Тонкослойная хроматография (ТСХ, TLC) - один из наиболее используемых методов хроматографического анализа, но наименее популяризируемый.

Несмотря на существовавшие до недавнего времени существенные недостатки, она широко используется для качественного анализа смесей, в основном, за счет дешевизны и скорости получения результатов.

Физико-химические основы тонкослойной хроматографии.

Основой тонкослойной хроматографии является адсорбционный метод, хотя также встречается метод распределительной хроматографии.

Адсорбционный метод основан на различии степени сорбции-десорбции разделяемых компонентов на неподвижной фазе. Адсорбция осуществляется за счет ван-дер-вальсовских сил, являющейся основой физической адсорбции, полимолекулярной (образование нескольких слоев адсорбата на поверхности адсорбента) и хемосорбцией (химического взаимодействия адсорбента и адсорбата).

Для эффективных процессов сорбции-десорбции необходима большая площадь, что предъявляет определенные требования к адсорбенту. При большой поверхности разделения фаз происходит быстрое установление равновесия между фазами компонентов смеси и эффективное разделение.

Еще одним видом используемом в методе тонкослойной хроматографии является распределительная жидкостная хроматография.

В распределительной хроматографии обе фазы - подвижная и неподвижная - жидкости, не смешивающиеся друг с другом. Разделение веществ основано на различии в их коэффициентах распределения между этими фазами.

Впервые метод тонкослойной хроматографии заявил о себе как "Бумажная тонкослойная хроматография", которая основывалась на распределительном методе разделения компонентов.

Распределительная хроматография на бумаге.

В связи с тем, что используемая в этом методе хроматографическая бумага (специальные сорта фильтровальной бумаги) содержат в порах воду (20-22%), в качестве другой фазы используются органические растворители.

Использование хроматографии на бумаге имеет ряд существенных недостатков: зависимость процесса разделения от состава и свойств бумаги, изменение содержания воды в порах бумаги при изменении условий хранения, очень низкая скорость хроматографирования (до нескольких суток), низкая воспроизводимость результатов. Эти недостатки серьезно влияют на распространение хроматографии на бумаге как хроматографического метода.

Поэтому можно считать закономерным появление хроматографии в тонком слое сорбента - тонкослойной хроматографии.

Тонкослойная хроматография.

В этом методе хроматографирование веществ происходит в тонком слое сорбента, нанесенного на твердую плоскую подложку. Разделение в этом методе в основном происходит на основе сорбции-десорбции.

Использование различных сорбентов, позволило значительно расширить и улучшить этот метод.

В начале появления метода пластины приходилось изготавливать самостоятельно. Но на сегодняшний день в основном используются пластины заводского изготовления, имеющие достаточно широкий ассортимент как по размерам и носителям, так и по подложкам.

Современная хроматографическая пластинка представляет собой основу из стекла, алюминия или полимера (например политерефталат). В связи с тем, что стеклянная основа становится менее популярной (часто бьется, нельзя разделить пластинку на несколько частей не повредив слой сорбента, тяжелая по весу), наибольшее распространение получили пластины, в качестве основ которых используют алюминиевую фольгу или полимеры.

Для закрепления сорбента применяют гипс, крахмал, силиказоль и др., которые удерживают зерна сорбента на подложке. Толщина слоя может быть различна (100 и более мкм), но самый важный критерий - слой должен быть равномерный по толщине в любом месте хроматографической пластинки.

В тонкослойной хроматографии, в качестве подвижной фазы используют либо чистые вещества (этилацетат, бензол и т.п.), либо смеси веществ (системы) в определенном соотношении.

Подбор подвижной фазы (системы) проводится по следующим правилам:

Выбирают такую систему, в которой разделяемые компоненты имеют небольшую растворимость (если растворимость вещества высокая, то вещества будут перемещаться с фронтом, при низкой растворимости - оставаться на старте). При распределительной хроматографии или при использовании обращенных фаз, растворимость веществ должна быть выше в подвижной фазе, чем в неподвижной фазе.

Состав системы должен быть постоянным и легко воспроизводимым.

Растворитель или компоненты системы не должны быть ядовитыми или дефицитными.

Система должна полностью разделять вещества близкого строения, причем различия в Rf должно быть не менее 0,05.

Система не должна вызывать химические изменения разделяемых компонентов.

В выбранной системе анализируемые вещества должны иметь различные значения Rf и распределяться по всей длине хроматограммы. Желательно, чтобы значения Rf лежало в пределах 0,05-0,85.

При выборе системы также необходимо учитывать природу разделяемых веществ. Так, при хроматографировании веществ, имеющих основные свойства система не должна обладать кислотными свойствами и наоборот.

Тонкослойная хроматография имеет несколько способов, связанных, в основном, с видом движения растворителей.

Восходящая тонкослойная хроматография

Нисходящая тонкослойная хроматография

Горизонтальная тонкослойная хроматография

Радиальная тонкослойная хроматография.

Восходящая тонкослойная хроматография

Этот вид хроматографии наиболее распространен и основан на том, что фронт хроматографической системы поднимается по пластинке под действием капиллярных сил, т.е. фронт хроматографической системы движется снизу-вверх. Для этого метода используется наиболее простое оборудование, так как в качестве хроматографической камеры можно использовать любую емкость с плоским дном и плотно закрывающейся крышкой, в которую свободно помещается хроматографическая пластинка.

Метод восходящей тонкослойной хроматографии имеет ряд своих недостатков. Например, скорость поднятия фронта по пластинке происходит неравномерно, т.е. в нижней части она самая высокая, а по мере поднятия фронта уменьшается. Это связано с тем, что в верхней части камеры насыщенность парами растворителя меньше, поэтому растворитель с хроматографической пластинки испаряется интенсивнее, следовательно уменьшается его концентрация и скорость движения замедляется. Для устранения этого недостатка по стенкам хроматографической камеры прикрепляют полоски фильтровальной бумаги, по которым поднимающаяся хроматографическая система насыщает парами камеру по всему объему.

Некоторые хроматографические камеры имеют на дне разделение на две ванночки. Это усовершенствование позволяет не только уменьшить расход хроматографической системы (для получения необходимой высоты хроматогратографической системы требуется меньший объем) но и использовать дополнительную кювету для растворителя, увеличивающего давления насыщенных паров в камере.

Недостатком также можно считать необходимость следить за фронтом растворителя, так как возможно "убегание" лини фронта растворителя до верхнего края. В таком случае определить действительное значение Rf уже не представляется возможным.

Нисходящая тонкослойная хроматография

Этот метод хроматографии основан на том, что фронт хроматографической системы опускается по пластинке в основном под действием сил тяжести , т.е. фронт подвижной фазы движется сверху вниз.

Для этого метода в верхней части хроматографической камеры крепится кювета с хроматографической системой из которой с помощью фитиля на хроматографическую пластинку поступает растворитель, который стекает и происходит хроматографирование исследуемого образца.

К недостаткам этого метода можно отнести усложнение оборудования. Этот метод используется в основном в бумажной хроматографии.

Горизонтальная тонкослойная хроматография

Этот метод наиболее сложен в аппаратурном оформлении но наиболее удобен. Так, в хроматографической камере пластинка размещается горизонтально и подача системы происходит на один край пластинки с помощью фитиля. Фронт растворителя движется в противоположную сторону.

Есть еще один прием, позволяющий предельно упростить камеру. Для этого хроматографическую пластинку на алюминиевой основе слегка изгибают и помещают в камеру. В данном случае система будет поступать с двух сторон одновременно. Для этой цели подходят только пластины с алюминиевой подложкой, так как пластиковая и стеклянная основа "несгибаема", т.е. не сохраняет форму.

К достоинствам этого метода можно отнести то, что в горизонтальной кювете насыщение парами системы происходит гораздо быстрее, скорость движения фронта постоянная. А при хроматографировании с двух сторон, фронт не "убегает"

Радиальная тонкослойная хроматография.

Радиальная тонкослойная хроматография заключается в том, что в центр пластинки наносится исследуемое вещество и туда же подается система, которая движется от центра к краю пластинки.

Для тонкослойной хроматографии существует несколько видов качественного анализа (идентификации) разделенных веществ:

Визуальные методы и определение Rf разделенных веществ.

Цветные реакции.

Сравнение со свидетелями.

Физико-химические методы идентификации.

Рассмотрим подробнее каждый вид качественного анализа в тонкослойной хроматографии.

Физические методы

Визуальные методы используются в основном, для определения местоположения пятен разделенных веществ на хроматографической пластинке. Для этого пластинку рассматривают как в видимом свете, так и используя ультрафиолетовый свет (в основном свет с длиной волны 366 и 254 нм)

Это первый этап идентификации, на котором определяется качество подобранных условий и полученных результатов хроматографирования.

Так, определив качество хроматографирования (отсутствие "хвостов" разделяемых веществ или перекрытие их пятен, правильную форму и размеры, отсутствие слияния хроматографических дорожек и т.д.) и признании пригодным проведенного разделения для дальнейшего исследования, определяют Rf выявленных пятен.

Значение Rf.

Одним из основных показателей в ТСХ является показатель Rf. Этот параметр является аналогией времени удерживания и зависит как от свойств разделяемых веществ, состава подвижной фазы и сорбента, так и от физических параметров.

Определение значения Rf проводят как отношение расстояния прошедшего веществом к расстоянию, прошедшего фронтом растворителя

Rf = L/L0

Значение Rf - величина безразмерная и имеет значение от 0 до 1. Однако в литературе нередко встречается такие показатели как hRf, Rf×100, которые являются тем же Rf, но умноженными на 100, для того, чтобы не оперировать десятичными значениями.

На значение Rf не влияет расстояние пройденное фронтом растворителя, однако во многих методиках описывается прохождение фронта на расстояние 10 см. Это используется только для облечения расчетов Rf.

На практике, в начале определяют расстояние прошедшее фронтом растворителя: от линии старта (а не от края пластинки) до места, где находился фронт в момент окончания хроматографирования. Затем определяют расстояние от линии старта до пятна разделенного вещества. Во тут и оказывает влияние размер пятна! Ведь если пятно имеет круглую форму и небольшой размер, то полученное Rf имеет четкое значение. А если полученное пятно имеет большой размер или неправильную форму, то при определении Rf такого пятна, ошибка может достигнуть 0,1!

В случае распределительной хроматографии коэффициент распределения вещества и его Rf связано соотношением:

где Sп и Sн -площади поперечных сечений подвижной и неподвижной фазы.

Как мы видим, Коэффициент распределения, при постоянном отношении Sп/Sн есть величина пропорционально зависящая от Rf , и может быть определена через него.

Цветные реакции.

Цветные реакции в тонкослойной хроматографии используются чрезвычайно широко. Они служат не только для определения местоположения разделенных компонентов (обработка серной кислотой, парами йода), но и определения как класса веществ, так и идентификации (при наличии индивидуальных реакций).

Мы не будем здесь рассматривать это огромное разнообразие цветных качественных реакций (подробнее здесь), скажем лишь, что при совпадении всех качественных реакций и совпадении полученных значений Rf вещества в трех различных системах с литературными данными, вещество идентифицировано.

Сравнение со свидетелем.

При проведении исследований веществ с предполагаемым составом, применяют метод хроматографирования со свидетелем - известным веществом. Этот метод используется кода трудно выдержать условия хроматографирования, нет литературных данных Rf для данной системы или адсорбента, использование градиентного метода и т.д. Да и при проведении цветных реакций можно сравнить не только цвета, но и оттенки исследуемых веществ и свидетелей, что также немаловажно.

С другой стороны этот метод требует дополнительных расходов на свидетели.

Физико-химические методы идентификации.

Прелесть тонкослойной хроматографии состоит в том, что после хроматографирования каждое разделенное вещество можно в дальнейшем исследовать другими методами гораздо проще. И дело тут не в том, что другие методы хроматографирования не могут этого. Дело тут в сложности выделения и материальных затратах на специальные приспособления, у которых только одна задача - выделить вещество.

В тонкослойной хроматографии есть только одна трудность - снять слой сорбента и вымыть из него вещество. В дальнейшем можно его исследовать с использованием ИК и УФ-спектрометрии, рентгено-структурными методами, ЯМР и т.д.

Поэтому, используя тонкослойную хроматографию для разделения смесей, можно не только исследовать каждый компонент различными методами, но и наработать небольшое количество, в том числе и для свидетелей.

Метод дифференциальной фотометрии.

Фотометрирование интенсивно окрашенных растворов успешно осуществляется дифференциальной фотометрии. Если в обычной фотометрии сравнивается интенсивность света Ix, прошедшего через анализируемый раствор неизвестной концентрации, с интенсивностью света I0 , прошедшего через растворитель, то в дифференциальной фотометрии луч света проходит не через растворитель, а через окрашенный раствор известной концентрации – так называемый раствор сравнения сср. Его интенсивность обозначим как Iср. Отношение интенсивностей Ix/Iср называется условныым коэффициентом пропускания T`x . И переходя от коэффициентов к оптическим плотностям, получим:

A`x = Ax – Aср

А`х = e lcx - Аср

где А`x – относительная оптическая плотность.

Таким образом, дифференциальная фотометрия существенно расширяет концентраций, доступную для точных фотометрических измерений. Кроме того, точность некоторых методик диференциальной фотометрии превышает точность методик обычной фотометрии. Кстати, обычную фотометрию при Тср = 1 мы можем рассматривать, как частный случай дифференциальной.

Метод количественного анализа по ИК-спектрам.

Анализ по ИК-спектрам также основан на применении закона Бугера-Ламберта-Бера.. Чаще всего здесь используется метод градууировочного графика, т.к. метод молярного коэффициента здесь слабо применим из-за рассеяния, сплошного поглощения и других эффектов ИК-излучения. Многие сложности ИК-спектрометрии успешно преодолеваются с помошью метода базовой линии, к оторый получил достаточно большо распостранение в практике.

Практическое применение

Фотометрические и спектрометрические методы анализа применяются для определения многих (более 50) элементов периодической системы, главным образом металлов, анализируются руды, минералы, объекты окружающей среды, продукты переработки обогатительных и гидрометаллургических предприятий. Эффективно эти методы используется в металлургической, электронной областях промышленности, в медицине, биологии, криминалистике и т.д. Большое значение они имеют в аналитиченском контроле окружающей среды и решении экологических проблем. Значительно расширились области практического применения методов абсорбционной спектроскопии благодаря более широкому использованию инфракрасной области спектра и приборов на базе ЭВМ. Это позволило разработать методы анализа сложных многокомпонентных систем без их химического разделения. Простые, быстрые и точные методы анализа имеют огромное значение для исследования различных реакций, установления состава и исследования различных химических соединений. Успехи химии координационных соединений, достижения микроэлектроники, приборостроения дают все основания ожидать дальнейшего повышения точности и чувствительности этих методов.

Электрохимические методы анализа

Электрохимические методы анализа - это совокупность методов качественного и количественного анализа, основанных на электрохимических явлениях, происходящих в исследуемой среде или на границе раздела фаз и связанных с изменением структуры, химического состава или концентрации анализируемого вещества. Электрохимические методы анализа делятся на пять основных групп: потенциометрию, вольтамперометрию, кулонометрию, кондуктометрию и диэлектрометрию.

1. Потенциометрия объединяет методы, основанные на измерении эдс обратимых электрохимических цепей, когда потенциал рабочего электрода близок к равновесному значению. Потенциометрия включает редоксметрию, ионометрию и потенциометрическое титрование.

2. Вольтамперометрия основана на исследовании зависимости тока поляризации от напряжения, прикладываемого к электрохимической ячейке, когда потенциал рабочего электрода значительно отличается от равновесного значения (см. Поляризация электрохимическая). По разнообразию методов вольтамперометрия - самая многочисленная группа из всех электрохимических методов анализа, широко используемая для определения веществ в растворах и расплавах (например, полярография, амперометрия).

3. Кулонометрия объединяет методы анализа, основанные на измерении количества вещества, выделяющегося на электроде в процессе электрохимической реакции в соответствии с Фарадея законами. При кулонометрии потенциал рабочего электрода отличается от равновесного значения. Различают потенциостатическую и гальваностатическую кулонометрию, причём последняя включает прямой и инверсионный методы, электроанализ и кулонометрическое титрование.

4. К кондуктометрии относятся методы, в которых измеряют электропроводность электролитов (водных и неводных растворов, коллоидных систем, расплавов, твёрдых веществ). Кондуктометрический анализ основан на изменении концентрации вещества или химического состава среды в межэлектродном пространстве; он не связан с потенциалом электрода, который обычно близок к равновесному значению. Кондуктометрия включает прямые методы анализа (используемые, например, в солемерах) и косвенные (например, в газовом анализе) с применением постоянного или переменного тока (низкой и высокой частоты), а также хронокондуктометрию, низкочастотное и высокочастотное титрование.

5. Диэлектрометрия объединяет методы анализа, основанные на измерении диэлектрической проницаемости вещества, обусловленной ориентацией в электрическом поле частиц (молекул, ионов), обладающих дипольным моментом. Методы диэлектрометрии применяют для контроля чистоты диэлектриков, например для определения малых количеств влаги. Диэлектрометрическое титрование используют для анализа растворов.

Все электрохимические методы основаны на выборе и применении системы электродов, которые определяют селективность, воспроизводимость, точность анализа. Система электродов состоит из одного комбинированного, двух или трех электродов. Обязательным является наличие двух электродов – индикаторного (измерительного) и стандартного (электрод сравнения). Индикаторный электрод должен быстро и обратимо реагировать на изменение концентрации определяемого иона. Стандартный электрод имеет постоянный, не изменяющийся в ходе определения, потенциал. В зависимости от решаемой задачи индикаторный и стандартный электроды могут быть различными.

Для точных измерений применяют третий – термочувствительный электрод. Электроды нового поколения содержат внутри одного корпуса сразу два электрода, что значительно увеличивает компактность и упрощает аппаратуру методов.

Для осуществления той или иной аналитической задачи электрохимическими методами наиболее важной является стадия выбора системы индикаторного и стандартного электродов.