клеточная инженерия растений. -Киев:
Наукова думка, 1984.

9.Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. -М: Наука,
1986.

10. Клеточная инженерия / Бутенко Р.Г., Гусев MB., Киркин А.Ф.
Биортехнология, Т. 3. -М.; Высшая школа, 1987.

11. Биотехнология растений: культура клеток. - М;
Агропромиздат, 1989.

12.Муромцев Г.С, Бутенко Р.Г.. Тихоненко Г.И., Порофьев М.И.
Основы сельскохозяйственной биотехнологии. -М.; Агропромиздат, 1990.

13. Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной
биотехнологии: Методические указания / Г.М. Артамонова, СИ. Герасимова,
СВ. Дегтярев, Е.З. Кочиева, Д.В. Калашников, И.К. Блиновский, Л.И.
Хрусталсва. Под ред. акад. ВАСХНИЛ B.C. Шевелухи.- М.: МСХА, 1991.

14. Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология
микроклонального размножения растений. -Киев: Наукова думка, 1992.

15. Heslop-Hamson J., Dodds J.H., Roberts L.W. Experiments in Plant
Tissue Culture. Cambridge University Press, 1995.

16. Gamborg O.L., Phillips G.C Plant Cell, Tissue and Organ Culture.
Springer- Veiiag 1995.

17. Smith R.H. Plant Tissue Culture: Techniques and Experiments.
Academic Press, 2000.

18. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. -М.; Агропромиздат. 1990.-384 с.

Мамырбекова Айгуль Кумекбаевна, Абубакирова Ажар Абдугаппаровна

Биотехнология растений

Редактор

Подписано в печать

Формат бумаги X^xY 1/16

Бумага типографская. Печать офсетная. Объем …п.л.

Тираж ….экз. Заказ № …*

© Издание Южно-Казахстанского государственного университета

им. М.Ауезова

Издательский центр ЮКГУ им. М.Ауезова, г. Шымкент, пр. Тауке хана, 5