Реферат: Макрофаги перитонеального экссудата как модель фагоцитоза и нарушений фагоцитарной активности

Макрофаги

Свободные Резидентные

Перитонеальные Печеночные

Легочные

Активация – не только повышение активности и усиление метаболизма, цитотоксичности, но и увеличение числа вовлеченных в процесс клеток.

Макрофаги

Активированные 5% Интактные 95%

Активация

Специфическая Неспецифическая

(с помощью Тх1 и АТ) (разл. фарм. препараты, ЛПС, токсины)

Модель на перитонеальных МФ

Среда 199 (пит.в-ва,

а/б, T=37°)

Регистрация данных

1. Прямой визуальный подсчет

2. Оценка хемотаксиса методом Бойдена

3. НТС-тест

4. Хемилюминесценция

5. Радиометрия

6. Ферментативные методы

7. Иммунологические методы

Цитотоксичность

БЦЖ, Циклофосфамид (Активация) ИЛ-1, ФНО, Ростовые факторы, PG E2

Атипичные

клетки не

чувствительны

к данным агентам

Опыт с хитозаном

Макрофаг Т-лимфоцит

Усиление контактного вза­имодействия тимоцитов с макрофагами ИЛ-2, ИФγ Активация МФ

36

Содержание

Краткий экскурс в историю…………………………………………………………………………………………….. 2

Современное состояние учения о фагоцитозе……………………………………………………………..5

Макрофаги перитонеального экссудата как модель

фагоцитоза и нарушений фагоцитарной активности…………………………………………….13

Получение модели………………………………………………………………………………………………………….14

Методы регистрации результатов…………………………………………....................................................14

Некоторые моделируемые процессы

СНИЖЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ

МАКРОФАГОВ МЫШЕИ В УСЛОВИЯХ СОЧЕТАННОГО

ПРИ­МЕНЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВОГО ЭНТЕРОТОКСИНА ТИПА А И ЭНДОТОКСИНА………………………………………………17

ОТМЕНА УСИЛИВАЮЩЕГО ФАГОЦИТОЗ ДЕЙСТВИЯ ОПСОНИНОВ

С ПОМОЩЬЮ ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ ПРОТИВ Fc-РЕЦЕПТОРОВ МАКРОФАГОВ……………………………...................................18

УСИЛЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ ХИТОЗАНА РЕАКЦИИ

КОНТАКТНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МАКРОФАГА С ТИМОЦИТАМИ in vitro…………………………………………………………..19

АКТИВАЦИЯ ФАГОЦИТАРНЫХ КЛЕТОК И КЛЕТОЧНОГО

ИММУНИТЕТА СИНТЕТИЧЕСКИМИ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ………………………………………………………………………………20

АКТИВАЦИЯ МАКРОФАГОВ ПОД ВЛИЯНИ­ЕМ СИНТЕТИЧЕСКОГО АНТИОКСИДАНТА……………………………………………… 22

_{ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ МАКРОФАГОВ}

_{ПЕРИТОНЕАЛЬНОГО ЭКССУДАТА МЫШЕЙ ДЕЙСТВИИ ПРЕПАРАТОВ ПЛАТИНЫ………………………………………………………23}

ИЗУЧЕНИЕ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ В

ОТ­НОШЕНИИ YERSINIA PESTIS С ДЕФЕКТНЫ­МИ И ПОЛНОЦЕННЫМИ FRA-ГЕНАМИ…………………………………………………25

ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАТОРОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО ОТВЕТА ПРИРОДНОГО

ПРОИСХОЖДЕНИЯ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МАКРОФАГОВ……………………………………………………………….26

ПЕРИТОНЕАЛЬНЫЕ МАКРОФАГИ КАК МОДЕЛЬ

ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АТЕРОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА СЫВОРОТКИ КРОВИ……………………………………………………………………...29

ВЛИЯНИЕ ГАМК, ГОМК И ГЛУТАМИНОВОИ

КИСЛОТЫ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТОВ……………………………………………………………………………32

Заключение………………………………………………………………………. ……………………………………………………………33

Некоторые другие модели изучения фагоцитоза……………………………………………………………… 34

Литература…………………………………………………………………………………………………………………………………………36

Краткий экскурс в историю

Более 100 лет прошло с момента открытия фагоцитар­ной теории, созданной нашим великим натурали­стом, лауреатом Нобелевской премии И. И. Меч­никовым. Открытие, осмысление явления фагоци­тоза и формулирование в общих чертах основ фагоцитарной теории было сделано им в декабре 1882 г. В 1883 г. он изложил основы новой фаго­цитарной теории в докладе «О целебных силах организма» в Одессе на VII съезде естествоиспы­тателей и врачей и опубликовал их в печати. Были впервые высказаны основные по­ложения фагоцитарной теории, которые И. И. Мечников развивал в последующем на протяжении всей своей жизни. Хотя сам факт поглощения живыми клетками других частиц был описан многими натуралистами задолго до ученого, однако только он дал блестящее толкование огромной роли фагоцитов в защите организма от болезнетворных микробов.

Много позже к 70-летнему юбилею ученого коллега и друг И. И. Мечникова Эмиль Ру напи­шет: «Сегодня, мой друг, Вы наблюдаете доктри­ну фагоцитоза со спокойным удовлетворением отца, дитя которого сделало хорошую карьеру в мире, но сколько беспокойств оно Вам доста­вило! Его появление вызвало протесты и сопро­тивление и в течение двадцати лет Вам пришлось сражаться за него». Доктрина фагоцитоза «...одна из наиболее плодотворных в биологии: она связала явление иммунитета с внутриклеточ­ным пищеварением, она объяснила нам механизм воспаления и атрофии; она оживила патологи­ческую анатомию, которая, не будучи в состоя­нии дать приемлемое объяснение, оставалась чисто описательной... Ваша эрудиция такая об­ширная и верная, что она служит всему миру».

И. И. Мечников утверждал, что «...иммунитет в инфекционных болезнях должен быть приписан активной целлюлярной деятельности. Среди кле­точных элементов фагоциты должны занять пер­вое место. Чувствительность и подвижность, способность поглощать твердые тела и выраба­тывать вещества, могущие разрушать и перева­ривать микробов — вот главные факторы деятельности фагоцитов. Если эти свойства в достаточ­ной мере развиты и парализуют патогенное действие микробов, тогда животное от природы иммунно... когда фагоциты не обнаруживают наличия всех или одного из этих свойств в доста­точной степени, то животное восприимчиво к ин­фекции...». Вместе с тем, если бактериальные продукты вызывают у фагоцитов отрицательный хемотаксис или, если при положительном хемо­таксисе фагоциты не поглощают бактерий или поглощают, но не убивают их, — также развива­ется смертельная инфекция. Решение фундамен­тальных проблем сравнительной эмбриологии и биологии, приведшее к крупнейшим открытиям ученого, позволило И. И. Мечникову установить, что «фагоцитоз чрезвычайно распространен в жи­вотном мире... как на самой низшей ступени животной лестницы, например, у простейших, так и ...у млекопитающих животных и человека... фа­гоциты представляют собой мезенхимальные клетки».

И. И. Меч­ников был в то же время первым, кто занялся сравнительным изучением явления фагоцитоза. Внимание ученого было обращено не только на традиционные лабораторные объекты, но и на таких представителей мира животных, как даф­нии, морские звезды, крокодилы, обезьяны. Сравнительное изучение фагоцитоза было необ­ходимо И. И. Мечникову для доказательства всеобщности явлений поглощения и разрушения чужеродного материала фагоцитирующими мононуклеарами, широкого распространения в при­роде изучаемой им формы иммунологической за­щиты.

Клеточная теория Мечникова сразу наткнулась на сопротивление. Прежде всего она была предложена в то время, когда большинство патологов видели в воспалительной реакции, а также в связанных с ней микрофагах и макрофагах не защитную, а вредоносную реакцию. В то время считали даже, что, хотя фагоцитирующие клетки действительно способны поглощать болезнетворные микроорганизмы, это приводит не к разрушению возбудителя, а к переносу его в другие части тела и распространению болезни. Также в тот период времени интенсивно развивалась гуморальная теория иммунитета, основы которой были заложены П.Эрлихом. Были открыты антитела и антигены, были выявлены механизмы гуморальной устойчивости организма против некоторых патогенных микроорганизмов и их токсинов (дифтерия, столбняк и др.). Как это ни странно, но два таких открытия не могли некоторое время ужиться вместе. Позднее в 1888 г. Наттолл нашел в сыворотке нормальных животных вещества, токсичные для некоторых микроорганизмов, и показал, что такие антибактериальные свойства значительно повышаются в результате иммунизации животного. В дальнейшем было обнаружено, что в сыворотке имеются два разных вещества, совместное действие которых приводит к лизису бактерий: термостабильный фактор, затем идентифицированный как сывороточные антитела, и термолабильный фактор, названный комплементом, или алексином (от греч. aleksein - защищать). Ученик самого Мечникова Борде описал лизис эритроцитов гуморальными антителами и комплементом, и большинство исследователей стали соглашаться с Кохом, что победу одержали гуморалисты. Мечников и его ученики отнюдь не собирались сдаваться. Были поставлены простые опыты, в которых микробы, помещенные в маленький мешочек из фильтровальной бумаги, защищающий их от фагоцитов, сохраняли свою вирулентность, хотя буквально купались в тканевой жидкости, богатой антителами. В Англии сэр Элмрот Райт и С. Р. Дуглас попытались примирить различия между этими двумя школами в своих капитальных исследованиях процесса опсонизации (от греч. opsonein - делать съедобным). Эти ученые утверждали, что клеточный и гуморальный факторы являются одинаково важными и взаимозависимыми в том отношении, что гуморальные антитела, специфически реагируя со своей мишенью - микроорганизмом, подготавливают его к фагоцитозу макрофагами.

В 1908 г. Шведская академия удостоила Нобелевской премии по медицине совместно Мечникова - основателя клеточного направления и Эрлиха - олицетворявшего гуморалистские идеи того времени. Они были удостоены премии в качестве «признания их работ по иммунитету».

Заслуга Мечникова состоит не только в создании им гениальной теории. Еще ранее он начал изучать заразные болезни человека и домашних животных: вместе со своим учеником Н. Ф. Гамалеей он изучал туберкулез, чуму рогатого скота, искал способы борьбы с вредителями сельского хозяйства. К 1886 г. относится одно из важнейших событий в истории русской медицины. Летом этого года в Одессе начала работать созданная Мечниковым и его талантливым учеником Н. Ф. Гамалеей первая русская бактериологическая станция. Он создал в России крупнейшую научную школу микробиологов. Выдающиеся ученые Н. Ф. Гамалея, Д. К. Заболотный, Л. А. Тарасевич и многие другие были учениками И. И. Мечникова. Илья Ильич Мечников умер в 1916 году, до конца жизни занимаясь вопросами иммунологии и клеточного иммунитета. А наука об иммунитете быстро и стремительно развивалась. В этот период было необычайно много работ и ученых, изучавших факторы внутренней защиты организма.

Период с 1910 по 1940гг. был периодом  серологии.  В это время было сформулировано положение о специфичности и о том, что АТ являются естественными, высоковариабельными глобулинами. Большую роль здесь сыграли работы Ландштейнера, который пришел в выводу, что  специфичность антител не является абсолютной.

С 1905 появились работы (Сarrel, Guthrie) по трансплантации органов. В 1930г. К.Ландштейнер открывает группы крови. Работами по фагоцитозу, бактериофагии, вирусам, патогенезу чумы занимается Амадей Боррель. Премия присуждена Ф. Макфарлейну Бернету (1899 - 1985) и Питеру Медавару (1915 - Англия) «за открытие приобретенной иммунолотической толерантности». Медавар показал, что отторжение чужеродного кожного трансплантата подчиняется всем правилам иммунологической специфичности, и в основе его лежат такие же механизмы, как и при защите от бактериальных и вирусных инфекций. Последующая работа, которую он провел вместе с рядом учеников, заложила прочную основу для развития трансплантационной иммунобиологии, которая стала важной научной дисциплиной и в дальнейшем обеспечила многие достижения в области клинической трансплантации органов. Бернет опубликовал книгу «Образование антител» (1941 г.). Со своим коллегой, Франком Феннером, Бернет утверждал, что способность к иммунологическим реакциям возникает на сравнительно поздних стадиям эмбрионального развития и при этом происходит запоминание существующих маркеров «своего» у антигенов, присутствующих в данный момент. Организм в последующем приобретает к ним толерантность и не способен отвечать на них иммунологической реакцией. Все антигены, которые не запомнились, будут восприниматься как «не свои» и смогут в дальнейшем вызывать иммунологический ответ. Было высказано предположение, что любой антиген, введенный в течение этого критического периода развития, будет затем восприниматься как свой и вызывать толерантность, в результате чего не сможет в дальнейшем активировать иммунную систему. Эти идеи были далее развиты Бернетом в его клонально-селекционной теории образования антител. Предположения Бернета и Феннера были подвергнуты экспериментальной проверке в исследованиях Медавара, который в 1953 г. на мышах чистых линий получили четкое подтверждение гипотезы Бернета - Феннера, описав феномен, которому Медавар дал название приобретенной иммунологической толерантности.

В 1969г. одновременно несколькими авторами (Р.Петров, М.Беренбаум, И.Ройт) была предложена   трехклеточная схема кооперации  иммуноцитов в иммунном ответе (Т-, В-лимфоцитов и макрофагов), определившая на многие годы изучение механизмов иммунного ответа,  субпопуляционной организации клеток системы иммунитета.

Существенную роль в этих исследованиях сыграли кинематографические методы. Возможность непрерывного динамического изучения микробиологических объектов in vivo и in vitro в условиях, совместимых с их жизнедеятельностью, визуализация невидимых для человеческого глаза электромагнитных излучений, регистрация как быстрых, так и медленных процессов, управление масштабом времени и некоторые другие характерные особенности исследовательской кинематографии открыли большие и во многих отношениях уникальные возможности для изучения взаимодействия клеток.

Представление о фагоцитах за истекшее время подверглось существенной эволюции. В 1970 г. Van Furth и соавт. предложили новую классификацию, выделяющую МФ из РЭС в от­дельную систему мононуклеарных фагоцитов. Исследователи отдали дань уважения И. И. Меч­никову, пользовавшемуся термином «мононуклеарный фагоцит» еще в начале XX века. Фагоцитарная теория не стала, однако, неиз­меняемой догмой. Непрерывно накопляемые нау­кой факты изменили и усложнили понимание тех явлений, в которых фагоцитоз казался решаю­щим или единственным фактором.

Можно утверждать, что в наши дни созданное И. И. Мечниковым учение о фагоцитах пережива­ет свое второе рождение, новые факты значитель­но обогатили его, показав, как это и предсказы­вал Илья Ильич, огромное общебиологическое значение. Теория И. И. Мечникова явилась мощ­ным индуктором прогресса иммунологии во всем мире, большой вклад в него внесли советские ученые. Однако и сегодня основные положения теории остаются незыблемыми.

Первостепенное значение фагоцитарной систе­мы подтверждается созданием в США общества ученых, занимающихся изучением ретикулоэндотелиальной системы (РЭС), издается специальный «Journal of Reticulo-Endothelial Society».

В последующие годы развитие фагоцитарной теории связано с открытием цитокиновой регуляции иммунного ответа и, конечно, изучения влияния цитокинов на клеточный ответ в том числе и макрофагов. На заре этих открытий стоя ли работы таких ученых, как Н.Ерне,

Г. Келер, Ц. Милштейн.

В СССР бурный интерес к фагоцитам и связанным с ними процессами наблюдался в 80-е годы. Здесь необходимо отметить работы А.Н.Маянского, изучавшего влияния макрофагов не только в свете их иммунной функции. Он показал значение клеток РЭС на функционирование таких органов как печень, легкие, желудочно-кишечный тракт. Работы также проводили А.Д. Адо, В.М.Земсков, В.Г.Галактионов, эксперименты по изучению работы МФ в очаге хронического воспаления ставил Серов.

Следует сказать, что в 90-е годы интерес к неспецифическому звену иммунитета упал. Отчасти это можно объяснить тем, что все усилия ученых были в основном устремлены к лимфоцитам, но особенно – к цитокинам. Можно сказать, что сейчас продолжается «цитокиновый бум».

Однако это ни в коем случае не означает, что актуальность проблемы упала. Фагоцитоз составляет пример того процесса, интерес к которому не может пропасть. Будет открытие новых факторов стимулирующих его активность, будут обнаружены вещества угнетающие РЭС. Будут открытия, уточняющие тонкие механизмы взаимодействия МФ с лимфоцитами, с клетками интерстиция, с антигенными структурами. Особенно это может быть актуально сейчас в связи с проблемой опухолевого роста и СПИД’а. Остается надеяться, что в ряду открытий, начатых великим Мечниковым, будут стоять имена русских ученых.

СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ УЧЕНИЯ О ФАГОЦИТОЗЕ

Основные положения о фагоцитах и систе­ме фагоцитоза, блестяще сформулированные И. И. Мечниковым и разработанные его учениками и последователями, надолго определи­ли развитие этого важнейшего направления био­логии и медицины. Идея о противоинфекционном иммунитете, которая так увлекла современников И. И. Мечникова, сыграла решающую роль в ста­новлении клеточной иммунологии, эволюции взглядов на воспаление, физиологию и патологию реактивности и резистентности организма. Па­радоксально и вместе с тем закономерно, что уче­ние о фагоцитозе началось с крупных обобщений и концепций, которые на протяжении многих лет дополнялись фактами частного характера, мало повлиявшими на развитие проблемы в целом. Волна современной иммунологической информа­ции, изобилие изящных методов и гипотез напра­вили интересы многих исследователей в сторону изучения лимфоцитарных механизмов клеточного и гуморального иммунитета. И если иммунологи быстро поняли, что без макрофага им не обой­тись, то судьба другого класса фагоцитирующих клеток — полинуклеарных (сегментоядерных) лейкоцитов — до недавнего времени оставалась неясной. Только теперь можно с уверенностью сказать, что и эта проблема, сделав за последние 5—10 лет качественный скачок, прочно утверди­лась и успешно развивается не только иммуноло­гами, но и представителями смежных профес­сий — физиологами, патологами, биохимиками, клиницистами. Изучение полинуклеарных фаго­цитов (нейтрофилов) — один из немногих при­меров в цитофизиологии, а тем более в иммуно­логии, когда число исследований на объекте «че­ловеческого происхождения» превосходит количе­ство работ, выполненных в эксперименте на жи­вотных.

Сегодня учение о фагоцитозе — это совокуп­ность представлений о свободных и фиксирован­ных клетках костномозгового происхождения, которые, обладая мощным цитотоксическим по­тенциалом, исключительной реактивностью и вы­сокой мобилизационной готовностью, выступают в первой линии эффекторных механизмов иммунологического гомеостаза. Противомикробная функция воспринимается как частный, хотя и важный, эпизод этой общей стратегии. Доказаны мощные цитотоксические потенции моно- и полинуклеарных фагоцитов, ко­торые, кроме бактерицидности, находят выраже­ние в уничтожении малигнизированных и иных форм патологически измененных клеток, альтерации тканей при неспецифическом воспалении в иммунопатологических процессах. Если нейтрофилы (доминирующий тип полинуклеаров) почти всегда нацелены на деструкцию, то функции мононуклеарных фагоцитов сложнее и глубже. Они участвуют не только в разрушении, но и в созидании, запуская фибробластические процессы и репаративные реакции, синтезируя комплекс био­логически активных субстанций (факторы комп­лемента, индукторы миелопоэза, иммунорегуляторные белки, фибронектини пр.). Сбы­вается стратегический прогноз И. И. Мечникова, который всегда смотрел на фагоцитарные реак­ции с общефизиологических позиций, утверждая значение фагоцитов не только в защите от «вред­ных деятелей», но и в общей борьбе за гомеостаз, которая сводится к поддержанию относительного постоянства внутренней среды организма. «При иммунитете, атрофии, воспалении и излечении, во всех явлениях, имеющих величайшее значение в патологии, участвуют фагоциты».

Мононуклеарные фагоциты, которые ранее относили к ретикулоэндотелиальной системе, выделе­ны в самостоятельное семейство клеток — систе­му мононуклеарных фагоцитов, которая объеди­няет моноциты костного мозга и крови, свобод­ные, и фиксированные тканевые макрофаги. Доказано, что, выходя из крови, моноцит ме­няется, адаптируясь к условиям той среды, в ко­торую попадает. Это обеспечивает специализа­цию клетки, т. е. максимальное соответствие тем условиям, в которых ей предстоит «работать». Не исключена и другая альтернатива. Подобие мо­ноцитов может быть чисто внешним (как это слу­чилось с лимфоцитами), и часть из них предетерминирована к трансформации в различнее вари­анты макрофагов. Гетерогенность зрелых нейтрофилов хотя и существует, но выражена гораздо слабее. Они почти не меняются морфологически, попадая в ткани, в отличие от макрофагов жи­вут там недолго (не более 2—5 сут) и явно не обладают пластичностью, присущей моноцитам. Это высокодифференцированные клетки, кото­рые практически заканчивают свое развитие в костном мозге. Не случайно, известные в прошлом попытки отыскать корреляцию между сегментацией ядра и способностью лейкоцитов к фагоцитозу не увенчались успехом. Тем не менее идея о функциональной неоднородности морфологически зрелых нейтрофилов продолжа­ет получать подтверждения. Известны различия между нейтрофилами костного мозга и перифе­рической крови, нейтрофилами крови, тка­ней и экссудатов. Причины и физиоло­гический смысл этих особенностей неизвестны. По-видимому, изменчивость полинуклеаров в от­личие от моноцитов-макрофагов носит тактиче­ский характер.

Изучение фагоцитоза ведется согласно классическим постулатам И. И. Мечникова о фазах фагоцитарной реакции — хемотаксису, аттракции (связывании) и поглощении_, уничтожении (переваривании). К характеристике каждого из этих процессов в настоящее время приковано внимание, им посвящают монографии, обзоры. Результаты многочисленных исследований позво­лили углубиться в суть этих реакций, конкретизи­ровать молекулярные факторы, лежащие в их ос­нове, нащупать общие узлы и вскрыть частные механизмы клеточной реактивности. Фагоцитоз служит прекрасной моделью для изучения мигра­ционной функции, пространственной ориентации клеток и их органелл, слияния и новообразова­ния мембран, регуляции клеточного гомеостаза и других процессов. Иногда фагоцитоз нередко отождествляют с поглощени­ем. Это явно неудачно, ибо нарушает исторически сложившееся представление о фагоцитозе как об интегральном процессе, который объединяет сумму клеточных реакций, начиная с распознавания объекта и кончая его разрушением или стремлением к разрушению. С функциональной точки зрения фагоциты могут пребывать в двух состояниях — покоящемся и активирован­ном. В наиболее общем виде активация — есть результат преобразования внешнего стимула в реакцию эффекторных органелл. Больше пишут об активированном макрофаге, хотя в прин­ципе то же самое можно сделать и для полинук­леаров. Надо выбрать лишь точку отсчета — к примеру, функциональный статус в сосудистом русле нормального организма. Активация разли­чается не только степенью возбуждения индиви­дуальных клеток, но и масштабом охвата клеточ­ной популяции в целом. В норме активировано небольшое количество фагоцитов. Появление раз­дражителя резко меняет этот показатель, отра­жая подключение фагоцитов к реакциям, корри­гирующим внутреннюю среду организма. Стремление проактивировать фагоцитарную систему, усилив тем самым ее эффекторные возможности, неоднократно звучало в работах И. И. Мечнико­ва. Современные исследования по адъювантам, биологическим и фармакологическим модулято­рам мононуклеарных и полинуклеарных фагоци­тов по существу развивают эту мысль с позиций межклеточной кооперации, общей и частной па­тологии. В этом видится перспектива рациональ­ного воздействия на воспаление, репаративные и регенеративные процессы, иммунопатологию, резистентность к острому и хроническому стрессу, устойчивость к инфекциям, опухолям и пр.

Многие признаки активации стереотипны, повторяясь у всех фагоцитирующих клеток. К ним относятся изменение активности лизосомальных и мембранных ферментов, усиление энергетиче­ского и окислительного метаболизма, синтетических и секреторных процессов, изменение адгезивных свойств и рецепторной функции плазматической мембраны, способности к случайной ми­грации и хемотаксису, поглощению и цитотоксичности. Если учесть, что каждая из этих реакций по своей природе интегративна, то количество ча­стных признаков, по которым можно судить о возбуждении клеток, будет огромным.

Один и тот же раздражитель способен индуцировать все или большинство признаков актива­ции. Однако это, скорее, исключение, чем прави­ло. Сегодня многое известно о конкретных меха­низмах, реализующих эффекторные свойства моно и полинуклеарных фагоцитов. Расшифрована структурная основа двигательных реакций, открыты органеллы, обес­печивающие векторную ориентацию в простран­стве, изучены закономерности и кинетика образо­вания фаголизосом, установлена природа цитотоксичности и бактерицидности, определены син­тетические и секреторные потенции, обнаружены рецепторные и каталитические процессы в плаз­матической мембране и пр. Становится все более очевидным, что дискретные проявления клеточ­ной реактивности обеспечиваются или по крайней мере инициируются обособленными механиз­мами и могут возникать независимо друг от дру­га. Удается подавить или усилить хемотаксис, не изменив способности к поглощению и цитоток­сичности, секреция не связана с поглощением, повышение адгезивности не зависит от потребле­ния кислорода и т. д. Известны генетические дефекты, когда выпадает одна или несколько из перечисленных функций, причем многие из них стереотипны по клинической симптоматике. Если к этому присовокупить патологию медиаторных систем, генерирующих хемоаттрактанты и опсонины, станет понятно, насколько сложным и одно­временно конкретным должен быть сегодня диа­гноз, констатирующий нарушение фагоцитоза.

Крупным событием явилось утверждение моле­кулярных основ цитотоксичности (в том числе бактерицидности) и ее отношения к реактивно­сти клеток. Стремление понять сущность реакций, приводящих к гибели поглощенных бактерий, проглядывает в большинстве работ И. И. Мечни­кова. Многие годы эта проблема традиционно сводилась к «перевариванию», в котором участву­ют гидролитические ферменты (цитазы, по И. И. Мечникову), определяющие, как полагали, антимикробные свойства фагоцитов. Эта позиция была сильно поколеблена, после того как оказа­лось, что лизосомальные гидролазы обладают слабой бактерицидностью in vitro или лишены ее. В основу современных взглядов положены наблюдения, свидетельствующие об усилении окислительного метаболизма активированных фагоцитов и разобщении двух главных собы­тий — киллинг-эффекта и дегра­дации убитых, нежизнеспособных объектов. Прежняя терминология, в которой закреплена причинная связь между уничтожением живой ми­шени и переваривающей функцией клетки, оставлена. Переваривание, которое обу­словлено кислыми и нейтральными гидролазами, преформированными в гранулах, является вторич­ным и нацелено на объекты, убитые зависимыми и независимыми от кислорода механизмами — биооксидантами, системой миелопероксидазы, катионными белками, лактоферрином, лизоцимом. Реализация цитотоксичности отражает реактивное возбуждение фагоцитирующих кле­ток, которые секретируют эффекторные молеку­лы внутрь фагосом (с образованием фаголизосом) либо наружу, атакуя внеклеточные (непо­глощенные) объекты. То, что количество кислорода, поглощаемого лейкоцитами, значительно увеличивается при фа­гоцитозе, известно давно. Однако истинное значение этого феномена, который в современ­ной литературе часто называют респираторным, или метаболическим, взрывом, осмыслено лишь в последние годы. В отличие от многих клеток кис­лородное дыхание не является системой жизне­обеспечения фагоцитов — они хорошо переносят гипоксию и выполняют ряд функций в условиях анаэробиоза. При помощи респираторного взрыва моноциты-макрофаги и нейтрофилы решают чи­сто эффекторные задачи, «вооружаясь» против микробов и других объектов, которые восприни­маются ими как антигомеостатические факторы. В анаэробной среде фагоциты сохраняют способ­ность к поглощению, но резко снижают токсич­ность в отношении многих патогенных и условно-патогенных бактерий. Ключевой механизм сводится к активации мембранных оксидаз, ката­лизирующих перенос электронов с НАДФН на молекулярный кислород. Это стимулиру­ет окисление глюкозы в гексозомонофосфатном шунте, приводя к гиперпродукции перекиси водо­рода и свободных радикалов кислорода - биологических оксидантов с мощными цитотоксическими потенциями. Клини­ческое значение подобных реакций стало очевид­ным после того, как было обнаружено фатальное снижение противоинфекционного иммунитета у детей с врожденной патологией системы респи­раторного взрыва нейтрофилов. Впрочем, было бы неверно противопоставлять различные антимикробные факторы. Их эффективность во многом зависит от взаимной сбалансированности условий, в которых происходит фагоцитоз, вида микроба. Нейтрофилы, лишенные возможности использовать бактерицидные свойства активированного кислорода, тем не менее нормально уби­вают эпидермальный стафилококк, синегнойную палочку, зеленящий стрептококк, облигатные анаэробы. Относительная устойчивость к фагоцитозу определяется суммой признаков — поверхностными свойствами микробной клетки, наличием факторов типа лейкотоксинов и антифагинов, инактивацией биооксидантов и пр. Давно обнаружена способность некоторых бакте­рий тормозить образование фаголизосом. Этот механизм, который исключает контакт с цитотоксическими компонентами фа­гоцитов, обеспечивает длительное персистирование в макрофагах туберкулезной палочки, a в нейтрофилах — бруцелл, а также других микроорганизмов. Одну из при­чин видят в повышении внутриклеточного уров­ня циклического аденозинмонофосфата, блокиру­ющего мобилизацию гранул и их слияние с фагосомами. Этот пример показывает, насколько глубокими могут быть взаимоотношения, которые складываются в процессе фагоцитоза.

Становление взглядов на механизмы цитотоксичности фагоцитов не подорвало мечниковской концепции о цитазах как о медиаторах, опосредующих деструктивные функции клеток. И. И. Мечников не раз подчеркивал, что, кроме разрушения микробов, фагоциты способны по­вреждать собственные ткани. Эти идеи получили блестящее развитие в современных работах по ферментологии лизосомальных гранул и спосо­бам их подключения к фагоцитарным реакциям. В гранулах моно- и полинуклеарных фагоцитов идентифицирован большой арсенал гидролитиче­ских ферментов (нейтральных и кислых гидролаз), для каждого из которых можно подыскать мишень во внеклеточном пространстве. Под их прицелом находятся коллагеновые и эластиновые волокна, пептидогликановый матрикс хря­ща, фибронектин, факторы комплемента, систе­мы калликреин-кининов, свертывания, фибрино-лиза, иммуноглобулины, клеточные мембраны. В противовес старым представлениям се­годня сделан акцент на активном, секреторном высвобождении эффекторных молекул, которое значительно повышает эффекторную пла­стичность клетки, позволяя в кратчайший срок мобилизовать и рационально использовать свои возможности в физиологических ситуациях и в ходе разнообразных патологических процессов. Секретируя, фагоциты воздействуют на другие медиаторные системы и разрушают внеклеточ­ные объекты, размер которых исключает возмож­ность поглощения. Так, по-видимому, обстоит де­ло при эмфиземе легких, в реакциях на иммунные комплексы, при остром и хрони­ческом воспалении. Кроме гидролаз и других компонентов лизосомальных гранул, активированные фагоци­ты выделяют пирогены, интерфероны и интерфероноподобные вещества, простагландины, тромбоксаны, биооксиданты, монокины, факторы, стимулирующие предшественники миелопоэза и пр. Лейкотриены вызывают сокращение гладких мышц и повыше­ние сосудистой проницаемости, действуя в 100— 10000 раз сильнее, чем гистамин.

Прав был И. И. Мечни­ков, когда говорил о широком спектре задач, ре­шаемых фагоцитами, и многообразии их функ­циональных контактов («живой цепи», по И. И. Мечникову) с другими клетками и тканя­ми. Активированные макрофаги и нейтрофилы служат одним из самых ярких примеров экстрен­ной мобилизации эффекторных механизмов с об­ширной сферой приложения в масштабе не толь­ко соединительной ткани, но и всего организма.

Активаторы моноцитов-макрофагов и полинуклеаров образуются в системах комплемента, свертывания, фибринолиза, калликреин-кининов, иммуноглобулинов, выделяются лимфоцитами, фибробластами, тромбоцитами, эндотелием. Сложные взаимоотношения складываются и внут­ри самой фагоцитарной системы. Моноцитарный инфильтрат при воспалении формируется под влиянием хемоаттрактантов, про­дуцируемых нейтрофилами, которые первыми мигрируют в зону альтерации. В свою оче­редь моноциты и макрофаги выделяют факторы, избирательно активирующие нейтрофилы. Существенное значение имеет функциональ­ная кооперация между однотипными фагоцита­ми, которая предполагает участие «аутокаталитических» механизмов, контролирующих мигра­ционную, секреторную и другие функции активи­рованных клеток. Липоксигеназные ме­таболиты арахидоновой кислоты — различные варианты гидроксиэйкозантетраеновые кислоты хемотаксичны в ничтожных дозах (особенно для нейтрофилов) и, являясь потенциальными «осколками» клеточного метаболизма унифицируют сигналы, которые обеспечи­вают направленную миграцию фагоцитов в очаги тканевого повреждения. Любая травма любой ткани может стать инициатором подобных реакций. В этом прослеживается один из универсальных механизмов гомеостаза — внутри популяции фагоцитов, в масштабе соеди­нительной ткани, за ее пределами.

Из сказанного следует важный вывод. Трудно подыскать такое изменение внутренней среды ор­ганизма, которое бы не фиксировалось системой фагоцитоза. Являясь мощными эффекторами, фагоциты превращаются в узел связи, своего рода стратегическую мишень, через которую трансфор­мируются все реакции крови и соединительной ткани. Особенно показательны нейтрофилы. Об­мениваясь в циркуляции каждые 5 ч, они как бы фотографируют сдвиги, которые происходят в те­чение этого периода, являясь своеобразным зер­калом гомеостаза. Не случайно, что индикатор­ные тесты, основанные на высокой реактивности полинуклеаров, давно используются в клинике и по информативности нередко превосходят другие гематологические показатели.

Много внимания уделяется молекулярным ме­ханизмам активации фагоцитов. В соответствии с общими принципами современной цитофизиологии схема фагоцитарной реакции предусматрива­ет распознавание и рецепцию (связывание) внешнего сигнала, реактивные изменения в плазмати­ческой мембране, активацию внутриклеточных сигналов-посредников, функциональную транс­формацию эффекторных органелл. Открытие стимуляторов с из­вестной структурой привело к заключение, что их воздействие на фагоциты опосредуется через дискретные участки плазматической мембраны — специфические рецепторы, которые по молеку­лярной конфигурации комплементарны стимули­рующему агенту. Это определяет важнейшее свойство плазматической мембраны — дифферен­цировать молекулярный профиль внешних раз­дражителей и трансформировать его в опреде­ленную форму клеточного ответа. Макрофаги и нейтрофилы рецептируют Fc-фрагмент IgG- и IgA-иммуноглобулинов, производные комплемен­та (СЗЬ, C3d, СЗе, С5а, С567), различные хемоаттрактанты, пектины, бактериальные гликопротеиды, фибронектин, адрен- и холинергические агенты, гистамин, кортикостероиды, эстрогены и пр. Вместе они опре­деляют фармакологический профиль,

т. е реак­тивность клетки к соответствующему набору функциональных модуляторов. Выясняется, что рецепторный аппарат — весьма динамичная си­стема. Имея определенный стартовый уровень, она меняется в зависимости от конкретной об­становки и состояния клеток. Ин­тенсивность специфической рецепции является одной из самых интересных форм реактивности, управление которой позволит воздействовать на наиболее ранние этапы фагоцитарного процесса. Принципиально, что экспрессия разных рецепто­ров меняется несинхронно, дифференцируется фармакологическими агентами и приводит к не­одинаковым функциональным последствиям. Пассивная по чисто внешним признакам (к примеру, хемоаттрактанты связываются разрушен­ными клетками) рецепция сопровождается мо­лекулярными сдвигами в плазматической мем­бране, многие из которых играют ключевую роль в активации клетки. Один из постулатов совре­менной цитофизиологии, утверждающий функ­циональное или даже структурное единство ре­цепторов и ферментов плазматической мембраны (эктоферментов), нашел отражение и в исследо­ваниях по фагоцитозу. В составе плазматической мембраны фагоцитов обнаружены серинэстеразы, протеиназы, аденилатциклазы, оксидазы, АТФ-азы. Полагают, что они активируются при сти­муляции, воспринимая изменения молекулярной топографии клеточной поверхности. Ферментоло­гия плазматической мембраны отражает стрем­ление понять механизмы, инициирующие пере­ключение энергии раздражения в энергию клеточного возбуждения Поиски универсального фермента-инициатора не оправдались, что, ско­рее, говорит о специфике различных форм кле­точной реактивности, нежели отрицает саму идею эктоферментного опосредования. Не увенча­лись успехом и поиски универсального медиаторного звена между реакциями плазматической мембраны и эффекторными органеллами. На эту роль претендовали циклические нуклеотиды, Са²+, производные активированного кислорода. Каждый из них контролирует более или менее сложный набор клеточных функций, но в целом их эффект неуниверсален. Напротив, есть факты, которые убеждают, что внутрикле­точное опосредование может быть полидетерминантным, т. е. зависит от совместного действия нескольких медиаторов. Именно такое сочетание определяет конечную форму ответа и свойствен­но большинству фагоцитарных реакций. По пос­ледним данным, механизмы, обеспечивающие выход на одни и те же органеллы, могут быть неодинаковы для разных стимуляторов. Глубокое развитие получили идеи И. И. Меч­никова и его современников об опсонинах, сыг­равшие некогда решающую роль в объединении клеточных и гуморальных концепций иммуните­та. Понятие об опсонинах сформулировано в 1903 г., а усиление фагоцитоза в сывороточной среде замечено еще раньше. Однако лишь послед­ние десятилетия ознаменовалось радикальными успехами в изучении молекулярных основ опсонической функции и ее реализации на уровне клеток-эффекторов. К семейству опсонинов обычно относят четыре группы хорошо охарактеризованных сывороточ­ных белков — IgG, СЗ (СЗЬ), фибронектин, С-реактивный белок, однако в действительности их, очевидно, больше. Наиболее уни­версальными свойствами обладают СЗЬ- и IgG-антитела. Кооперируясь друг с другом, они создают мощный опсонический заслон, который традиционно считается одним из главных факто­ров противоинфекционного иммунитета. Функции других опсонинов, по-видимому, более ограничен­ны, их активность сильнее зависит от свойств фагоцитируемого объекта и типа фагоцитов. Именно неоднородность субстратов, с которыми приходится сталкиваться фагоцитирующим клет­кам, следует считать первопричиной эволюционно закрепленной гетерогенности опсонических факторов.

Проблема опсонинов гораздо шире, чем противомикробная защита. В наиболее общем виде она сводится к фокусированию клеточных реак­ций на любых объектах экзогенного и эндогенно­го происхождения, которые, попадая во внутрен­нюю среду, вступают в противоречие с гомеостазом. Кроме уничтожения микробов, опсонизация способствует удалению продуктов тканевого рас­пада, разрушению малигнизированных и ин­фицированных вирусами клеток, гибели одноклеточных и многоклеточных парази­тов, элиминации антигенов, прочно связан­ных с базальными мембранами и другими тка­невыми субстратами. Опсонические реакции, как и фагоцитоз в целом,— явление, безусловно, физиологическое. Но это тот случай, когда о зна­чении эффекторных механизмов удается судить по их поведению в патологических ситуациях. И. И. Мечников утверждал, что действие опсо­нинов не ограничивается улучшением физических контактов между объектом и фагоцитирующей клеткой. По его мнению, опсонины не только ме­няют поверхностные свойства фагоцитируемых частиц, но и стимулируют фагоциты. Есть основания считать опсонины своеобразными фармакологическими агентами, которые сти­мулируют клетки независимо от поглощения по сигналу с рецепторов плазматической мембраны, вошедших в контакт с опсонизированной поверх­ностью. В составе Fаb-фрагмента IgG об­наружен тетрапептид — тафтсин (в честь Тафтского университета в США), который в незначи­тельных дозах усиливает многие функции поли- и мононуклеарных фагоцитов. Спра­ведливость идеи о стимулинах становится еще очевиднее, если изучать не изолированные систе­мы фагоцит — опсонизированный объект, а ре­альные ситуации, возникающие в организме. Многочисленные наблюдения показывают, что на объекты фагоцитоза нельзя смотреть как на пас­сивные сорбенты опсонических факторов. Про­цесс опсонизации сопровождается реакциями в различных системах гуморального гомеостаза, что приводит к гиперпродукции биологически ак­тивных веществ, прямо или косвенно влияющих

на клеточную реактивность. Это отчетливо прослеживается на примере комплемента. Нара­ботка СЗ-опсонинов связана с его каскадной ак­тивацией и сочетается с образованием С5а — од­ного из самых мощных эндогенных стимуляторов фагоцитоза.

Важен вопрос об отношении фагоцитоза к приобретенному (специфическому)
иммунитету. Классический постулат И. И. Меч­никова о переваривании антигенного материала фагоцитами как необходимом этапе образования антител трансформировался в современную кон­цепцию о предъявлении антигенных детерминант Т-лимфоцитам в виде комплекса с продуктами иммунорегуляторных генов (Ia-белками), премированных на плазматической мембране макрофагов. Вкупе с медиаторами типа интерлейкинов это определяет центральную пози­цию мононуклеарных фагоцитов в механизмах формирования приобретенного иммунитета. Для нейтрофилов не удалось добиться большего, чем факта слабого усиления пролиферации В-лимфоцитов нейтральными протеиназами нейтрофилов человека и негативного влияния избытка нейтрофилов на аналогичный феномен. Ско­рее всего, это «пробирочные» реакции, не имею­щие серьезного приложения к регуляции лимфоцитарных функций in vivo. Иначе обстоит дело
на уровне эффекторного звена иммунных процес­сов. По существу, ни одно из проявлений приоб­ретенного иммунитета не воспроизводится в пол­ном объеме без участия моноцитов-макрофагов и (или) полинуклеаров. Об этом говорят реак­ции, наведенные антителами-опсонинами, гипер­чувствительность замедленного типа, поврежде­ния, вызываемые иммунными комплексами, и проч.

Зависит от МФ ответ лимфоцитов на неспе­цифические митогены — фитогемагглютинин, конканавалин А, перийодат, как и продукция ими лимфокинов — МИФ, МАФ, лимфотоксина и др. Предполагают, что активация Т-лимфоцитов осуществляется непосредственно свободным или связанным с МФ митогеном, а МФ выделяет фактор, трансформирующий Т-клет­ки. МФ, выделяя различные факторы, регулируют пролиферацию и дифференцировку незрелых костномозговых МФ, програнулоцитов, возможно, эритроидных клеток. Удалось выявить гене­тически обусловленные различия регулирующего влияния МФ на пролиферативную активность стволовых кроветворных клеток. Макрофаги также с помощью различных растворимых фак­торов усиливают пролиферацию фибробластов, эпидермальных клеток кожи, эндотелия сосудов, участвуют в созревании клеток тимуса.

Сегодня не может быть полностью принята гипотеза о центральной роли тимуса и Т-клеток в противоопухолевом надзоре, поскольку есть сведения об одинаковой частоте возникновения опухолей у бестимусных и нормальных живот­ных, одинаковом их отторжении у иммунодефи-цитных или супрессированных животных, ограни­ченном числе опухолей у людей с тяжелой иммуносупрессией. По мнению исследовате­лей, роль Т-лимфоцитов достаточно однозначна в отторжении вирусиндуцированных опухолей, но она невелика при спонтанных и индуцированных канцерогенами неоплазмах. Целый ряд доказа­тельств свидетельствует о сложной системе есте­ственной и приобретенной антиопухолевой защи­ты организма и ограниченной роли в ней Т-лим­фоцитов. Об этом говорит раннее развитие есте­ственной резистентности к опухолям на протяже­нии нескольких дней после рождения, подавле­ние ее при введении веществ, угнетающих МФ, непосредственно перед трансплантацией опухоли или одновременно с ней, совпадение индуциро­ванной стимуляции резистентности к опухолям с активированием МФ. Поэтому все большее значение в этой системе придают МФ. Оказалось, что неактивированные МФ не ока­зывают антиопухолевое действие, но положение меняется при активации клеток, которая может быть специфической и неспецифической. Специфическая активация возникает у клеток, взятых из иммунного организма или у интактных МФ, инкубированных с иммунными Т-лимфоцитами, с этими лимфоцитами и АГ или с продук­тами реакции. МФ в этом случае активируются специфическим армирующим фактором, специфи­чески узнают и убивают опухоль в результате цитолизиса. Неспецифическая активация обусловлена инфекционным процессом, эндотоксинами, липидом А, полинуклеотидами, иммунными комп­лексами иной специфичности. Активирован­ные таким путем МФ приобретают цитостатические свойства. МФ могут армироваться специфи­ческим к данным лимфоцитам фактором иной специфичности в отличие от фактора, индуциро­ванного опухолевыми АГ, в таком случае они становятся неспецифически цитотоксичными по отношению к опухоли. Поэтому, если к иммун­ным МФ добавить специфические опухолевые клетки, а затем через некоторое время неспеци­фические, МФ будут специфически лизировать гомологичную мишень и неспецифически подав­лять неродственную.

Таким образом, МФ в организме скорее всего проявляют одновременно специфическую и неспе­цифическую клеточную цитотоксичность, обнару­живая в первом случае цитолитические, а во втором — цитостатические потенции.

Активированные МФ подавляют пролифера­цию нормальных и опухолевых сингенных, алло-генных и ксеногенных клеток — быстро пролиферирующих сильнее, чем медленно пролиферирующих. Однако быстро пролиферирующие опу­холевые клетки полностью подавляются, тогда как нормальные клетки — лишь частично.

Механизм цитотоксичности МФ сложен. Специ­фический армирующий фактор с молекулярной массой 25000—50000 дальтон имеет аффинность к АГ опухоли, связывается с поверхностью МФ, секретируется коммитированными Т-лимфоцитами. Важен межклеточный контакт мишени и МФ, который постоянно возникает, причем зона кон­такта имеет 100—200А. Предполагают, что он может способствовать локальному слиянию и инъецированию в мишень лизосом МФ, лизирующих ее. По разным данным, киллинг может осуществляться сериновыми протеазами, возникающим под влиянием лизосомальных гидролаз СЗа-субкомпонентом комплемента, катионным белком или индукцией макрофагами в мишенях аберрантного деления, приводящего к их лизису. Вместе с тем считают, что роль простагландинов, аргиназы, перекиси водорода и интерферона не столь существенна в непосредственном цитолитическом эффекте.

Определенное значение придают изменению структуры мембран эффекторов и мишеней, так как обработка МФ фосфолипазой или лизолецитином индуцирует в них противоопухолевую ци­тотоксичность, что объяснили возможным обра­зованием на мембране цитолитической структу­ры в результате изменения ее конформации. Подобные процессы, по-видимому, происходят при активации МФ липополисахаридами (ЛПС), в результате которой ЛПС через липид А связы­вается с плазматической мембраной М.Ф, изменяя ее организацию в результате формирования комплекса липид А — мембранный липид, по этой же причине, возможно, тумороцидная способность МФ резко подавлялась после их экс­позиции с липопротеидами низкой плотности или холестериновыми липосомами.

В организме в силу посто­янного выделения бактериальных эндотоксинов, иммунологических реакций различной специфич­ности, сопровождающихся освобождением лимфокинов, образованием иммунных комплексов, по­стоянно поддерживается популяция неспецифи­чески активированных МФ, выполняющих надзор за спонтанно появляющимися трансформирован­ными клетками и элиминирующими их.

МФ имеют огромное значении системы мононуклеарных фагоци­тов в естественной устойчивости организма к опухолям. Поскольку подавление пролиферации макрофагами не зависит от вида и типа клеток, характеристики роста, трансформации и реактив­ности, это свидетельствует о наличии у МФ структур узнавания, не имеющих иммунологической специфичности. В мишенях появляются общие изменения, узнавае­мые вездесущими МФ, которые поэтому являют­ся широкими регуляторами общего клеточного гомеостаза.

За 120 лет, прошедшие со дня создания И. И. Мечниковым уче­ния о фагоцитах, оно ушло далеко вперед. Роль МФ оказалась неизмеримо более широкой и вы­шла за рамки иммунологии.

Эта теория оказала глубочайшее конструктивное влияние на все развитие современной иммунологии. Именно она послужила началом изучения клеточных аспектов иммунитета. Некоторые аспекты теории, предсказанные И. И. Мечниковым, до сих пор остаются недостаточно разработанными. Очевид­но, что научное наследие, оставляемое нам И. И. Мечниковым, и в будущем будет опреде­лять основные направления учения о фагоцитах.

Макрофаги перитонеального экссудата как модель фагоцитоза и нарушений фагоцитарной активности.

В организме человека фагоцитирующую функцию выполняют несколько типов клеток. Прежде всего, это те клетки, которые осуществляют защиту при каких-либо инфекциях и инвазиях – макрофаги, моноциты и нейтрофилы. В меньшей степени она представлена у эозинофилов и базофилов. Кроме того, общеизвестным является тот факт, что в различных тканях фагоцитирующую функцию берут на себя (помимо вездесущих макрофагов) специфические клеточные элементы данной ткани, например: фиброкласты, остеокласты, клетки микроглии. Также нельзя забывать о том, что к тем немаловажным клеткам, благодаря которым идет специфический иммунный ответ, относятся дендритные клетки, широко представленные в местах, являющихся барьерными в организме. И хотя их фагоцитирующая функция до конца не доказана, данные о том, что это так, есть.

Существуют различные методы изучения фагоцитирующей активности у клеток, перечисленных выше. В данном реферате будут рассмотрены методы изучения тех фагоцитов, у которых фагоцитирующая функция наиболее выражена и которые представляют исключительную важность в иммунной системе человека, а их патология носит тяжелый характер. Речь идет о макрофагах (МФ). Они хорошо поддаются изучению in vivo и in vitro, культивированию; моделирование различных процессов на этих клетках получило широкое распространение и дало хорошие результаты. Это обусловлено их крупными размерами, широчайшей распространенностью в организме, активностью метаболических процессов, протекающих в них, разнообразием функций, на них возложенных.

В качестве модели, хорошо себя зарекомендовавшей и наиболее часто используемой в опытах по изучению фагоцитов, можно рассмотреть модель перитонеальных макрофагов in vitro. Широкое распространение данная модель получила по нескольким причинам. Во-первых, она легко воспроизводится. Во-вторых, она позволяет легко регистрировать результаты исследований. В-третьих, данную модель можно получить как у лабораторных животных (крысы, мыши, морские свинки), так и у человека. В-четвертых, при проведении опытов на животных можно использовать различные линии животных (в т.ч. нокаут-животных) и животных с приобретенными (искусственно вызываемыми) дефектами иммунитета. В-пятых, при постановке опытов можно индуцировать септическое и асептическое воспаление, можно перед взятием клеток провести различные воздействия, а на модели лишь зарегистрировать результаты (т.е. сама реакция проходит in vivo).

Можно приводить также и другие причины, но ограничимся этими. Естественно, эта модель не является единственной, предложены и другие, о которых будет упомянуто ниже.

Итак, рассмотрение выбранной модели будет происходить следующим образом:

1. Варианты получения модели.

2. Возможные методы регистрации результатов исследования.

3. Различные варианты моделируемых процессов.

Вопросы, касающиеся практического аспекта использования результатов исследования, будут рассматриваться в каждом случае, а не будут выносится в отдельный раздел.

I.Получение модели.

Опыты проводят на белых мышах, крысах, морских свинках (в редких случаях на кроликах) различных линий (CC57/W, CBA, «WISTAR», C57BL/6), а также на нелинейных животных. Выделяют индуцированные и неиндуцированные МФ. В случае, если необходимы интактные МФ, то животным вводят интраперитонеально стерильный 10% раствор пептона или несколько мл стерильного парафинового масла, можно также использовать 2,5% раствор крахмала в физ. растворе. Обычно, через 48 часов наркотизированное животное забивают, перитонеальную полость промывают и перитонеальную жидкость отсасывают. В полученную жидкость добавляют стабилизатор (гепарин, глютатион) и антибиотики (но только не макролидового ряда!), чаще используют пенициллин, стрептомицин. Далее жидкость можно центрифугировать и последующей выдержкой, а можно сразу выдерживать в стеклянных кюветах (2 ч). Основной принцип состоит в том, что макрофаги обладают способностью прикрепляться к стеклу или пластику, тогда как другие клетки этой способностью не обладают. После экспозиции саму среду сливают (или промывают) и готовят новую, не содержащую гепарин. Полученная таким образом популяция клеток считается, что состоит на 95% из МФ. Далее клетки помещают на специальные среды (N199) с питательными веществами и антибиотиками. Сохраняться такие МФ могут не более 48-72 часов при поддержании оптимальной температуры (37 С) и ионно-осмотического баланса.

В случае, ежели необходимы активированные МФ, то их активацию проводят путем

• Иммунизации животного введением различных сывороток или мощных антигенов,

• Индуцированием очага септического воспаления брюшины (введение токсина в р-ре пептона, введение взвеси убитых или живых микроорганизмов).

Дальнейшие действия совпадают с уже названными.

Представляет интерес также выделение человеческих МФ. Обычно, их получают из асцитической жидкости больных с недостаточностью кровообращения III степени. Затем их осаждают центрифугированием (400g, 10 мин), замораживают при температуре жидкого азота. После размораживания их помещают в специальные чашки со средой и культивируют.

Подчас непосредственно МФ полученные из перитонеального экссудата служат лишь для регистрации опыта поставленного над животным in vivo и их культивирование носит только диагностических характер.

II.Регистрация результатов

После постановки опытов возникает резонный вопрос, а как обнаружить изменение активности МФ, как определить те изменения, повлиявшие на работу фагоцитирующих клеток. В нашей стране наиболее широко используется несколько методов.

1. Для исследования поглотительной фазы фагоцитоза используют различные тест-объекты. Ими могут служить кроме микробов эритроциты и различные индиф­ферентные частицы: латекса, туши, кармина, коллоидного угля, кадмия. Поглотительную активность фаго­цитов оценивают прямым визуальным подсчетом поглощенных микробов или других частиц внутри МФ, а так­же по числу частиц, оставшихся непо­глощенными, например частиц латекса, с помощью электронного счетчика ча­стиц, эритроцитов по концентрации гемоглобина спектрофотометрически, эмульгированных частиц масляного красного со спектрометрической регистрацией или меченных флюоресцеинизотиоцианатом микрококков с по­мощью флюориметра. Высокая точ­ность и производительность характери­зуют метод изучения фагоцитоза флюо­ресцирующих частиц латекса с помощью автоматического проточного цитофлюо-риметра. При использовании прямого визуального метода рассчитывают фагоцитарный ин­декс (ФИ) — процент фагоцитирую­щих клеток от общего числа, фагоци­тарное число (ФЧ) — среднее ко­личество частиц, захваченных одной клеткой. Отдельно учитывают резуль­таты через 1 и 3 ч: соответственно ФИ1, ФИ3, ФЧ1 и ФЧ3 , а также коэф­фициент фагоцитарного числа (КФЧ): отношение ФЧ1 к ФЧ3 — показатель, характеризующий скорость фагоцитоза.

Необходимо помнить, что эффективность всех этих показателей зависит от ряда условий, таких как длительность инкубации, формы дна сосуда — круглой и ко­нической (в конических пробирках наблюдались более высокие показатели фагоцитоза, что, видимо, обусловлено стимулирующим влиянием короткодистанционного взаимодействия), pH среды, содержания кислорода и углекислоты.

2. Оценка хемотаксиса лейко­цитов осуществляется двумя распро­страненными методами. Метод Бойдена основан на принципе прохождения лей­коцитов из одной половины камеры со взвесью клеток в другую половину с хемоатрактантом, разделенных между собой мембранным фильтром. Для изучения хемотаксиса макрофагов применяют фильтры с раз­мером пор соответственно 5— 8 мкм. Имеющиеся разновидности мето­да Бойдена включают двухфильтровый и радиоизотопный варианты. Другой метод основан на хемотаксисе под слоем агарозы. В качестве хемоатрактанта чаще используют обра­ботанную зимозаном или липополисахаридом сыворотку, казеин, фильтрат культуры Е. coli или других микроорга­низмов, синтетические формилпептиды.

Движение клеток при отсутствии хемотаксического стимула дает характери­стику

случайной двигательной активности (спонтанная миграция) фагоцитов.

Измерение эластичности клеток также можно осуществить в камерах Бойдена.

Адгезивные свойства фагоцитов оценивают по прилипаемости на поверхности стекла

или в колон­ках с бусами. Между способностью к распластыванию макрофагов, оп­-

ределяемой под фазово-контрастным микроскопом, и фагоцитозом имеется

определенная корреляция

3. Для оценки уровня активности МФ используется полярографический метод (потребление кислорода), НСТ-тест (восстановление нитросинего тетразолия), йодирование (пере­ход радиоактивного меченого йода в кислотонерастворимый осадок), окис­ление глюкозы (образование молекул ¹⁴СО₂ при окислении глюкозы-1-¹⁴С). Данные тесты основаны на том, что активация МФ сопровождается кислородзависимым метаболическим «взрывом». Классическим из данных методов стал НТС-тест. Дело в том, что активированные фагоциты способны поглощать нитросиний тетразолий (НСТ) и восста­навливать его в формазан. НСТ-тест позволяет дифференцировать активированные и интактные фагоциты, но его нельзя считать количественным, так как визуальная оценка результатов субъективна

4. Также для определения бактерицидной способности МФ используется хемолюминесцентный метод, предложенный сравнительно недавно. Как известно, фагоцитоз нейтрофилами и мак­рофагами сопровождается генерацией активных форм кислорода (О₂-, Н₂О₂, ОН^-), индуци­рующих явление хемилюминесценции. По­следняя пропорциональна интенсивности генера­ции фагоцитами активных форм кислорода и может служить косвенным критерием их фагоци­тарной способности, тем более что образуемые продукты обладают выраженными бактерицидны­ми свойствами. Метод анализа хемилюмине­сценции используется в клинике и эксперименте.

Среди методов регистрация хемилюминесценции (ХЛ) является наиболее чувствительным и информа­тивным методом функциональной оценки фагоцитирующих клеток, но вместе с тем и одним из наиболее сложных, не столько в методическом плане, сколько в понимании природы биохимических и физических процес­сов, которые приводят к излучению света. Механизмы, лежащие в основе ХЛ фагоцитов, сложны и недостаточно изучены. Свечение может возникать в реакции O₂+O₁=2O₂+hV, важ­ную роль могут играть радикалы ОН-. Анализ различных ингибиторов свечения приводит к мысли, что синглетный кислород, гидроксильный ра­дикал и перекись водорода вовлечены в процесс ХЛ.

ХЛ фагоцитирующих клеток значи­тельно усиливается в присутствии лю­минола или

люцигенина.

Предложено много методов регист­рации ХЛ фагоцитарных клеток, эти методы можно разделить на 2 основных класса.

/. Регистрация собственной ХЛ. Усиление собственной ХЛ фагоцити­рующих клеток наблюдается при сти­муляции опсонизированным зимоза­ном, бактериями, частицами латекса. Собственная ХЛ клеток имеет низкую интенсивность и лежит в ши­роком спектральном диапазоне с мак­симумом в области 400—500 нм. Регистрация ХЛ требует высокий чув­ствительности прибора и достаточного количества выделения клеток (обыч­но не менее 10⁶ клеток). Эритроциты, гемоглобин, сыворотка крови ингибируют ХЛ.

2. ХЛ в присутствии люминола. Свечение имеет на 2— 3 порядка большую интенсивность, чем собственная ХЛ. Усиление ХЛ на­блюдается при действии зимозана, бактерий, частиц латекса, комплексов антиген — антитело, ионофора каль­ция, хемотаксических пептидов. ХЛ может наблюдаться в суспензии как выделенных, клеток, так и клеток в сыворотке крови.

Таким образом, хемилюминесцентный метод позволяет проводить быст­рую количественную оценку фагоци­тарной и бактерицидной активности клеток. Он может использоваться при исследовании малых количеств биоло­гического материала крови, или может служить как для оценки состояния клеток, так и для оценки опсонической активности сыворотки и влияния лекарственных препаратов.

5. Наиболее точными и быстрыми мето­дами определения фагоцитарной актив­ности лейкоцитов являются радиометри­ческие. Так, поглотительную способ­ность оценивают по уровню включения изотопа в фагоцитирующие клетки. Для этого используют меченные Сr эритро­циты, радиоактивную масляную эмульсию или микробы, меченные ¹⁴С-глицином, ³Н-лейцином, ³Н-уридином, или частицы ¹⁹²Ir. Иногда фагоцитоз оценивают по умень­шению метки (³²Р) во внеклеточной сре­де.

Радиометрические методы отличаются быстротой постановки и объективностью оценки результатов. Как правило, в конце инкубации микробов с фагоцита­ми последние разрушают осмотическим лизисом, замораживанием — оттаива­нием или дезоксихолатом натрия, затем добавляют на 30 мин при 37°С ³Н-тимидин и подсчитывают радиоактивность осажденных на фильтре бактерий. С помощью двойной метки определяют одновременно поглотительную и бакте­рицидную функцию лейкоцитов. Для этого предварительно метят микро­бы одним из изотопов (¹⁴С-фенилаланин, ¹⁴С-ацетат натрия), а затем в конце ин­кубации разрушают фагоциты и вносят ³Н-тимидин. Радиоактивность первона­чально меченых микробов, включенных в фагоциты, будет отражать их погло­тительную функцию, а радиоактивность, включенная в микробы, после разруше­ния фагоцитов будет характеризовать их бактерицидность. Существуют авто­радиографические методы оценки завер­шенности фагоцитоза по включению изотопа в процессе инкубации на стек­лах монослоя фагоцитов с микробами.

6. Одним из по­казателей функциональной активности макрофагов является уровень актив­ности 5’-нуклеотидазы. Активность данного фермента определяют в суспензии не разрушенных МФ по методу Туманян и Кириличевой. Метод отличается простотой и точностью, достоверностью, достаточно часто используется.

III.Некоторые моделируемые процессы.

СНИЖЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ МЫШЕИ В УСЛОВИЯХ СОЧЕТАННОГО ПРИ­МЕНЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВОГО

ЭНТЕРОТОКСИНА ТИПА А И ЭНДОТОКСИНА

Механизмы патогенного действия стафилококко­вых энтеротоксинов (СЭ) изучены недостаточно. Известно, что блокада ретикулоэндотелиальной системы (РЭС) торотрастом повышает чувстви­тельность животных к рвоте, индуцированной СЭ. Это предполагает, что функциональный статус РЭС играет важную роль в ответе орга­низма на энтеротоксин. Данные литературы сви­детельствуют и о возможности влияния СЭ на функционирование фагоцитирующих клеток. Во-первых, введение СЭ обезьянам через желудоч­ный зонд приводит к развитию острого гастро­энтерита с экссудацией нейтрофилов, макрофа­гов и другими признаками воспаления. Во-вторых, важнейшим свойством СЭ является спо­собность сенсибилизировать животных к ле­тальному действию эндотоксинов грамотрицательных бактерий (липополисахарид — ЛПС), что ставит их в один ряд с веществами, вызыва­ющими гиперактивацию РЭС, и также оказыва­ющими сенсибилизирующее действие. При­нимая во внимание постоянный контакт орга­низма с условно-патогенными бактериями, а со­ответственно и с эндотоксинами кишечной мик­рофлоры, исследование макрофагальных функ­ций, ответственных за элиминацию микроорга­низмов в условиях воздействия СЭ и при соче­танием применении их с ЛПС, приобретает осо­бую актуальность. В связи с этим, задачей опыта явилось изучение основных за­кономерностей изменения фагоцитарной и бакте­рицидной функций макрофагов под действием СЭ типа А (СЭА) и ЛПС.

I серию опытов по изучению фагоцитарной и бактери­цидной активности проводили с макрофагами, полученными от мышей следующих групп: 1-я — через 2 ч после инъекции энтеротоксина, 2-я и 3-я — через 24 ч после введения СЭА и ЛПС в отдельности, 4-я — через 24 ч после введения эндотоксина на фоне СЭА. СЭА вызывал двукратное снижение общего числа клеток уже через 2 ч после инъекции; через 24 ч общее количество клеток по-прежне­му оставалось пониженным. Если ЛПС у интактных мышей способствовал увеличению выхода клеток в брюшную полость, то на фоне СЭА их количество не только не возрастало под действием ЛПС, а даже достоверно уменьша­лось по сравнению с контролем.

Изучение фагоцитарной и бактерицидной ак­тивности макрофагов через 2 ч после введения мышам СЭА выявило их заметное снижение по сравнению с показателями для контрольных жи­вотных. Через 24 ч после инъекции СЭА и ЛПС в отдельности наблюдалось усиле­ние фагоцитоза. Выявленные закономер­ности изменения фагоцитарной функции макро­фагов вполне согласуются с данными литерату­ры, посвященными изучению клиренса угля у кроликов после введения стафилококковых знтеротоксинов. Н. Sugiyama также наблюдал бифазовые изменения фагоцитарной функции РЭС; подавление степени клиренса угля через 2ч после инъекции, сменяющееся его увеличени­ем через сутки.

Бактерицидная активность макрофагов, полу­ченных через 24 ч после обработки животных отдельно СЭА и ЛПС, также возрастала. В случае же совместного введения ука­занных токсинов функция поглощения изменя­лась незначительно, зато степень завершенности фагоцитоза резко снижалась. Необходимо отме­тить, что исследование морфологического соста­ва клеток перитонеального экссудата мышей че­рез 24 ч после инъекции СЭА и ЛПС не выявило существенных различий в процентном соот­ношении макрофагов в опытных группах живот­ных. Поэтому можно утверждать, что выявлен­ные изменения фагоцитарной и бактерицидной функций обусловлены влиянием исследуемых токсинов.

Для уточнения характера влияния СЭА и ЛПС на функциональную активность макрофа­гов следующую серию опытов провели в системе in vitro. С этой целью резидентные перитоне-альные макрофаги, полученные от интактных животных, инкубировали с токсинами в течение 24 ч. В данном случае функция поглощения из­менялась в меньшей степени. Бакте­рицидная активность, также как и в опытах in vivo, повышалась под действием СЭА и ЛПС в отдельности. При одновременном добавлении токсинов к макрофагам бактерицидная функция увеличивалась, а в условиях, приближающихся к таковым in vivo, т. е. при добавлении ЛПС через 4 ч после СЭА, способность макрофагов убивать Staph. aureus также резко снижалась.

Таким образом, в условиях сочетанного при­менения СЭА и ЛПС происходит резкое сниже­ние функции завершенного фагоцитоза макрофа­гов. Тот факт, что в условиях in vitro прослежи­ваются те же закономерности, что и в системе in vivo, предполагает, что СЭ оказывает непо­средственное действие на макрофагальные функ­ции. Учитывая, что фагоцитирующие клетки представляют собой первую линию защиты от чрезвычайно распространенных условно-пато­генных микробов, снижение бактерицидных свойств в условиях синергического действия СЭ с эндотоксинами грамотрицательных бактерий в организме может привести к развитию тяже­лых септических осложнений.

ОТМЕНА УСИЛИВАЮЩЕГО ФАГОЦИТОЗ ДЕЙСТВИЯ ОПСОНИНОВ С ПОМОЩЬЮ

ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ ПРОТИВ Fc-РЕЦЕПТОРОВ МАКРОФАГОВ

Один из наиболее важных и давно установ­ленных иммунологических феноменов — усиление захвата фагоцитирующими клетками корпуску­лярных антигенов после их сенсибилизации IgG-антителами — оставался продолжительное время малоизученным. После выяснения принципов структурной организации молекулы IgG и об­наружения на поверхности фагоцитов и в том числе макрофагов рецепторов для Fc-участка IgG было постулировано, что опсонизирующие антитела обеспечивают усиление за­хвата корпускулярного антигена благодаря вза­имодействию Fc-участка молекулы антитела с Fc-рецептором (FcR) макрофага. Единст­венным экспериментальным доказательством в пользу этого был факт отсутствия у Fab-фрагментов опсонизирующих антител способно­сти усиливать захват корпускулярного антигена доказательства вовлечения FcR в процесс захва­та опсонизированного корпускулярного антигена. Подобный экспериментальный подход нель­зя рассматривать как адекватный для прямого доказательства вовлечения FcR в процесс захва­та опсонизированного корпускулярного антигена. Исходя из сказанного, было решено получить прямые доказательства роли FcR в реализации механизма усиления захвата макрофагами кор­пускулярного антигена, сенсибилизированного IgG-антителами. Это было достигнуто при оцен­ке влияния на указанный процесс Fab-фрагментов антител против FcR макрофагов, которые, как было установлено, препятствуют взаимодействию с макрофагами агрегированного IgG. Пре-инкубация перитонеальных макрофагов с Fab-фрагментами анти-FcR-антител полностью отме­няла эффект усиления захвата макрофагами оп­сонизированного антигена.

В результате опыта было установлено, что Fab-фрагмент IgG из анти-FcR-сыворотки эффективно блокирует FcR мышиных мак­рофагов, препятствуя связыванию этими клетка­ми гетерологичного агрегированного IgG. Эти данные хорошо согласуются с фактом блокиро­вания FcR перитонеальных макрофагов бивалентными FаЬ-фрагментами из антиFcR. Эти данные в сочетании с результатами контрольных экспериментов, свидетельствующи­ми об отсутствии способности блокировать FcR Fab-фрагментами IgG из антисыворотки против иммунного преципитата, указывают на возмож­ность использования моновалентных Fab-фраг-ментов aнти-FcR-aнтитeл для изучения функции FcR макрофагов в реализации действия опсонинов. Следует подчеркнуть, что использование моновалентных фрагментов анти-FcR-антител имеет принципиальное значение при изучении функциональной роли FcR, поскольку в отличие от нерасщепленных антител или бивалентных FаЬ-фрагментов моновалентные Fab-фраг­менты неспособны, связавшись с FcR, вызвать при 37 °С их латеральное перемещение по цитоплазматической мембране и последующий кэппинг.

Полученные данные свидетель­ствуют, что преинкубация макрофагов с Fab-фрагментами aнти-FcR-антител полностью отме­няет эффект усиления фагоцитоза S.typhimurium(взятую как объект проверки эффективности фагоцитоза), обусловленный IgG-антителами кролика против этого микроорганизма. Собственно Fab-фраг­менты aнти-FcR-антител не оказывают какого-либо влияния на фагоцитоз несенсибилизирован­ных антителами бактерий. Если к макрофагам предварительно добавляли Fab-фрагменты ан­тител кролика против иммунного преципитата, образованного яичным альбумином и IgG-анти­телами кролика против этого антигена, это не оказывало никакого влияния на процесс фагоци­тоза сенсибилизированных антителами бакте­риальных клеток.

Таким образом, Fab-фрагменты анти-FcR-aнтител избирательно подавляют фагоцитоз толь­ко сенсибилизированных антителами бактерий. С учетом результатов контрольных эксперимен­тов это служит несомненным доказательством в пользу того, что усиление захвата корпускуляр­ного антигена после его опсонизации IgG-анти­телами обусловленно взаимодействием Fc-уча-стка опсонизирующих антител с FcR макрофа­гов.

Обращает на себя внимание тот факт, что мак­рофаги, предварительно обработанные Fab-фрагментами aнти-FcR-антител, менее эффек­тивно поглощают сенсибилизированные антите­лами бактериальные клетки, чем несенсибилизи­рованные. Этот результат можно объяснить, исходя из представления, что после сенсибилизации бактерий у части из них проис­ходит стерическое экранирование участка кле­точной поверхности, посредством которого мик­роорганизмы прикрепляются к макрофагам. Фа­гоцитоз таких бактериальных клеток осуществ­ляется, по-видимому, после взаимодействия двух молекул антител или более через их Fс-участки с несколькими FcR на цитоплазматической мем­бране макрофага. Если указанное предположе­ние справедливо, захват этой части сенсибили­зированных бактериальных клеток будет невоз­можен после блокирования FcR с помощью Fab-фрагментов aнти-FcR-антител.

Полученные в настоящей работе данные от­крывают новые подходы для регуляции процес­са иммунного фагоцитоза, что может иметь су­щественное значение для детального анализа роли этого процесса при различных патологиче­ских состояниях.

УСИЛЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ ХИТОЗАНА РЕАКЦИИ КОНТАКТНОГО

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МАКРОФАГА С ТИМОЦИТАМИ in vitro

Старая и многогранная проблема иммуностимуляции приобрела новое выражение в связи с поиском путей к созданию искусственных вак­цин. Основные усилия в данном направлении связаны с получением конъюгатов вакцинирую­щих антигенных детерминант с природными или искусственно синтезированными полимерными носителями. Роль носителя в таком молекуляр­ном комплексе должна состоять в усилении специфического ответа на избранную антиген­ную детерминанту.

При поиске эффективного носителя, который мог бы быть использован при конъюгации с ан­тигеном, необходимо иметь сведения о его адъювантном эффекте и отсутствии побочных пато­генетических свойств. В этой связи было обращено внимание на хитозан — гомополисахарид, вы­деляемый из хитина наружного скелета беспоз­воночных. Молекулярная масса изучаемого ве­щества ~ 120000 дальтон.

Цель исследования — выяснить влияние хитозана на процесс контактного взаимодействия макрофага с тимоцитами в опытах in vitro. Об­ращение к данным клеточным типам не случай­но. Известно, что взаимодействие макрофага с тимоцитами является дополнительным фактором трансформации недифференцированных тимусзависимых клеток в зрелые Т-лимфоциты. В связи с этим интересно определить, оказывает ли какое-либо влияние избранный гомополимер на один из самых ранних этапов становления иммунной системы — формирование функцио­нально активной популяции зрелых Т-клеток.

Было проведено 3 серии опытов. В 1-й серии изучали характер взаимодействия сингенных тимоцитов с прили­пающими клетками перитонеального экссудата, которые инкубировали непосредственно перед постановкой реакции с одной из выбранных доз хитозана в течение различного времени. Уста­новлено, что наиболее эффективно реакция гроздеобразования проходит при 30-минутной инку­бации макрофагов с хитозаном. Коли­чество тимоцитов, группирующихся вокруг мак­рофага, в 2,5 раза больше по сравнению с тако­вым в контроле. В этой же серии опытов решал­ся вопрос об интенсивности взаимодействия ана­лизируемых типов клеток в зависимости от до­зы, использованного для инкубации хитозана, при оптимальном времени инкубации 30 мин. Выяснено, что наибольшее усиление реакции гроздеобразования наблюдается при добавлении в культуру 50 мкг полисахарида.

Во 2-й серии опытов анализ реакции грозде­образования проведен в условиях предваритель­ной 30- и 60-минутной инкубации тимоцитов с разными дозами хитозана. Инкубация в течение как 30, так и 60 мин приводила к усилению контактного вза­имодействия тимоцитов с макрофагами. Как и в предыдущей серии опытов, оптимальная доза, усиливавшая эффект гроздеобразования, равня­лась 50 мкг.

В заключительной 3-й серии опытов проведе­но изучение интенсивности гроздеобразования при внесении хитозана непосредственно в реаги­рующую систему макрофаг—лимфоцит. Как и в 2 предыдущих сериях опытов, констатирова­но усиление контактного взаимодействия ти­моцитов с макрофагами.

Для объяснения выявленных фактов необхо­димо иметь в виду, что хитозан является поли­катионом. В то же время интегральный заряд как тимоцитов, так и макрофагов отрицатель­ный. Возможно, эффект усиления контактного взаимодействия связан с электростатическими межклеточными притяжениями под влиянием хитозана, включающими 2 этапа: 1-й этап — ад-гезия положительно заряженного хитозана на макрофаге или тимоците, 2-й — непосредственное взаимодействие отрицательно заряженной клет­ки с клеткой-партнером, проинкубированной с поликатионом и несущей в результате этого больший положительный заряд. Подобное пред­ставление подкрепляется тем, что эффект усиле­ния реакции гроздеобразования не связан со схемой инкубации и будет одинаков независимо от того, какой тип клеток подвергался инкуба­ции с хитозаном.

Второй момент, который требует объясне­ния, — это незначительное время инкубации кле­ток с хитозаном, при котором обнаруживается эффект усиления контактного взаимодействия. Возможно, что отсутствие эффекта при более длительной инкубации связано с фагоцитозом высокомолекулярного полисахарида, вследствие чего происходит восстановление исходного заря­да взаимодействующих клеток. Однако представ­ленное объяснение должно быть подтверждено дополнительными экспериментальным факта­ми.

АКТИВАЦИЯ ФАГОЦИТАРНЫХ КЛЕТОК И КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА

СИНТЕТИЧЕСКИМИ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ

Ряд перспективных неприродных полиэлектро­литов, использующихся для создания синтетиче­ских вакцин, обладает многими иммуномоделирующими потенциями: они усиливают миграцию стволовых клеток, Т- и В-лимфоцитов, являются стимуляторами Т- и В-клеток, замещают хелперную функцию Т-лимфоцитов и макрофагов. Эти свойства обеспечивают сильное стимулирующее действие на реакции гуморального и клеточного иммунитета.

Вместе с тем недостаточно ясным остается во­прос об их действии на систему фагоцитарных клеток, формирование клеточного, в частности трансплантационного, иммунитета. Целью настоя­щей работы было изучение этих вопросов.

Методика исследований была следующей: мышам гибридам(CBAXC57BL/6) внутрибрюшинно вводили различные до­зы полиэлектролитов однократно, выделяли МФ через 48 ч и анализировали их.

Введение полианиона NA-5 вызывает в макрофагах мышей активацию гликолиза. Например, в 3 экспериментах усиление гликолиза по сравне­нию с контрольными клетками было в 1,45, 2,35, 4,3 раза. Это очень сильная активация гликоли­за в клетках, свидетельствующая о переходе их на более высокий физиологический уровень ме­таболизма. Значительно возрастала в клетках и интенсивность гексозомонофосфатного шунта: в 2 из 3 опытов введение полианиона сопровож­далось появлением макрофагов со средней ак­тивностью окисления глюкозы, соответствующей 8,67+1,47 и 7,24+1,95 МФЕ на 10^б клеток (в контроле 5,17+0,95 и 4,1 + 1,29 МФЕ на 10⁶ клеток). Еще более сильной оказалась ин­тенсификация цикла мочевины, различия которо­го по сравнению с контрольными клетками были уже порядковыми. Например, в опытах 1—3 они составляли соответственно 8,43, 11,54 и 2,06 раза.

Существенное усиление гликолиза обусловли­валось также введением животным карбоцепного полиамина Н-З: в 2 из 3 опытов активация была значительной, для ЛДГ она со­ставляла в опытных макрофагах соответственно 89,27+7,41 и 39,54±4,56 МФЕ на 10⁶ клеток, в контрольных — 26,36+8,36 и 20,59+3,86 МФЕ на 10⁶ клеток. Столь же выраженным бы­ло усиление активности окисления глюкозы, ко­торое превышало его в опытных макрофагах в сравнении с контрольными в 3 экспериментах соответственно в 2,11, 1,28 и 1,41 раза.

Крайне значительной была интенсификация цикла мочевины, так как активация ключевого фермента АРГ возрастала в различных опытах в 3,65—54,6 раза..

В то же время активность поликатиона D_11-100э была значительно менее выражена, он не влиял существенно на состояние гликолиза и гексозомонофосфатного шунта макрофагов. Однако все же активность цикла моче­вины в клетках достоверно увеличивалась, хотя и менее существенно, чем под влиянием Н-3 и NA-5.

В макрофагах мышей, стимулированных поли­анионом NA-5, почти двукратно повышалась активность лизосомальных гидролаз, составляя в опыте 27,42+4,09 нМ Р/ч на 10^б клеток и в контроле 15,04+3,66 нМ P/ч на 10^б клеток. Активность КФ после введения мышам Н-3 была еще большей — 35,51+4,82 нМ P/ч на 10^б клеток. Подобное усиление свиде­тельствует о существенном возрастании в макро­фагах переваривающей способности.

У макрофагов мышей полианион NA-5 вызы­вал не только интенсификацию некоторых путей метаболизма, но и повышение экспрессии рецеп­торов к IgG, которое было нерезко выраженным, но статистически достоверным.

Дозозависимым оказался ответ клетки, выявляемый по генерации кислородных радикалов у мышей, которым вводили различные дозы полиамина Н-3. Так, если доза 0,5 мг/мышь подавляла хемилюминесценцию макрофагов при фагоцитозе, не изменяя ее при адгезии клеток на стекло, то дозы 1, 5 и 10 мг/мышь уже обус­ловливали существенное возрастание хемилю-минесценции при фагоцитозе частиц. При адге­зии эти дозы также оказались активирующими, за исключением дозы 5 мг/мышь. Оптимальное усиление генерации активных кислородных ради­калов вызывало введение животным 1 мг/мышь препарата Н-3 — в этом случае повышалась хемилюминесценция максимально и при фагоцито­зе, и при адгезии. Дальнейшее увеличение дозы не сопровождалось повышением действия на клетки. Подобное наблюдение полностью под­тверждается данными литературы о влиянии это­го препарата на различные иммунологические параметры.

Таким образом, синтетические полиэлектроли­ты—полианион NA-5 и карбоцепный полиамин Н-3 вызывают активацию макрофагов, усиливая гликолиз, гексозомонофосфатный шунт, цикл мо­чевины, активность лизосомальных гидролаз. Препараты повышают также экспрессию на плазматической мембране макрофагов Fc_v-peцепторов. Имеются, однако, особенности, состоя­щие в том, что если Н-3 вызывает усиление генерации макрофагами активных кислородных радикалов, полианион NA-5 оказывается в этом отношении неактивным. Поликатион D_11-100э оказывает менее выраженное влияние на макро­фаги, однако существенно повышает на них экс- прессию Рс₇-рецепторов, интенсифицирует цикл мочевины.

Формирование трансплантационного иммуни­тета изучали у животных, которые получали однократно внутрибрюшинно по 1 мг/мышь пре­паратов в день трансплантации кожи.

Результаты свидетельствовали, что все 3 пре­парата вызывали усиление трансплантационного иммунитета, выражающееся в достоверном уско­рении отторжения трансплантата у мышей, кото­рым их вводили. Причем, как и на других моде­лях, в частности при анализе состояния макро­фагов в условиях воздействия препаратов, ак­тивность полииона D_11-100э уступала активности NA-5 и Н-3. Можно сделать вывод, что полиион NA-5 и карбоцепный полиамин Н3 обладают способностью усиливать клеточный Т-опосредованный иммунитет, менее активным был D_11-100э.

АКТИВАЦИЯ МАКРОФАГОВ ПОД ВЛИЯНИ­ЕМ СИНТЕТИЧЕСКОГО АНТИОКСИДАНТА

Сейчас общепринятой считается закономерность: актива­ция макрофагов (МФ) сопряжена с метаболи­ческим (окислительным) взрывом, с активацией глюкозомонофосфатного шунта (ГМФШ), с про­дукцией и секрецией высокоактивных нестабиль­ных продуктов восстановления кислорода — супероксиданионов О₂~, перекиси водорода (Н₂О₂), радикалов ОН~ и синглетного кислорода (О₂) .

Образующийся при этом избыток токсичных супероксидных радикалов, а также липопереки-си, накапливающиеся в фагосомах МФ в процес­се фагоцитоза, могут обусловливать окислитель­ное повреждение клеточных мембран и связанное с этим подавление функций МФ. У МФ описана собственная система антиоксидантной защиты, включающая супероксиддисмутазу, удаляющую избыток супероксидных радикалов, а также глу-татионпероксидазу и НАДФ-зависимую глутатионредуктазу, нейтрализующие липоперекиси.

Однако при недостаточности эндогенных антиоксидантов могут возникать различные наруше­ния функций МФ. Было показано, что алкилзамещенные производные 3-оксипиридина (8 ОП), оказывающие умеренное антиокисли­тельное действие, являются эффективными инги­биторами свободнорадикальных реакций и могут быть использованы для защиты от деструктив­ного влияния свободных радикалов.

Целью работы было изучение влия­ния синтетических антиоксидантов на функции МФ. Из ряда синтетических производных ОП были выбраны 2-третбутил-З-оксипиридин (ТБОП), у которого была описана способность стаби­лизировать мембраны эритроцитов. Исследование проводились в сравнении со стандартным активатором МФ — бактериальным липополисахарида (ЛПС из Е. coli О55).

Данные, полученные при изучении непосредственного вли­яния ТБОП в сопоставлении с ЛПС на перитонеальные МФ таковы: для ак­тивации ГФДГ достаточно получасовой инкуба­ции клеток с ТБОП. Судя по показа­телям прироста активности фермента, эффект ТБОП аналогичен действию стандартного акти­ватора — бактериального ЛПС. Доля распла­станных МФ возрастает по сравнению с контро­лем уже через 2 ч инкубации с испытуемыми пре­паратами. На ранних сроках (2 ч) эффект ТБОП более выражен по сравнению с эффектом стан­дартного активатора — ЛПС. На бо­лее поздних сроках культивирования (24 ч), ак­тивирующий эффект ЛПС продолжает нарастать, в то же время доля распластанных МФ под вли­янием ТБОП имеет тенденцию к понижению по сравнению с ранними сроками, но остается до­стоверно повышенной в сопоставлении с посте­пенно возрастающим контрольным уровнем.

После внутрибрюшинного введения ТБОП уже через 1 ч он вызывает отчетливое повышение ко­личества клеток в брюшной полости за счет МФ с преимущественным накоплением крупных МФ, причем и этот эффект аналогичен действию ЛПС.

МФ, извлеченные из брюшной полости мышей через 1 ч после внутрибрюшинного введения ТБОП, отличались усилен­ным распластыванием по сравнению с МФ конт­рольных животных. Фагоцитарная активность этих же МФ была повышенной, судя по интенсивности захвата ими клеток Candida albicans. В этих условиях эксперимента ТБОП по срав­нению со стандартным активатором — бактери­альным ЛПС — в большей степени активирует распластывание, а фагоцитарную активность по­вышает в меньшей степени. В более поздние сро­ки после введения исследуемого препарата (1.5— 24 ч) дальнейшего нарастания количества МФ в брюшной полости и их функциональной активно­сти не наблюдали. В отличие от этого после вве­дения ЛПС количество МФ в брюшной полости и их функциональная активность достигали мак­симального уровня лишь через 24 ч.

В связи с выявленными временными различия­ми стимулирующих эффектов при изучении влия­ния препаратов на интенсивность очищения брюшной полости мышей от введенных бактерий S. typhimurium (клиренс) ЛПС вводили за 24 ч, а ТБОП — за 1 ч до заражения. Для оценки клиренса вычисляли средние разности логариф­мов концентрации бактерий через 1 ч после за­ражения у мышей контрольных и опытных групп. Было обнаружено значительное отставание ин­тенсивности клиренса у мышей, получивших за 4 сут до заражения по 1 мл среды с тиогликолятом, по сравнению с контролем.

На рисунке видно, что ни ТБОП, ни стандарт­ный активатор МФ бактериальный ЛПС не вли­яют на интенсивность очищения брюшной поло­сти от введенных бактерий. Однако на фоне де­фекта бактерицидности МФ, индуцированного предварительным введением среды с тиогликолятом, оба препарата в равной степени достоверно повышают исходно сниженную интенсивность очищения брюшной полости мышей. Под влияни­ем ТБОП, как и под влиянием бактериального ЛПС, наблюдали нормализацию уровня очище­ния брюшной полости, т. е. коррекцию модели­рованного в эксперименте дефекта бактерицид­ности МФ.

Таким образом, у изученного синтетического антиоксиданта ТБОП выявлена способность ак­тивировать мышиные перитонеальные МФ при непосредственном воздействии in vitro. После внутрибрюшинного введения того же препарата наблюдали повышение количества МФ в брюш­ной полости и их функциональной активности. У мышей с предварительно индуцированным де­фектом функции клиренса брюшной полости пре­парат способствовал восстановлению нормаль­ного уровня антибактериальной защиты. По всем изученным тестам активирующего действия на МФ синтетический антиоксидант не уступал стан­дартному активатору МФ — бактериальному ЛПС. При введении мышам ТБОП наблюдали более ранние проявления активации МФ по срав­нению с эффектами ЛПС.

Показатели очищения брюшной полости мышей от введен­ных бактерий после инъекции испытуемых препаратов.

По оси ординат — средние величины разностей логарифмов кон­центрации бактерий в брюшной полости (М±т). I — доверитель­ный интервал для контрольных мышей; // — доверительный ин­тервал для мышей через 4 сут после введения среды с тиоглико-латом. а — через 1 ч после введения ТБОП; б — через 1 ч после введения ТБОП на фоне введения среды с тиогликолатом; в — через 24 ч после введения ЛПС; г — через 24 ч после введения ЛПС на фоне введения среды с тиогликолатом.

ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ МАКРОФАГОВ ПЕРИТОНЕАЛЬНОГО ЭКССУДАТА

МЫШЕЙ ПРИ ДЕЙСТВИИ ПРЕПАРАТОВ ПЛАТИНЫ

Макрофаги способны вызывать лизис различных типов опухолевых клеток, не повреждая нормальные клетки того же гистоге­неза. Нормальные «неармированные», неактивированные макрофаги осуществляют вза­имодействие с опухолевыми клетками на стадии их возникновения и в период начальной стадии их развития. Вещества-цитостатики, применяемые в химиотерапии новообразований, оказывают влия­ние на иммунную систему макроорганизма, в част­ности, поражая и систему мононуклеаров. Влия­ние различных классов цитостатиков на функцио­нирование макрофагального звена иммунитета до­статочно глубоко изучено. Однако данных о характере влияния нового класса противоопухо­левых соединений — координационных соеди­нений платины на макрофаги в доступной лите­ратуре не встречается. Было проведено исследование — определение действия препаратов платины на фагоцитарную активность макрофа­гов перитонеального экссудата. В качестве препаратов были взяты Оксоплатина (цисдихлородиаминтрансдигидроксоплатина IV производства фирмы «Lachema») и циклоплатам (аминциклопептиламин-5-малатоплатина (II) отечественного производства).

В ходе про­веденных исследований было установлено, что привнесении препаратов платины непосредственно в пробирки для счета при регистрации хемилюминесценции в опытах in vitro происходит не­значительное увеличение высвобождения гидроксильного радикала (ОН~), супероксиданиона (О^2-), синглетного кислорода ('0₂), перекиси во­дорода (H₂0₂), что косвенно позволяет судить о стимуляции фагоцитарной активности пери­тонеальных макрофагов препаратами платины in vitro. Так, для циклоплатама максимальное увеличение образования активных метаболитов кислорода наблюдалось в дозе, равной 0.5 МПД (LD=23 мг/кг), и индекс хемилюминесценции составлял 3,2 по сравнению с 2,28 в контроле, тогда как добавление оксоплатины в дозе, равной ¹/4 МПД, к суспензии перитонеальных макрофагов вызывало увеличение индекса хемилюменисценции с 1,69 в контрольных пробах до 2,62 в опыте.

Неоднозначные и достаточно противоречивые результаты были получены при дальней­шем исследовании влияния оксоплатины и цикло­платама на фагоцитарную функцию перитонеаль­ных макрофагов in vivo (при введении препа­ратов внутрибрюшинно мышам). Введение оксоплатины и цикло­платама неиммунным мышам вызывало подавле­ние фагоцитоза (на 1-й день после введения циклоплатама во всех дозах, на 1-й и 2-й дни после введения оксоплатины во всех дозах, с уста­новлением стимулирующего влияния в последую­щие дни для обоих препаратов).

Однако введение оксоплатины и циклоплатама в тех же дозах в аналогичные сроки совмест­но с антигенной стимуляцией дало противопо­ложный эффект. На 1-й день после введения оба препарата вызвали дозозависимое увеличе­ние индекса хемилюминесценции на 2 и более порядка (индекс хемилюминесценции И_хл для оксоплатины в дозе 1,0 МПД составил 106,9, для циклоплатама в дозе 1,0 МПД — 407,0, тогда как в контроле — 1,3—2,5). В последую­щие дни после введения препаратов иммунным мышам стимулирующее влияние на фагоцитар­ную активность перитонеальных макрофагов про­слеживалось отчетливо для всех доз, но носило менее выраженный характер.

Предполагается, что при объяснении подоб­ного явления нельзя оставить без внимания факт гетерогенности перитонеальных макрофагов и неизбежной реакции на внутрибрюшинное вве­дение аллоантигена, выражающейся в перераспределении субпопуляций перитонеальных макрофа­гов в пользу так называемых воспалительных в отличие от резидентных. Не исключено появ­ление незрелых резидентных макрофагов, так­же характеризующихся большей пероксидазной активностью.

Однако возможно, что при подобной по­становке реакции регистрировался факт захвата и поглощения перитонеальными макрофагами частиц, коими могли быть (и явно были) не толь­ко гранулы зимозана, но и гетерологичные эри­троциты барана. В пользу этого говорят дан­ные работы, проделанной X. М. Исиной в ла­боратории И. Я. Учителя , о том, что именно в 1-е сутки после иммунизации происходят мак­симальный захват, поглощение и разрушение макрофагами гетерологичных эритроцитов с по­следующей (к 48-му часу) стабилизацией про­цесса. Поэтому делается вывод, что 1-е сутки введения не могут рассматриваться как осново­полагающие при утверждении стимулирующего влияния оксоплатины и циклоплатама на фаго­цитарную активность перитонеальных макрофа­гов, тогда как результаты последующих дней яв­ляются достоверным подтверждением подобного явления

ИЗУЧЕНИЕ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ В

ОТ­НОШЕНИИ YERSINIA PESTIS С ДЕФЕКТНЫ­МИ И ПОЛНОЦЕННЫМИ

FRA-ГЕНАМИ

Известно, что возможность развития чумной инфекции во многом опреде­ляется исходом взаимодействия кле­ток возбудителя Y. pestis с фагоцитами, который зависит от степени бактери­цидной активности макрофагов (МФ) и наличия антифагоцитарных факторов у микробов. К антифагоцитарным суб­станциям Y. pestis относят термоиндуцируемый капсульный антиген «фрак­ция I», антигены вирулентности V, W, I и др.. Не исключено существова­ние неидентифицированных компонен­тов с той же функцией. Действие фрак­ции I связывают с ингибицией бактери­цидной активности МФ, ее участие в процессе захвата бактерий МФ отри­цается. Специфическая иммунизация животных приводит к изменению МФ, которое способствует ускорению погло­щения вирулентных и вакцинных штам­мов Y. pestis и последующего их лизи­са. В последние годы установлено, что детерминанты фракции I и VW-антигенов локализованы на плазмидах, которые, вполне вероятно, несут и другую генетическую информа­цию, пока неидентифицированную, но, возможно, связанную с антифагоцитар­ной активностью Y. pestis. Имеющиеся в литературе данные о фагоцитозе при чуме получены в опытах, в которых не идентифицировалось, связано ли нару­шение синтеза исследуемых антигенов с дефектом отдельных конкретных ге­нов или утратой соответствующей плазмиды целиком. Последнее событие мо­жет вызвать одновременно дефектность по другим, еще не исследованным анти­генам. Это еще требует уточнения.

Цель работы — определение вклада фракции I в процесс взаимодействия возбудителя чумы с индуцированными МФ иммунизированных и интактных экспериментальных животных.

В опытах использовали природный вирулентный штамм Y. pestis 4 (Fra⁺) и изогенный штамм 4 (Fra-), у которого синтез фракции I был «выключен» встройкой элемента Tn10 в соответствующий ген плазмиды . Испытывали по 3 клона каждого штамма. Бактерии пе­ред опытом выращивали в течение 48 ч при 28 и 37 °С на агаре LB («Difco») рН 7,2. Фагоцитоз изучали in vitro в культуре индуцированных перитонеальных МФ морских свинок и белых мышей, интактных и иммунизированных подкожно однократно в дозе 10⁶ мик­робных клеток (МК) чумной вакциной. В опытах с фа­гоцитами нагрузка составляла 50 мик­робных клеток (мк) на МФ. Пробы ин­кубировали при 37 °С в течение 6 ч. Интенсивность фагоцитоза оценивали с помощью показателя активности фаго­цитов (АФ) и индекса завершенности фагоцитоза (ИЗФ).

Все изученные бакте­рии, выращенные при 28 °С (28°-культуры), когда синтез фракции I нахо­дится на очень низком уровне, погло­щались одинаково вне зависимости от способности их fra-генов нормально функционировать и от того, выделены испытываемые МФ от иммунизирован­ных или интактных животных. В опытах с бактериями, выращен­ными при 37 °С (37°-культуры), эффек­тивность захвата (АФ) во всех пробах была значительно ниже, чем при 28 °С.. Поскольку снижение наблюда­ли у штаммов как способных, так и неспособных продуцировать фракцию I, сделано предположение, что в 37°-культуре имеет место индукция синтеза или проявление функций не фракции I, а каких-то дополнительных компонен­тов клеточной стенки бактерий, мешаю­щих установлению контакта бактерий и МФ. Необходима дальнейшая работа по идентификации этих компонентов.

МФ интактных белых мышей одина­ково захватывали бактерии Fra⁺- и Fra-, МФ иммунизированных мышей несколько активнее поглощали Fra⁺-бактерии. МФ морских свинок незави­симо от того, получены они от интакт­ных или иммунизированных животных, более активно захватывали Fra⁺-бакте­рии. Похоже, что в организме морских свинок в отношении испытанных МФ фракция I проявляет себя как неспе­цифический стимулятор фагоцитоза, тогда как в МФ белых мышей должна произойти специфическая перестройка, сопровождающая иммунизацию, преж­де чем фракция I окажется способной слабо стимулировать захват бактерий возбудителя. Более высокие значения АФ у вакцинированных морских свинок в отношении как Fra⁺-, так и Fra^--культур возбудителя чумы, выращен­ных при 37 °С, позволяют думать также о появлении у бактерий при этой тем­пературе культивирования дополни­тельных факторов, которые обладают избирательной активностью именно в отношении МФ морских свинок. Еще более выраженный стимулирующий эф­фект этих дополнительных факторов проявляется при контакте МФ иммуни­зированных морских свинок с 37°-культурами, содержащими фракцию I, что позволяет предположить также и спе­цифический элемент действия этого ан­тигена, направленный на усиление захвата бактерий указанными фагоци­тами.

Иными словами, данные эксперимен­тов свидетельствуют, что помимо фрак­ции I, возбудитель чумы, выращенный при 37 °С, содержит компоненты, сни­жающие фагоцитарную активность МФ интактных и иммунизированных жи­вотных, и компоненты, специфически способствующие захвату бактерий МФ морских свинок. Действие последних частично или полностью в присутствии фракции I нейтрализует эффект неиден­тифицированных негативных факторов. Фракция I способствует захвату бак­терий чумы МФ и более значима для морских свинок.

В общем виде выводы по данному эксперименту можно сделать следующие: 1. Иммунизация чумной вакциной морских свинок индуцирует специфи­ческую в отношении фракции I пере­стройку в макрофагах, обусловливаю­щую усиление захвата и переварива­ния Fra⁺-Y. pestis выросших при 37 °С. Подобного не происходит у белых мышей.

2. Дефект Y. pestis по fra-генам и отсутствие фракции I обусловливают более выраженное снижение эффектив­ности захвата бактерий, выращенных при 37 °С макрофагами морских сви-

нок, но не белых мышей и большую степень переваривания макрофагами морских свинок при всех условиях опы­та, а макрофагами белых мышей — только в отношении 37°-культур.

3. Как в захвате, так и завершении фагоцитоза роль фракции более сущест­венна в макрофагах морских свинок.

ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАТОРОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО ОТВЕТА ПРИРОДНОГО

ПРОИСХОЖДЕНИЯ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МАКРОФАГОВ

(ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ АСПЕКТ)

Несмотря на значительные успехи химиотера­пии некоторых видов злокачественных новообразо­ваний, результаты применения противоопухолевых химиопрепаратов при наиболее распространенных локализациях рака остаются малоудовлетвори­тельными. Становится все более очевидным, что одним из основных препятствий для успешной хи­миотерапии злокачественных опухолей является гетерогенность популяции неопластических клеток, которая выражается, в частности, в наличии в ней клонов клеток, резистентных к химиотерапевтиче-ским агентам. Более того, такая резистентность может относиться к целым классам препаратов, что может ограничивать эффективность и комп­лексной полихимиотерапии. Еще более ос­ложняет положение генетическая нестабильность опухолевых клеток, которые, имея высокий уровень спонтанных мутаций, чрезвычайно легко подвергаются мутагенному воздействию химиопре­паратов и продуктов их метаболизма. Это в значительной мере усиливает гетерогенность опухоле­вой популяции, способствует генерации еще боль­шего числа резистентных к химиотерапии клонов, усиливает их способность к метастизированию, рецидиву на фоне продолжающейся химио­терапии.

В конечном счете даже весьма радикальная (на 99,5 %) редукция опухолевой массы в про­цессе химиотерапии почти неизбежно приводит к возобновлению процесса за счет резистентных кло­нов — предшествовавших или возникших в про­цессе химиотерапии. Более того, такие кло­ны оказываются в далеко зашедшей стадии опухо­левой прогрессии и, следовательно, более злока­чественными.

В этих условиях вполне закономерными пред­ставляются поиски путей элиминации опухолевых клеток с так называемой множественной лекар­ственной устойчивостью с помощью других меха­низмов, в частности литического потенциала иммунокомпетентных клеток. Особый интерес в этом отношении представляют макрофаги. В отли­чие от других типов иммуноцитов их активность в меньшей степени подавляется в процессе интен­сивной циторедуктивной терапии, они способны к эффективным противоопухолевым реакциям в со­отношении эффектор/мишень, приближающемся к 1:1 и, инфильтрируя опухолевую строму, имеют достаточную возможность для контакта с опухоле­вой клеткой. Показана возможность актива­ции цитолитического действия макрофагов с по­мощью различных модификаторов биологического ответа (МБО) после воздействия противоопухо­левых химиопрепаратов, в то время как актив­ность других эффекторных систем может быть существенно подавлена. Поэтому в настоящее время идет активная разработка методов адъювантной иммунотерапии с включением активато­ров макрофагов. При этом предварительная оцен­ка эффекта последних проводится in vitro и в основном по способности индуцировать цитолитическую и цитостатическую активность. По сохранению такой способности в процессе приме­нения химиотерапевтических противоопухолевых препаратов оценивается и «совместимость» МБО с ними. Однако индукция цитотоксичности является только одной стороной активации макро­фагов, под влиянием МБО происходят другие зна­чительные изменения функциональной активности этих клеток, в частности усиливается продукция и секреция целого ряда ростовых факторов. В рамках такого подхода было изучено влияние БЦЖ и циклофосфамида на перитонеальные мак­рофаги мышей. Названные препараты выбраны как модельные в виду их достаточной изученности как индукторов противоопухолевой активности макрофагов in vitro и in vivo, а также достаточно широкого применения в клинической практике.

Известно, что цитотоксическая активность мак­рофагов in vitro достигает своего максимума к 48—72 ч культивирования, а затем быстро сни­жается. Была проведена оценка ростстимулирующей активности резидентных и БЦЖ-активированных макрофагов в процессе культивирования in vitro.

Установлено, что способность поддер­живать рост опухолевых клеток прогрессивно снижается у резидентных макрофагов и нарастает у БЦЖ-активированных. Если в первые 3 дня при­рост числа клеток на БЦЖ-активированных мак­рофагах достоверно ниже, чем на резидентных (что может быть объяснено цитотоксической ак­тивностью), то затем наблюдается противополож­ная ситуация.

Таким образом, если индуцированная БЦЖ-активация противоопухолевой активности макро­фагов носит преходящий характер, то активация продукции ростовых факторов более устойчива во времени. Более того, при тестировании цито­токсической и ростстимулирующей активности макрофагов, выделяемых из перитонеальной поло­сти мышей в различные сроки после введения БЦЖ, было выявлено, что цитотоксиче­ская активность (цитолитическая и цитостатиче­ская) максимальна на 10-й день. На 15-й и 20-й дни проявляется только цитолитическая, а цито­статическая активность исчезает. Ростстимулирующая активность максимальна на 15-й и 20-й дни. Следовательно, in vitro активация макрофагов БЦЖ приводит к транзиторной экс­прессии противоопухолевой активности и длительной устойчивой ростстимулирующей активности.

С учетом этих данных становится понятным характер взаимодействия БЦЖ-активированных макрофагов и опухолевых клеток в процессе дли­тельного ко-культивирования in vitro: в первые дни за счет цитотоксичности значительно снижается количество жизнеспособных клеток, одновременно цитостатические факторы тормозят их пролифера­цию, но затем благодаря выделяемым росто­вым факторам интенсивность пролиферации вы­живших опухолевых клеток значительно превы­шает таковую у резидентных макрофагов, в результате чего их общее количество достигает и даже превышает исходный уровень.

В ряде случаев при культивировании малых доз опухолевых клеток — до 10 на лунку (т. е. в соотношении эффектор/мишень 5000:1) — цито­токсической активности может быть достаточно для элиминации всей цито­токсической активности может быть достаточно для элиминации всей опухолевой популяции, од­нако в тех случаях, когда ростовая фракция пре­высит определенный порог цитотоксической актив­ности, наблюдается интенсивный рост оставшихся опухолевых клеток. Именно это объясняет отсут­ствие достоверности результатов культивирова­ния малых доз клеток, так как отклонения от сред­ней величины отличались большей амплитудой.

Таким образом, способность макрофагов, акти­вированных БЦЖ, контролировать рост опухоле­вых клеток in vitro ограничена и проявляется только в соотношениях эффектор/мишень, весь­ма далеких от реально возможного in vivo,— 500:1 — 5000:1. При этом противоопухолевая ак­тивность транзиторна, а опухольстимулирующая носит более длительный и устойчивый характер. Поэтому была предпринята попытка потенцировать противоопухолевую активность БЦЖ-активи­рованных макрофагов путем воздействия на них циклофосфамидом. По данным литературы, этот противоопухолевый препарат является вполне «совместимым» с БЦЖ-агентом (т. е. стимулирует БЦЖ-индуцированную цитотоксичность) и, сле­довательно, может быть компонентом комбиниро­ванной химиоиммунотерапии на основе примене­ния БЦЖ .

Циклофосфамид вводили мышам внутрибрюшинно в дозе 200 мг/кг, за 9 дней до того получивших также внутрибрюшинно 1 мг БЦЖ. На сле­дующий день перитонеальные клетки выделяли и оценивали их цитотоксическую активность, способ­ность поддерживать рост опухолевых клеток в суб­оптимальных концентрациях и влиять на рост автономно растущей опухолевой популяции в усло­виях ко-культивирования. Оказалось, что циклофосфамид самостоятельно индуцировал существенную цитолитическую и цитостатиче-скую активности, кроме того, достоверно усиливал БЦЖ-индуцированную цитотоксичность.. При этом в присутствии макрофагов, активированных комби­нацией БЦЖ с циклофосфамидом, уровень пролиферации опухолевых клеток в зависимых от ростовых факторов концентрациях (10² клеток на лунку) был 2,9'10⁴±3,25-10³ и значительно пре­вышал таковой при культивировании опухолевых клеток на БЦЖ-активированных макрофагах — 3,7-10³±1,4-10², практически не отличаясь от их роста в присутствии нестимулированных макрофа­гов — 3,2-10⁴±4,82-10³.

Таким образом, несмотря на весьма высокий уровень цитотоксичности макрофагов, индуциро­ванный их обработкой вслед за БЦЖ еще и цик­лофосфамидом, такие макрофаги теряли способ­ность даже к ограниченному контролю ко-куль-тивируемой с ними популяции опухолевых клеток.

С учетом весьма значительной в этой серии экс­периментов потери клеток под влиянием факторов цитотоксичности (в отдельных опытах цитолитическая активность достигала 70 %) и прироста клеток, сравнимого с таковым после ко-культиви­рования на резидентных макрофагах, можно счи­тать, что совместное применение БЦЖ и цикло­фосфамида оказывает аддитивное действие на продукцию ростовых факторов макрофагами.

Таким образом, имеющиеся в литературе дан­ные о совместимости БЦЖ и циклофосфамида, будучи совершенно справедливыми в отно­шении противоопухолевой активности активиро­ванных макрофагов, не отражают возможного ко­нечного результата такого совмещения, явно неже­лательного с клинической точки зрения. Следует отметить, что характер ответа макрофагов на ак­тивацию МБО in vivo имеет сходство с таковым in vitro. Как показано еще в первых работах по применению БЦЖ, иммунотерапия этим препара­том эффективна только в течение короткого срока, а затем происходит стимуляция опухолевого про­цесса, причем противоопухолевую активность макрофагов, достаточно быстро угасающую как in vitro, так и in vivo, как правило, не удается вос­становить повторными введениями препарата, ее вызвавшего, и в случае успеха такая реактивация кратковременна.

Данные литературы достаточно однозначно ука­зывают на отсутствие корреляции между цитотоксической активностью БЦЖ-активированных мак­рофагов in vitro и их влиянием на опухолевые клетки in.vivo. Если исходить из представлен­ных нами данных, это становится вполне объяс­нимым: уничтожение in vitro даже большинства опухолевых клеток при последующем стимулиро­вании роста оставшихся приводит к явному ни­велированию эффекта цитолитического действия, особенно если учесть его относительную кратко­временность по сравнению с ростстимулирующим действием. Кроме того, выявляемая in vitro цито-статистическая активность зависит от таких фак­торов, как аргиназа, истощение культуральной среды ввиду повышенного метаболизма активи­рованных макрофагов, продукция токсических радикалов, атомарного кислорода и др. В ус­ловиях in vivo эти эффекты могут не проявляться в связи с притоком аргинина, других питательных веществ к клеткам, наличием антагонистов ра­дикалов и т. д.

Как известно, при опухолевом процессе макро­фаги способствуют развитию опухоли на «орган­ном» уровне путем улучшения микроокружения (имеется в виду стимуляция ангиогенеза, форми­рование стромы опухоли, элиминация продуктов распада опухолевых клеток). Продуцируемые макрофагами иммуносупрессивные факторы, в частности простагландин Е2, способны инактивировать другие иммунологические механизмы рези-стентности к опухолевому росту. Такие фак­торы, как интерлейкин-1 (ИЛ-1), фактор некроза опухоли (ФНО), выделяемые активированными макрофагами, способны подавлять пролиферацию большей части известных линий опухолевых кле­ток, однако они являются и стимуляторами роста некоторых из них .

Учитывая высокую степень гетерогенности опу­холевой популяции и усиление роста таковой под влиянием продуктов активированных макрофа­гов, нельзя исключить появления устойчивых и даже зависимых от ФНО и ИЛ-2 клонов. И если в относительно непродолжительных до времени сроках взаимодействия макрофагов и опухолевых клеток в условиях экспериментальных моделей та­кие эффекты не проявятся, то в реальных ус­ловиях вероятностью такого отбора пренебрегать нельзя. Это особенно актуально, если учитывать, что макрофаги практически неизбежно вовлекают­ся в реализацию любого иммунотерапевтического воздействия, поэтому продемонстрирован­ные здесь негативные последствия их активации могут сказаться и на эффективности всей программы иммунотерапии, направленной изначально на другие эффекторы иммунной системы.

Таким образом, продукция макрофагами факто­ров, стимулирующих рост опухолевых клеток, яв­ляется весьма существенным компонентом ответа этих клеток на МБО. Соответственно при оценке и отборе потенциальных МБО необходимо оцени­вать не только их способность к индукции про­тивоопухолевых реакций, но и возможность экс­прессии побочной ростстимулирующей активности. Только углубленное изучение этого вопроса., направленного на выявление факторов, стимулирующих рост опухолевых клеток, путей их биосинтеза в макрофагах и их регуляцию, может лечь в основу разработки методов селек­тивного подавления нежелательных в онкологиче­ской ситуации ростстимулирующих свойств акти­вированных МБО макрофагов при одновременной сохранности и активации их противоопухолевой активности.

ПЕРИТОНЕАЛЬНЫЕ МАКРОФАГИ КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АТЕРОГЕННОГО

ПОТЕНЦИАЛА СЫВОРОТКИ КРОВИ

Накопление липидов в гладкомышечных клет­ках (ГМК) и макрофагах интимы аорты является характерной чертой атеросклероза человека и экспериментальных животных. Было показано, что сыворотки крови больных ишемической болезнью сердца (ИБС) с ангиографи-чески подтвержденным коронарным атеросклеро­зом в отличие от сывороток крови здоровых лиц обладают способностью вызывать накопление липидов в культивируемых клетках интимы аорты человека. Это свойство было названо атерогенностью, поскольку накопление липидов сопро­вождалось другими атеросклеротическими прояв­лениями на клеточном уровне — усилением пролиферативной активности и синтеза внеклеточ­ного матрикса. Однако связь между атерогенностью и атеросклерозом окончательно не вы­яснена.

Исследования по этой проблеме основаны на первичном культивировании субэндотелиальных клеток интимы аорты человека. Сложность рабо­ты обусловлена необходимостью постоянного обеспечения стерильным аутопсийным мате­риалом, а также высокой стоимостью выделения и культивирования клеток.

Ранее было показано, что способностью аккумулировать внутриклеточно холестерин при культивировании с атерогенной сывороткой обла­дают ГМК аорты человека и мононуклеарные клетки периферической крови. Эти данные позволяют считать, что для определения атеро-генности сыворотки крови могут быть использо­ваны не только субэндотелиальные клетки ин­тимы аорты.

Целью работы было определение возможности использования легкодоступных перитонеальных макрофагов для определения атерогенности сыво­ротки крови.

Кровь для исследований бы взята у больных ИБС, подтвержденной при коронарной ангиографии, и здоровых доноров. ГМК были выделены из аорты мужчин, взятой в асептических условиях спустя 24 ч после внезапной смерти, ступившей от инфаркта миокарда. Человеческие перитонеальные макрофаги были выделены из асцитической жидкости больных недостаточностью кровообращения. Мышиные перитонеальные МФ получены от нестимулированных мышей.

Влияние сыворотки крови здоровых доноров и больных ИБС на уровень холестерина