Генетическая инженерия

Лекция 11

Цель:доказать, чтогенетическая, или генная, инженерия, это конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или, иначе, создание искусственных генетических программ. Генная инженерия имеет целью изучение механизмов функционирования генетического аппарата эукариот, что другими приемами сделать невозможно.

План лекции:

1. Теоретические основы генетической инженерии

2. Создание рекомбинантных ДНК

3. Трансгенные растения

4. Перспективы развития генной инженерии

1 В 1972 г. Пол Берг с сотрудниками опубликовали первую работу о получении in vitro (вне организма) рекомбинантной (гибридной) молекулы ДНК, состоящей из фрагментов фаговой, бактериальной и вирусной ДНК. Так родилась новая отрасль молекулярной биологии, получившая название «генетическая (генная) инженерия». Своей целью она имеет создание новых генетических структур и, в конечном счете, создание организмов с новыми наследственными свойствами.

В том же году появилась первая публикация, в которой сообщалось о получении in vitro рекомбинантной ДНК, состоящей из фрагментов разных молекул ДНК: вирусной, бактериальной и фаговой. Работа была выполнена американским ученым Полем Бергом с сотрудниками и ознаменовала рождение новой отрасли молекулярной биологии генетической (генной) инженерии.

А.А. Баев был первым в нашей стране ученым, который поверил в перспективность генной инженерии и возглавил исследования в этой области. Генетическая (генная) инженерия, по его определению, это конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или создание искусственных генетических программ. Генная инженерия имеет целью изучение механизмов функционирования генетического аппарата.

Интроны – это участки ДНК, разбивающие экспрессируемую, то есть кодирующую часть гена на участки, называемые экзонами. Впервые феномен существования прерывистых генов был открыт при изучении аденовируса и подтвердился в 1977 г. при исследовании гена глобина мыши и рибосомных генов плодовой мушки Drosophilla melanogaster. В одном гене может находиться довольно много интронов.

В процессе транскрипции РНК-полимераза снимает копию со всего гена. Затем специальные сплайсинг-ферменты осуществляют «монтаж» (сплайсинг) транскрипта, вырезают интроны и «склеивают» экзоны друг с другом. В результате чего образуется зрелая, но еще модифицированная мРНК.

Рисунок 13- Сегмент генома в процессе транскрипции

Эукариот, включая человека, что другими приемами сделать невозможно. Вместе с тем, генная инженерия ставит перед собой обширные практические задачи, немало из которых уже решено. Прежде всего это получение путем бактериального синтеза ряда лекарственных средств, например, инсулина, интерферонов. Важнейшим достижением является создание диагностических препаратов. Получение так называемых трансгенных растений открывает принципиально новые возможности для растениеводства в создании сельскохозяйственных культур, устойчивых к экстремальным воздействиям и инфекционным поражениям. Это далеко не полный перечень практических свершений генной инженерии.

После первых успешных экспериментов с рекомбинацией молекул ДНК в пробирке появились первые сомнения и опасения, не принесет ли генная инженерия вред природе и человечеству. В июле 1974 года несколько крупных ученых обратились к научной общественности с предложением наложить мораторий на работы с рекомбинантными ДНК in vitro. В феврале 1975 года в Калифорнии на Асиломарской конференции собрались 140 ученых разных стран, работающих в области генной инженерии. Всесторонне изучив результаты и возможные последствия, ученые пришли к выводу, что потенциальные опасности невелики, так как рекомбинантные штаммы в природных условиях нежизнеспособны и их бесконтрольное распространение маловероятно. Было решено

прервать мораторий и продолжить исследования с соблюдением специально разработанных правил. Сегодня мы можем отметить, что почти за четверть века своего существования генная инженерия не причинила никакого вреда самим исследователям, не принесла ущерба ни природе, ни человеку. Свершения генной инженерии как в познании механизмов функционирования организмов, так и в прикладном плане весьма внушительны, а перспективы поистине фантастичны.

Молекулярная биология заявила о себе в качестве самостоятельной науки в 1953 году, когда Джеймс Уотсон и Френсис Крик открыли знаменитую двойную спираль ДНК и постулировали матричный механизм ее синтеза.

В соответствии с этим механизмом двойная спираль ДНК при репликации разделяется и каждая цепь служит матрицей для синтеза дочерней цепи, которая по своей первичной структуре является зеркальным отражением матрицы (рис. 14). В результате такого матричного синтеза образуются две совершенно идентичные двуспиральные молекулы ДНК, каждая из которых передается в дочерние клетки. Последние получают всю генетическую программу от родительской клетки. По такому же матричному механизму осуществляется синтез РНК, только РНК синтезируется в виде односпиральной цепи, которая комплементарна ДНК – матрице.

Рисунок 14- Транскрипция ДНК

Этот процесс получил название транскрипции. А процесс и синтеза белка на РНК-матрице (м-РНК) происходит на рибосомах, и структура белка соответствует структуре м-РНК. Это очень сложный процесс, он называется трансляцией (рис. 14), и в нем участвует транспортная РНК (т-РНК). Она доставляет в рибосому аминоксилоты и адаптирует язык м-РНК к языку белка. Таким образом, процесс матричного синтеза ДНК определяет передачу наследственной информации от родительской клетки в дочернюю. В процессе матричного синтеза РНК происходит передача информации (генетического кода данного белка)от ДНК на м-РНК, а м-РНК переносит информацию на рибосому, где она реализуется в виде конкретной структуры белка.

При половом процессе может происходить обмен участками между двумя хромосомами (молекулами ДНК) от двух скрещиваемых индивидуумов. Этот процесс получил название рекомбинация, и в клетке чаще всего он может происходить только между гомологичными хромосомами, так как комплементарные по своей структуре молекулы ДНК притягиваются друг к другу и обмениваются генетическими детерминантами, в результате чего образуется дочерняя хромосома, содержащая элементы структуры от двух родительских хромосом. Открытый недавно процесс негомологичной рекомбинации осуществляется только в том случае, если в одной из взаимодействующих молекул ДНК есть гены, кодирующие специальные ферменты разрезания ДНК.

Рисунок 15 – Схема организации хромосомного материала

Следующее важное открытие, предопределившее возникновение генной инженерии, обнаружение в бактериальных клетках внехромосомных маленьких кольцевых молекул ДНК. Эти минихромосомы впервые были обнаружены в начале 50-х годов и получили название плазмид. Плазмиды обладают способностью к автономной от хромосомы репликации, поэтому плазмиды содрежатся в клетке в виде нескольких копий. Различаются плазмиды по генетическим детерминантам. Очень важно, что плазмиды из-за своих малых размеров могут быть выделены из клетки в неповрежденном, нативном состоянии.

В 1970 году американцы Келли и Смит с сотрудниками выделили первую рестриктазу фермент, который вызывает гидролиз ДНК в строго определенных местах с образованием так называемых липких концов. Существование таких ферментов-рестриктаз было доказано в опытах швейцарцев Линна и Арбера в конце 60-х годов. В настоящее время описано множество таких ферментов, которые применяются в генной инженерии.

Таким образом, к началу 70-х годов были сформулированы основные принципы функционирования нуклеиновых кислот и белков в живом организме и созданы теоретические предпосылки генной инженерии.

2 Как уже указывалось, процесс рекомбинации в организме (in vivo) возможен в большинстве случаев между гомологичными молекулами ДНК. Однако оказалось, что in vitro притягивание и взаимодействие (гибридизация) молекул ДНК возможно, если они будут иметь небольшие комплементарные односпиральные участки из четырех и более нуклеотидов на концах молекул (в настоящее время описаны двенадцатинуклеотидные липкие концы). Такие комплементарные односпиральные последовательности получили название липких концов, так как две молекулы ДНК могут соединиться (слипнуться) этими концами. Таким образом, если в пробирку поместить самые разные молекулы ДНК с одинаковыми липкими концами, то будет происходить рекомбинация, даже если вся их структура очень различается.

Как же получить гетерогенные молекулы ДНК с одинаковыми липкими концами? Для этого используются ферменты-рестриктазы, которые «умеют» разрезать молекулы ДНК так, что у них образуются одинаковые (комплементарные) липкие концы. Происходит такое разрезание в участках, несущих особым образом повторяющиеся последовательности нуклеотидов. Рестриктазы узнают эти последовательности и разрезают ДНК в точках повтора: в результате односпиральный конец одной молекулы оказывается комплементарным (липким) концу другой молекулы.

Теперь, чтобы полученные в пробирке генные конструкции заработали, необходимо их ввести в подходящую бактериальную клетку. Вот тут –то и пригодятся плазмиды. В генной инженерии их называют векторами (повозки, которые доставляют в клетку клонируемый ген). Для этого плазмиды тоже режут рестриктазами, чтобы получить односпиральные концы, комплементраные концам генов, проводят гибридизацию гена и плазмиды в пробирке, а затем рекомбинантную плазмиду (ее называют еще химерной) вводят в клетку. Плазмиды, которые используются в генной инженерии, имеют очень важное свойство: они содержат так называемый маркерный ген, например ген, сообщающий клетке устойчивость к определенному антибиотику. Благодаря этому клетки, несущие рекомбинантную плазмиду, легко отделить от клеток, не имеющих такой плазмиды. Для этого бактерии высевают на среду с антибиотиком, на которой будут расти только клетки с плазмидой – так называемые рекомбинантные клетки, а процедура их отбора получила название молекулярного клонирования, так как рекомбинантные клетки представляют собой потомство одной молекулы ДНК.

В рекомбинантных клетках химерная плазмида, несущая чужеродный ген, начинает функционировать, то есть совершаются процессы репликации, транскрипции и трансляции нового введенного в клетку гена и синтезируется продукт этого гена, который в природных клетках никогда ранее не мог образоваться. Таким образом, in vitro проводится только рекомбинация, а все остальные превращения с химерной плазмидой происходят в клетке так же, как и со своими собственными генами. Иными словами, теперь можно ввести в бактериальную клетку ген, полученный из любого организма, и заставить чужеродный ген там функционировать.

Итак, основные процедуры в генной инженерии сводятся к следующему (рис. 16):

1) рекомбинация in vitro ДНК-вектора и ДНК – гена;

2) введение рекомбинантной плазмиды в клетку;

3) молекулярное клонирование.

Рис. 16 Принципиальная схема манипуляции генной инженерии

3 Веками селекционеры работают над выведением новых сортов культурных растений, придавая им свойства, необходимые для практического использования. Достаточно сравнить цветок розы с цветком шиповника, чтобы убедиться, сколько велики достижения трудов человеческих. Правда, при этом вспоминаешь, что путь от диких предков к культурным растениям простирается на десятки тысяч лет. При этом чем лучше сорт растения или порода животного, тем они капризнее, больше подвержены различным вирусным и микробным заболеваниям, малоустойчивы к насекомым, засухе и т.д.

И вот генные инженеры решили помочь селекционерам сделать культурные растения такими же устойчивыми к болезням и различным экстремальным воздействиям, как и их дикие предки.

С этой целью была разработана система переноса в растения различных чужих генов, которые могут сообщать растениям полезные свойства. Наиболее распространен перенос генов с помощью вируса, поражающего фитопатогенную бактерию Agrobacterium tumefaciens. Плазмида найденного в клетках А. tumefaciens способна переносить часть своей ДНК в растительные клетки. Именно в эту ДНК встраивается необходимый «полезный» ген. Растения, в хромосому которых встраивается чужой ген, называется трансгенными. Впервые трансгенные растения были получены в 1982 году учеными из Института растениеводства в Кельне и компании Monsato. В результате растения приобрели устойчивость к антибиотику канамицину, ингибирующему рост.

Одна из важных задач – получение растений, устойчивых к вирусам, так как в настоящее время не существует прямых способов борьбы с вирусными инфекциями сельскохозяйственных культур. Ученые из университета штата Вашингтон решили, что устойчивость к вирусам можно «привить» растениям, вводя в растительные клетки гены белка оболочки вируса табачной мозаики. Эксперимент полностью подтвердил это предположение: интенсивный синтез белка оболочки любого вируса в клетках растений вызывает устойчивость к данному вирусу. В настоящее время получены трансгенные растения, способные противостоять воздействию более десятка различных вирусных инфекций. Еще одна задача связана с защитой растений от насекомых-вредителей. Применение инсектицидов не вполне эффективно, во-первых, из-за их токсичности, во-вторых, потому, что дождевой водой они смываются с растений. В генно-инженерных лабораториях Бельгии и США были успешно проведены работы по внедрению в растительную клетку генов, отвечающих за синтез инсектицидов бактериального происхождения. Эти гены ввели в клетки картофеля, томатов и хлопчатника. Трансгенные растения картофеля и томатов были устойчивы к колорадскому жуку, растения хлопчатника оказались устойчивыми к разным насекомым, в том числе к хлопковой совке. Применение инсектицидов было сокращено на 40-60 %.

Генные инженеры вывели трансгенные растения с удлиненным сроком созревания плодов. Такие помидоры, например, можно снимать с куста красными, не боясь, что они перезреют при транспортировке.

Список растений, к которым успешно применены методы генной инженерии, составляет около пятидесяти видов, включая яблоню, сливу, виноград, капусту, баклажаны, огурец, пшеницу, сою, рис и много других сельскохозяйственных растений, возделывание которых в ближайшем будущем будет существенно облегчено благодаря генетическим модификациям.

При использовании Agrobacterium вводимая ДНК (чужеродный ген) включается в бактериальную плазмиду. Бактериями, несущими химерную плазмиду, заражают клетки растений и переносят в них нужную ДНК. Второй метод так называемая ДНК –пушка состоят в том, что растительные клетки бомбардируют металлическими частицами, покрытыми ДНК. В обоих случаях попавшая в клетку ДНК встраивается в ее хромосомы, затем клетка делится, из нее регенерирует целое растение.

4 Уже первые шаги в области изучения рекомбинантных молекул позволили считать, что достигнут не просто успех, но осуществлен прорыв, открывающий новые пути для познания наследственности. Возникли исключительные условия для изучения механизмов функционирования и структурной организации генома. Используя методы генной инженерии, ученые сделали много поразительных открытий. К одному их них относится явление дискретности генов эукариот. Если раньше было признано положение о коллинеарном переносе генетической информации от ДНК на мРНК и от мРНК на блок, то сейчас установлено, что гены растений имеют внутри такие последовательности, которые после транскрипции удаляются и не копируются в структуре белка. Значимые части гена назвали экзонами, а удаляемые части интронами. Последовательности РНК, соответствующие интронам, вырезаются и не транслируются, а последовательности, соответствующие эксзонам, сшиваются специальными ферментами. Процесс получил название сплайсинг.

Другое очень важное открытие. Было известно, что у бактерий, да и не только у них, в составе генома имеются такие гены, которые перемещаются, мигрируют, меняют свое место на хромосоме. Генная инженерия позволила глубже проникнуть в природу подвижных элементов, изучить их структуру, механизмы действия и биологическую роль. Именно при перемещении подвижных элементов (транспозонов) и происходит часто негомологичная рекомбинация.

Контрольные вопросы:

1. Назовите основной материал, который используют генные инженеры.

2. Назовите основные методы генной инженерии.

3. Основные направления и перспективы развития генной инженерии.

4. Как создаются трансгенные растения?