Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

Введение.

  Бурное развитие жидкостной хроматографии в последние 10 лет обусловлено, главным образом, интенсивной разработкой теоретических основ и практическим использованием ее высокоэффективного варианта, а также созданием и промышленным выпуском необходимых сорбентов и аппаратуры.

  Отличительной особенностью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является использование сорбентов с размером зерен 3—10 мкм, что обеспечивает быстрый массоперенос при очень высокой эффективности разделения.

   В настоящее время ВЭЖХ по темпам развития вышла на первое место среди инструментальных методов, обогнав даже газовую хроматографию. Важнейшее преимущество ВЭЖХ по сравнению с газовой хроматографией — возможность исследования практически любых объектов без каких-либо ограничений по их физико-химическим свойствам, например, по температурам кипения или молекулярной массе.

Сегодня ВЭЖХ представляет собой хорошо оформленный инструментальный метод, который широко применяют в самых  различных областях науки и техники.  Особенно    велико его значение в таких важнейших областях, как биохимия, молекулярная биология, контроль загрязнений    окружающей    среды,а также в химической, нефтехимической, пищевой и фармацевтической промышленности.

поскольку необходимо учитывать целый ряд весьма специфических тре­бований, обусловленных следующими особенностями мето­дики.

а.  Колонки для  ВЭЖХ  наполняют  носителем  с очень  ма­лым диаметром частиц. В результате при таких объемных ско­ростях растворителя, которые необходимы для быстрого разде­ления пробы, на колонке создается высокое давление.

б.  Детекторы,    применяемые    в    ВЭЖХ,    чувствительны  к флуктуации потока  и давления элюента   (шумы).  Более того, при  применении    концентрационных    детекторов     необходима еще более высокая  стабильность объемной  скорости  элюента.

в.  Процесс хроматографического  разделения  сопровождает­ся рядом антагонистических эффектов, так, например, диспер­гирование образца в подвижной фазе ведет к смешению раз­деляемых компонентов и снижает максимальную концентрацию вещества  в элюируемом пике   (в детекторе). Диспергирование наблюдается на всех участках системы от точки ввода пробы до детектора.

г.  Растворители,  выполняющие  роль  подвижной  фазы,  ча­сто  способны  вызывать  коррозию  аппаратуры.  Это  в  первую очередь относится к растворителям, используемым в обращен-но-фазовой хроматографии, которая  предпочтительна  в биохи­мических приложениях ВЭЖХ.

Специфику ВЭЖХ как инструментальной методики необхо­димо учитывать в процессе разработки, создания и эксплуата­ции этих систем. Для создания коммерческих образцов хрома-тографических систем и их компонентов, достаточно надеж­ных, простых и безопасных в работе с приемлемым соотноше­нием между ценой и техническими характеристиками, потре­бовалось более десяти лет поисков и исследований. Наметив­шиеся в последнее время тенденции к уменьшению колонок (как длины, так и диаметра) заставляют предъявлять новые требования к инструментам.

1.1. ЭФФЕКТИВНОСТЬ И СЕЛЕКТИВНОСТЬ 

Хроматография — это метод разделения компонентов смеси, основанный на различии в равновесном распределении их меж­ду двумя' несмешивающимися фазами, одна из которых непо­движна, а другая подвижна. Компоненты образца движутся по колонке, когда они находятся в подвижной фазе, и остаются на месте, когда находятся в неподвижной фазе. Чем больше срод­ство компонента к неподвижной фазе и чем меньше — к подвиж­ной, тем медленнее он движется по колонке и тем дольше в ней удерживается. За счет различия в сродстве компонентов смеси к неподвижной и подвижной фазам достигается основная цель хроматографии — разделение за приемлемый промежуток вре­мени смеси на отдельные полосы (пики) компонентов по мере их продвижения по колонке с подвижной фазой. 

Из этих общих представлений ясно, что хроматографическое разделение возможно, только в том случае, если компоненты образца, попадая в колонку при вводе пробы, во-первых, будут растворены в подвижной фазе и, во-вторых, будут взаимодейст­вовать (удерживаться) с неподвижной фазой. Если при вводе пробы какие-то компоненты находятся не в виде раствора, они будут отфильтрованы и не будут участвовать в хроматографи-ческом процессе. Точно так же компоненты, не взаимодействую­щие с неподвижной фазой, пройдут через колонку с подвижной фазой, не разделяясь на компоненты. 

Примем условие, что какие-то два компонента растворимы в подвижной фазе и взаимодействуют с неподвижной фазой, т. е. хроиатографический процесс может протекать без наруше­ний. В этом случае после прохождения смеси через колонку можно получить хроматограммы вида а, б или в (рис. 1.1). Эти хроматограммы иллюстрируют хроматографические разделения, отличающиеся эффективностью (а и б) при равной селективно­сти и селективностью (б и в) при равной эффективности. 

Эффективность колонки тем выше, чем уже пик получается при том же времени удерживания. Эффективность колонки изме­ряется числом теоретических тарелок  (ЧТТ) N: чем выше эф-

Рис. 1.2. Параметры хрома-тографического пика и рас­чет числа теоретических та­релок:

t_R — время удерживания пика; h — высота пика; Wj/j — шири­на пика на половине его высоты

Рис. 1.1. Вид хроматограммы в зависимости от эффективности и селектив­ности колонки:

а — обычная селективность, пониженная эффективность (меньше теоретических тарелок); б — обычные селективность и эффективность; в — обычная эффективность, повышенная селективность (больше отношение времен удерживания компонентов)

фективность, тем больше ЧТТ, тем меньше расширение пика первоначально узкой полосы по мере прохождения ее через ко­лонку, тем уже пик на выходе из колонки. ЧТТ характеризует число ступеней установления равновесия между подвижной и не­подвижной фазами.

Зная число теоретических тарелок, приходящееся на колонку, и длину колонки L (мкм), а также средний диаметр зерна сор­бента d_c (мкм), легко получить значения высоты, эквивалент­ной теоретической тарелке (ВЭТТ), а также приведенной вы­соты, эквивалентной теоретической тарелке (ПВЭТТ):

ВЭТТ = L/N

ПВЭТТ =B3TT/d_c.

Имея значения ЧТТ, ВЭТТ и ПВЭТТ, можно легко сравни­вать эффективность колонок разных типов, разной длины, за­полненных разными по природе и зернению сорбентами. Срав­нивая ЧТТ двух колонок одной длины, сравнивают их эффек­тивность. При сравнении ВЭТТ сравнивают колонки с сорбен­тами одинакового зернения, имеющими разную длину. Нако­нец, величина ПВЭТТ позволяет для двух любых колонок оце­нить качество сорбента, во-первых, и качество заполнения коло­нок, во-вторых, независимо от длины колонок, зернения сорбен­тами его природы.

Селективность колонки играет большую роль в достижении хроматографического разделения.

Селективность колонки зависит от очень многих факторов, и искусство экспериментатора в большой мере определяется умением воздействовать на селективность разделения. Для это­го в руках хроматографиста находятся три очень важных фак­тора: выбор химической природы сорбента, выбор состава рас­творителя и его модификаторов и учет химической структуры и свойств разделяемых компонентов. Иногда заметное влияние на селективность оказывает изменение температуры колонки, меняющее коэффициенты распределения веществ между по­движной и неподвижной фазами.

При рассмотрении разделения двух компонентов на хрома­тограмме и его оценке важным параметром является разреше­ние R_s, которое связывает времена выхода и ширину пиков обо­их разделяемых компонентов

Разрешение как параметр, характеризующий разделение пи­ков, увеличивается по мере возрастания селективности, отра­жаемой ростом числителя, и роста эффективности, отражаемой снижением значения знаменателя из-за уменьшения ширины пи­ков. Поэтому быстрый прогресс жидкостной хроматографии привел к изменению понятия «жидкостная хроматография вы­сокого давления» — оно было заменено на «жидкостную хрома­тографию высокого разрешения» (при этом сокращенная запись термина на английском языке сохранилась HPLC как наибо­лее правильно характеризующее направление развития совре­менной жидкостной хроматографии).

  Таким образом, размывание в колонке уменьшается и эф­фективность повышается, когда используют более мелкий сор­бент, более равномерный по составу (узкая фракция), более плотно и равномерно упакованный в колонке, при использова­нии более тонких слоев привитой фазы, менее вязких раствори­телей и оптимальных скоростей потока.

Однако наряду с размыванием полосы хроматографической зоны в процессе разделения в колонке может происходить так­же и размывание ее в устройстве для ввода пробы, в соедини­тельных капиллярах инжектор — колонка и колонка — детек­тор, в ячейке детектора и в некоторых вспомогательных устрой­ствах (микрофильтры для улавливания механических частиц из пробы, устанавливаемые после инжектора, предколонки, ре­акторы-змеевики и др.)- Размывание при этом тем больше, чем больше внеколоночный объем по сравнению с удерживаемым объемом пика. Имеет также значение и то, в каком месте на­ходится мертвый объем: чем уже хроматографическая зова, тем большее размывание даст мертвый объем. Поэтому особое вни­мание следует уделять конструированию той части хроматогра­фа, где хроматографическая зона наиболее узкая (инжектор и устройства от инжектора до колонки) — здесь внеколоночное размывание наиболее опасно и сказывается наиболее сильно. Хотя считается, что в хорошо сконструированных хроматогра­фах источники дополнительного внеколоночного размывания должны быть сведены до минимума, тем не менее каждый новый прибор, каждая переделка хроматографа должны обяза­тельно заканчиваться тестированием на колонке и сравнением полученной хроматограммы с паспортной. Если наблюдается ис­кажение пика, резкое снижение эффективности, следует тща­тельно проинспектировать вновь введенные в систему капилля­ры и другие устройства.

Размывание вне колонки и его неправильная оценка могут привести к значительной (более 50%) потере эффективности, особенно в тех случаях, когда относительно давно сконструиро­ванные хроматографы пытаются использовать для высокоско­ростной ВЭЖХ, микроколоночной ВЭЖХ и других вариантов современной ВЭЖХ, требующих микроинжекторов, соединитель­ных капилляров с внутренним диаметром 0,05—0,15 мм мини­мальной длины, колонок вместимостью 10—1000 мкл, детекто­ров с микрокюветами емкостью 0,03—1 мкл и с высоким быстро­действием, высокоскоростных самописцев и интеграторов.

1.2. УДЕРЖИВАНИЕ И СИЛА РАСТВОРИТЕЛЯ

Для того чтобы анализируемые вещества разделялись на ко­лонке, как уже упоминалось выше, коэффициент емкости k' должен быть больше 0, т. е. вещества должны удерживаться неподвижной фазой, сорбентом. Однако коэффициент емкости не должен быть и слишком большим, чтобы получить приемле­мое время элюирования. Если для данной смеси веществ выбра­на неподвижная фаза, которая их удерживает, то дальнейшая работа по разработке методики анализа заключается в выборе такого растворителя, который обеспечил бы в идеальном случае различные для всех компонентов, но приемлемо не очень боль­шие k'. Этого добиваются, меняя элюирующую силу раствори­теля.

В случае адсорбционной хроматографии на силикагеле или оксиде алюминия, как правило, силу двухкомпонентного рас­творителя (например, гексана с добавкой изопропанола) увели­чивают, увеличивая в нем содержание полярного компонента (изопропанола), или же уменьшают, уменьшая содержание изо­пропанола. Если содержащие полярного компонента становится слишком малым (менее 0,1%), следует заменить его более сла­бым по элюирующей силе. Так же поступают, заменяя на дру­гие либо полярную, либо неполярную составляющую и в том^ случае, если данная система не обеспечивает желаемой селек­тивности по отношению к интересующим компонентам смеси. При подборе систем растворителей принимают во внимание как растворимости компонентов смеси, так и элюотропнЬе ряды растворителей, составленные разными авторами.

Примерно так же подбирают силу растворителя в случае ис­пользования привитых полярных фаз (нитрил, амино, диол, нитро и др.), учитывая возможные химические реакции и ис­ключая опасные для фазы растворители (например и кетоны для аминофазы).

В случае обращенно-фазной хроматографии силу раствори­теля увеличивают, повышая содержание в элюенте органичес­кой составляющей (метанола, ацетонитрила или ТГФ) и умень­шают, добавляя больше воды. Если не удается добиться же­лаемой селективности, используют другую органическую состав­ляющую либо пытаются изменить ее с помощью разных доба­вок (кислот, ион-парных реагентов и др.).

При разделениях методом ионообменной хроматографии си­лу растворителя меняют, увеличивая или уменьшая концентра­цию буферного раствора или меняя рН, в некоторых случаях используют модификацию органическими веществами.

Однако, особенно в случае сложных природных и биологи­ческих смесей, зачастую не удается подобрать силу раствори­теля таким образом, чтобы все компоненты пробы элюирова-лись за приемлемый срок. Тогда приходится прибегать к гра­диентному элюированию, т. е. использовать растворитель, элюи-рующая сила которого в процессе анализа изменяется так, что она постоянно увеличивается по заранее заданной программе. Таким приемом удается добиться элюирования всех компонен­тов сложных смесей за относительно короткий промежуток вре­мени и их разделения на компоненты в виде узких пиков.

1.3. РАЗМЕР ЧАСТИЦ СОРБЕНТА, ПРОНИЦАЕМОСТЬ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ

Рассматривая размывание в колонке, мы указывали, что эффективность колонки (ВЭТТ) зависит от размера частиц •сорбента. В большой степени бурное развитие ВЭЖХ за послед­ние 10—12 лет было обусловлено, во-первых, разработкой спо­собов получения сорбентов с размером частиц от 3 до 10 мкм и с узким фракционным составом, обеспечивающих высокую эффективность при хорошей проницаемости, во-вторых, ^разра­боткой способов заполнения этими сорбентами колонок и, в-третьих, разработкой и серийным выпуском жидкостных хро­матографов, имеющих рассчитанные на высокие давления насо­сы, инжекторы и детекторы с кюветами малого объема, способ­ные регистрировать пики малого объема.

Для хорошо упакованных суспензионным способом колонок приведенная высота, эквивалентная теоретической тарелке (ПВЭТТ), может составлять 2 независимо от того, использо­вали ли для упаковки частицы с размером 3, 5, 10 или 20 мкм. В этом случае мы получим соответственно колонки (при стан­дартной длине их 250 мм) эффективностью 41670, 25000, 12500 и 6250 т.т. Кажется естественным выбрать наиболее эффектив­ную колонку, заполненную частицами размером 3 мкм. Однако за эту эффективность придется заплатить использованием при работе очень высокого давления и относительно невысокой скоростью разделения, ^{так как} имеющийся насос, скорее всего, будет и^пособен* прокачивать через такую колонку растворитель с высокой объемной скоростью. Здесь мы как раз и сталкива­емся с вопросом о связи размера частиц сорбента, эффективно­сти и проницаемости колонок.

Если выразить отсюда фактор сопротивления колонки-—безраз­мерную величину, получим следующее уравнение:

Фактор сопротивления для колонок, упакованных микрочасти­цами одного вида по одному и тому же способу, меняется не­значительно и составляет следующие значения:

Вид    частиц      »....•     Неправильная               Сферическая

форма                             форма

Сухая   упаковка     .     .     .     .     .        1000—2000                     800—1200

Суспензионная  упаковка   .     .     .           700—1500                     500—700

Давление на входе в колонку пропорционально линейной скорости потока, фактору сопротивления колонки, вязкости рас­творителя и длине колонки и обратно пропорционально квадра­ту диаметра частиц.

Применив эту зависимость для вышеописанных колонок с частицами диаметром 3, 5, 10 и 20 мкм и предположив посто­янными линейную скорость потока, фактор сопротивления ко­лонки и вязкость растворителя, получим для колонок равной длины соотношение давлений на входе 44:16:4:1. Таким об­разом, если для обращенно-фазного сорбента с размером час­тиц 10 мкм при использовании систем растворителей метанол — . вода (70:30) обычно на стандартной колонке при расходе рас­творителя 1 мл/мин давление на входе в колонку составляет 5 МПа, то для частиц 5 мкм — 20 МПа и для 3 мкм — 55 МПа. При использовании силикагеля и менее вязкой системы рас­творителей гексан — изопропанол (100:2) значения будут су­щественно ниже: соответственно 1, 4 и 11 МПа. Если в случае обращенно-фазного сорбента применение частиц размером Змкм очень проблематично, а 5 мкм возможно, но не на всех при­борах, то для нормально-фазного проблем с давлением не воз­никает. Следует отметить, что для современной скоростной ВЭЖХ характерно использование более высокого расхода рас­творителей, чем в вышерассмотренном примере, поэтому тре­бования к давлению возрастают еще больше.

Однако в тех случаях, когда для разделения требуется оп­ределенное число теоретических тарелок и желательно осуще­ствить скоростной анализ, картина несколько меняется. Так как длины колонок с сорбентами зернением 3, 5, 10 мкм при равной эффективности будут соответственно 7,5; 12,5 и 25 см, то и соотношение давлений на входе в колонки изменится доЗ,3:2:1. Соответственно продолжительность анализа на таких колонках равной эффективности будет соотноситься как 0,3:0,5:1, т. е. при переходе от 10 к 5 и 3 мкм продолжительность анализа со­кратится в 2 и 3,3 раза. За это ускорение анализа приходится расплачиваться пропорционально более высоким давлением на входе в колонку.

Приведенные данные справедливы для тех случаев, когда сорбенты разного зернения имеют одинаковые кривые распреде­ления частиц по размеру, колонки набиты одинаковым спосо­бом и имеют одинаковый фактор сопротивления колонки. Сле­дует иметь в виду, что трудность получения узких фракций сор­бента возрастает по мере уменьшения размера частиц и что . фракции от разных производителей имеют разный фракционный состав. Поэтому фактор сопротивления колонок будет меняться в зависимости от зернения, типа сорбента, способа упаковки колонок и др.

КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ ВЭЖХ ПО МЕХАНИЗМУ РАЗДЕЛЕНИЯ

Большинство проводимых методом ВЭЖХ разделений основа­но на смешанном механизме взаимодействия веществ с сорбен­том, обеспечивающим большее или меньшее удерживание ком­понентов в колонке. Механизмы разделения в более или менее чистом виде на практике встречаются достаточно редко, напри­мер, адсорбционный при использовании абсолютно безводного силикагеля и безводного гексана для разделения ароматических углеводородов.

При смешанном механизме удерживания для веществ раз­ного строения и молекулярной массы можно оценить вклад в удерживание адсорбционного, распределительного, эксклюзион-ного и других механизмов. Однако для лучшего понимания и представления о механизмах разделения в ВЭЖХ целесообраз­но рассматривать разделения с преобладанием того или иного механизма как относящиеся к определенному виду хроматогра­фии, например, к ионообменной хроматографии.

2.1.1 АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Разделение методом адсорбционной хроматографии осущест­вляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, такими, как силикагель или оксид алюминия, имеющими на по­верхности активные центры. Различие в способности к взаимо­действию с адсорбционными центрами разных молекул пробы приводит к их разделению на зоны в процессе движения с подвижной фазой по колонке. Достигаемое при этом разделение зон компонентов зависит от взаимодействия как с растворите­лем, так и с адсорбентом.

В основе сорбции на поверхности адсорбента, имеющего гид-роксильные группы, лежит специфическое взаимодействие меж­ду полярной поверхностью адсорбента и полярными (или спо­собным поляризоваться) группами или участками молекул. К таким взаимодействиям относят диполь-дипольное взаимодей­ствие между постоянными или индуцированными диполями, об­разование водородной связи вплоть до образования я-комплек-сов или комплексов с переносом заряда. Возможным и доста­точно частым в практической работе является проявление хемо-сорбции, которая может привести к значительному повышению времени удерживания, резкому снижению эффективности, появ­лению продуктов разложения или необратимой сорбции веще­ства.

Изотермы адсорбции веществ имеют линейную, выпуклую или вогнутую форму. При линейной изотерме адсорбции пик ве­щества симметричен и время удерживания не зависит от разме­ра пробы. Чаще всего изотермы адсорбции веществ нелинейны и имеют выпуклую'форму, что приводит к некоторой асиммет­рии пика с образованием хвоста.

Наибольшее применение в ВЭЖХ находят адсорбенты из силикагеля с разным объемом пор, поверхностью, диаметром пор. Значительно реже используют оксид алюминия и крайне редко-—другие адсорбенты, широко применяющиеся в класси­ческой колоночной и тонкослойной хроматографии. Основная причина этого — недостаточная механическая прочность боль­шинства прочих адсорбентов, не позволяющая упаковывать их я использовать при повышенных давлениях,    характерных для вэжх.

Полярные группы, обусловливающие адсорбцию и находя­щиеся на поверхности силикагеля и оксида алюминия, по свой­ствам близки. Поэтому обычно порядок элюирования смесей ве­ществ и элюотропный ряд растворителей для них одинаковы. Однако различие химического строения силикагеля и оксида алюминия иногда приводит к появлению различий в селектив­ности-— тогда предпочтение отдают тому или другому адсор­бенту, более подходящему для данной конкретной задачи. На­пример, оксид алюминия обеспечивает большую избиратель­ность при разделении некоторых многоядерных ароматических углеводородов.

Предпочтение, отдаваемое обычно силикагелю по сравнению с оксидом алюминия, объясняется более широким выбором си-ликагелей по пористости, поверхности и диаметру пор, а также значительно более высокой каталитической активностью оксида алюминия, нередко приводящей к искажению результатов ана­лиза вследствие разложения компонентов пробы либо их необ­ратимой хемосорбции.

2.1.2 Недостатки адсорбционной хроматографии, ограничивающие ее использование

Популярность адсорбционной хроматографии по мере разви­тия метода ВЭЖХ постепенно падала, она все больше заменя­лась и продолжает заменяться на другие варианты, такие, как обращенно-фазная и нормально-фазная ВЭЖХ на сорбентах с-привитой фазой. Какие же недостатки адсорбционной хромато­графии привели к этому?

Прежде всего, это большая длительность процессов уравно­вешивания адсорбентов с растворителями, содержащими воду в микроколичествах, трудность приготовления таких раствори­телей с определенной и воспроизводимой влажностью. Из это­го следуют плохая воспроизводимость параметров удерживания, разрешения, селективности. По этой же причине невозможно использовать градиентное элюирование — возврат к исходному состоянию настолько длителен, что значительно превосходит выигрыш времени за счет использования градиента.

Существенные недостатки адсорбентов, особенно оксида алюминия, связанные с частыми случаями перегруппировок чувствительных к катализу соединений, их разложения, необра­тимой сорбции, также общеизвестны и неоднократно отмеча-лить в литературе. Необратимо сорбирующиеся вещества, на­капливаясь на начальном участке колонки, меняют природу сорбента, могут привести к повышению сопротивления колонки или даже к полной ее забивке. Последний недостаток может быть устранен путем использования предколонки, которая по-мере повышения сопротивления и забивки заменяется на новую* или перезаполняется новым сорбентом. Однако необратимая сорбция, имеющая место и в этом случае, приводит к получе­нию хроматограммы, на которой полностью или частично от­сутствуют чувствительные к сорбции или каталитическому раз­ложению компоненты пробы.

2.2. РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Распределительная хроматография — это вариант ВЭЖХ, в котором разделение смеси на компоненты осуществляется за счет различия их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися фазами: растворителем (подвижная фа­за) и фазой на сорбенте (неподвижная фаза). Исторически пер­выми были сорбенты такого типа, которые получали нанесением жидких фаз (оксидипропионитрила, парафинового масла и др.) на пористые носители, аналогично тому, как готовили и готовят сорбенты для газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Однако сразу же обнаружились и недостатки таких сорбентов, основ­ным из которых было относительно быстрое смывание фазы с носителя. За счет этого количество фазы в колонке постепенно уменьшалось, времена удерживания также уменьшались, на на­чальном участке колонки появлялись не покрытые фазой центры адсорбции, вызывавшие образование хвостов пиков. С этим недостатком боролись, насыщая растворитель нанесен­ной фазой еще до его попадания в колонку. Унос также умень­шался, когда использовали более вязкие и менее растворимые полимерные фазы, однако в этом случае из-за затруднения диффузии из толстых полимерных пленок эффективность колонок заметно снижалась.

Логическим оказалось привить химическими связями жид­кую фазу к носителю таким образом, чтобы унос ее стал физи­чески невозможен, т. е. превратить носитель и фазу в одно це­лое— в так называемый привито-фазный сорбент.

Первые привито-фазные сорбенты были получены замеще­нием силанольных групп, находящихся на поверхности силика-геля, в результате их реакции со спиртами или аминами. При этом отщеплялась вода, а остатки спиртов или аминов химиче­ски прививались к поверхности силикагеля. Эти так называе­мые «щеточные» сорбенты показали, что с их использованием действительно удается получить высокую эффективность коло­нок при отсутствии уноса фазы из колонки и стабильности вре­мен удерживания. Однако устойчивость таких сорбентов в ус­ловиях применения водных растворителей и даже слабооснов­ных или кислых сред была низкой: фаза отщеплялась химиче­ски за счет реакции гидролиза.

В дальнейшем усилия исследователей были направлены на поиск реагентов, прививка которых протекала бы достаточно быстро и полно, а образовавшиеся связи были максимально устойчивыми. Такими реагентами стали алкилхлорсиланы и их производные, позволившие по сходной технологии получать привито-фазные сорбенты разного типа и с разными как по­лярными, так   и неполярными группами на поверхности.

Успешное применение сорбентов последнего типа для ВЭЖХ способствовало росту их производства самыми разными произ­водителями. Каждая фирма производила такие сорбенты, как правило, на основе своего вида силикагеля и по своей техноло­гии, которая обычно составляет «ноу-хау» производства. В ре­зультате большое количество сорбентов, называющихся хими­чески совершенно одинаково (например, силикагель с привитым октадецилсиланом), имеют очень сильно различающиеся хро-матографические характеристики. Это связано с тем, что сили­кагель может иметь поры шире или уже, разную поверхность, пористость, его поверхность до прививки может гидроксилиро-ваться или нет, прививаться могут моно-, ди- или трихлорсила-ны, условия прививки могут давать мономерный, полимерный или смешанный слой фазы, используются разные методы удале­ния остатков реагентов, может использоваться или не исполь­зоваться дополнительная дезактивация силанольных и других активных групп.

Сложность технологии прививки реагентов и подготовки сырья и материалов, ее многостадийность приводят к тому, что даже полученные по одной технологии ка одной фирме-произво­дителе партии сорбентов могут иметь несколько разные хрома-тографические характеристики. Особенно это касается тех слу­чаев, когда такие сорбенты используют для анализа многоком­понентных смесей, содержащих вещества,    заметно    различаю щиеся по количеству и положению функциональных групп, по* роду функциональности [9, 10].

Учитывая вышеуказанное, всегда следует стремиться к то­му* чтобы при использовании описанной в литературе методи­ки анализа применять именно тот самый сорбент и те же усло­вия работы. В этом случае вероятность того, что работу не удастся воспроизвести, является минимальной. Если же такой возможности нет, а берется сорбент другой фирмы с аналогич­ной привитой фазой, нужно быть готовым к тому, что потребу­ется длительная работа по переделке методики. При этом су­ществует вероятность (и ее следует учитывать), что на этом сорбенте даже и после длительной разработки можно не до­биться требуемого разделения. Наличие в литературе многих описанных методик разделения на давно производимых старых сорбентах стимулирует их дальнейшее производство и примене­ние по этой причине. Однако в тех случаях, когда приходится переходить к разработке оригинальных методик, особенно при­менительно к веществам, склонным к разложению, хемосорб-ции, перегруппировкам, целесообразно начинать работу на сор­бентах, разработанных в последнее время и выпускаемых по> новым, улучшенным вариантам технологии. Новые сорбенты имеют более однородный фракционный состав, более однород­ное и полное покрытие поверхности привитой фазой, более со­вершенные окончательные стадии обработки сорбентов.

2.3. ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

В ионообменной хроматографии разделение компонентов смеси достигается за счет обратимого взаимодействия ионизи­рующихся веществ с ионными группами сорбента. Сохранение электронейтральности сорбента обеспечивается наличием спо­собных к ионному обмену противоионов, расположенных в не­посредственной близости к поверхности. Ион введенного образ­ца, взаимодействуя с фиксированным зарядом сорбента, обме­нивается с противоионом. Вещества, имеющие разное сродство ' к фиксированным зарядам, разделяются на анионитах или на катеонитах. Аниониты имеют на поверхности положительно за­ряженные группы и сорбируют из подвижной фазы анионы. Ка-тиониты соответственно содержат группы с -отрицательным за­рядом, взаимодействующие с катионами.

 В качестве подвижной фазы используют водные растворы ' солей кислот, оснований и растворители типа жидкого аммиа­ка, т. е. системы растворителей, имеющих высокое значение ди­электрической проницаемости е и большую тенденцию ионизи­ровать соединения. Обычно работают с буферными растворами, позволяющими регулировать значение рН.

При хроматографичеоком разделении ионы анализируемого вещества конкурируют с ионами, содержащимися в элюенте, стремясь вступить во взаимодействие с противоположно заря­женными группами сорбента. Отсюда следует, что ионообмен­ную хроматографию можно применять для разделения любых соединений, которые могут быть каким-либо образом  ионизированы. Можно провести анализ даже нейтральных молекул Сахаров в виде их комплексов с борат-ионом:

Сахар + ВО₃²- = Сахар -ВО₃²-.

Ионообменная хроматография незаменима при разделении вы­сокополярных веществ, которые без перевода в производные не могут быть проанализированы методом ГЖХ. К таким со­единениям относятся аминокислоты, пептиды, сахара.

Ионообменную хроматографию широко применяют в медици­не, биологии, биохимии [11 —15], для контроля окружающей среды, при анализе содержания лекарств и их метаболитов в крови и моче, ядохимикатов в пищевом сырье, а также для раз­деления неорганических соединений, в том числе радиоизотопов, лантаноидов, актиноидов и др. Анализ биополимеров (белков, нуклеиновых кислот и др.), на который обычно затрачивали часы или дни, с помощью ионообменной хроматографии прово­дят за 20—40 мин с лучшим разделением. Применение ионооб­менной хроматографии в биологии позволило наблюдать за об­разцами непосредственно в биосредах, уменьшая возможность перегруппировки или изомеризации, что может привести к не­правильной интерпретации конечного результата. Интересно ис­пользование данного метода для контроля изменений, происхо­дящих с биологическими жидкостями [11]. Применение пори­стых слабых анионообменников на силикагелевой основе позво­лило разделить пептиды [12].    V

Механизм ионного обмена можно представить в виде сле­дующих уравнений:

для анионного обмена

X- + R+Y- _ч—>