2ОЦЕНКА ИММУННОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА

   До исследования собственных компонентов иммунной системы сле-

дует оценить фагоцитарную и комплементарную активность.

                              АГ

                               │

                         Фагоцитоз (АПК)

                               │

                  HLA 4II 0        │      HLA 4I+II

           ┌──────Тх/Тs──────  3ИО 0 ─────Тх/Тs───────┐

          АТ                                      Тк

       3Гуморальный                             Клеточный

       3иммунитет                               иммунитет

           │                                      │

    4┌────── 0ИК 4──────┐ 0                         клетка-мишень (КМ)

   │         Активация комплемента                │

   │         (ИК-С1q, ИК-С3в)                   Лизис

   │              │                               │

Фагоцитоз    Фагоцитоз через                  Фагоцитоз

через FcR    комплементарные                  мертвой

             рецепторы                        клетки

\__________________________________________________________/

       _При фагоцитарной недостаточности . преципитаты ИК-ов,

    деструктированные клетки активируют свертывающую систему

     и при истощении (общем или локальном) антикоагулянтов

        развивается тромбофилия ( _склонность к тромбозам .)

   Т.о. основной  фактор,  определяющий элиминацию из организма

чужеродных и собственных неполноценных субстанций  -  фагоцитоз

(полноценный завершенный эндоцитоз).  Поэтому  оценку  иммунного

статуса следует  начинать с лейкоцитарной формулы,  общего коли-

чества лейкоцитов,   _оценки фагоцитарной активности . (степени  за-

вершенности по НТС-тесту) и как отражение гуморального иммуните-

та (степень растворения ПИК и утилизации из кровотока ИК) -  ак-

тивность  _системы  комплемента ..  Стимулировать  иммунную  систему

(использовать иммуностимуляторы) при недостаточности по  системе

комплемента нельзя,  так как лишние ИК (при избытке АТ) не будут

элиминироваться из кровотока.  [Физиологический механизм  данной

регуляции -  фрагменты  С3  регулируют  созревание В-лимфоцитов,

т.е. при недостатке С3 синтез АТ "прекращается",  так как утили-

зации ИК не будет.]

       ОЦЕНКА ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА

   - Определение абсолютного (камера Горяева) и  относительного

     (мазок) числа нейтрофилов и моноцитов.

   - Определение фагоцитарной активности;

     -- оценка функциональной активности макрофагов (хемотакси-

     са, стадий фагоцитоза и его завершенности, внутриклеточной

     инактивация Staphylococcus aureus, тест кожного окна),

   - Определение общей гемолитической активности комплемента.

     Количественное  определение  компонентов  комплемента  С3,

     С6-С8, субкомпонента С1q.

   - Количественное определение  ЕКК,определение активности ЕКК.

   - Тест торможения миграции лейкоцитов на  ФГА  или  цитокины

активированных определенным антигеном лимфоцитов.

                ОЦЕНКА ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ

   Фагоцитозом называется поглощение клетками микробов или  чу-

жеродных частиц.  Снижение числа нейтрофилов ниже 25%  от нормы

опасно для жизни. /2269к/

             ┌─после комплементарного лизиса ─── АПК, КПК ── АТ

   Фагоцитоз ┼─после "работы" антител (ИК)   ─── уровень АТ

             └─комплексов с фибронектином,  альфа-2-макроглобу-

               лином, С-РБ, лектинами и пр.

   Для изучения  поглощения  используют  бактериальные   клетки

(St.aureus или E.coli), дрожжи, латексные частицы. Более интен-

сивно фагоциты поглощают чистицы,  обработанные сывороткой, со-

держащей опсонины (Ig G,  комплемента, фибронектин, СРБ и др.).

/2291к/

   При определении фагоцитарной активности определяют следующие

 2показатели:

   - фагоцитарный показатель - процент фагоцитирующих нейтрофи-

                           лов к общему количеству нейтрофилов;

   - фагоцитарный индекс - среднее число микробных тел,  захва-

                           ченных каждой клеткой;

   - опсонический индекс

   - переваривающая  способность  -  постепенное уменьшение ( в

течение 50-60 минут) интенсивности окрашивания фагоцитированных

микробов вплоть до их полного обесцвечивания;

   - завершенность  фагоцитоза  - отношение лейкоцитов с завер-

шенным фагоцитозом к общему числу лейкоцитов с фагоцитированны-

ми микробами, выраженное в процентах. /272-53/

    _ 2Методики . 1:

   Фагоцитарную активность можно определять в условиях in vitro

и в условиях in vivo.

   I. In vitro.

   - Методы оценки экспрессии С3- и Fс-рецепторов по тесту РОК;

   - Радиометрические методы изучения стадии захвата.

   - Тест  восстановления  нитросинего  тетразолия.  По реакции

восстановления нитросинего тетразолия судят об стимуляции  гек-

созомонофосфатного шунта. /1583-4/

   II. In vivo.

   Белым мышам вводят в/бр.  2мл стерильного МПБ, чем вызывают-

локальный лейкоцитоз.  Через 4 часа в/бр.  вводят 1мл  2млрд-ой

культуры Staphylococcus  albus.  Через 10-15 минут из перитоне-

альной жидкости готовят мазки (можно из осадка после  центрифу-

гирования), окрашивают метиленовым синим.

    2Незавершенный фагоцитоз 0 (наблюдается при поглощении туберку-

лезных палочек,  возбудителей лепры,  лейшманиоза, гонореи, ме-

нингококков, вирусов, риккетсий) :

   Рис. "Незавершенный фагоцитоз гонококков (мазок in vivo)"

   Показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) - процентное отно-

шение умерщвленных  и всех поглощенных микробов (примерно равно

0,80). Выделяют 5 степеней завершенности фагоцитоза (ЗФ):

   - высокая ЗФ (1,0-0,82);

   - средняя (0,81-0,45);

   - слабая (0,44-0,32);

   - очень слабая (0,31-0,29)

   - ЗФ отсутствует (0,28-0,25)

                     2Фагоцитарная активность

                   (фагоцитоз стафилококка)

   Реакцию осуществляли  по  методу  Н.В.Васильева   и   соавт.

(1972).  Для постановки реакции в лунки иммунологического план-

шета вносили по 15 мкл гепарина в концентрации 10 ед/мл, 50 мкл

цельной крови,  взятой с пальца натощак, и добавляли 25 мкл 2 х

10 59 0 микробных тел/мл суточной агаровой культуры  Staphylococcus

aureus разведенных на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2.  В опытные

лунки вводили по 10 мкл расстворов  изучаемых  полипептидов,  в

контрольные - 10 мкл фосфатного буфера.  Лейкоцитарно-микробную

взвесь перемешивали и инкубировали при температуре 37С в  тече-

ние 30 минут, повторно встряхивая каждые 5 минут. После инкуба-

ции взвесь ресуспендировали, готовили мазки, фиксировали 10 ми-

нут метанолом и окрашивали по Романовскому-Гимза.

   Готовые препараты микроскопировали с использованием масляной

иммерсии и вели подсчет в 200 нейтрофилах.  Поглотительную спо-

собность фагоцитов оценивали по следующим показателям:

     1) фагоцитарный показатель - процент фагоцитировавших кле-

ток из числа сосчитанных нейтрофилов;

     2) фагоцитарный индекс - среднее число микробов, поглощен-

ных одним активным нейтрофилом.

     Для оценки  переваривающей  функции нейтрофилов определяли

показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) по формуле:

             общее количество переваренных микробов

     ПЗФ  =  -------------------------------------- х 100 %.

             общее количество поглощенных микробов

   Чувствительным методом  оценки функциональной активности фа-

гоцитов является  метод  определения  хемилюминесценции  крови.

/7062/

   - Приготовить  кровяно-микробную  взвесь (0,05мл 2%  цитрата

натрия, 0,1мл крови и 0,05мл 2 млрд-ой взвеси микробов - микро-

кокков);

   - для определения опсонического индекса в опытную пробу  до-

полнительно добавляетя  антисыворотка  к микробам или сыворотка

больного для определения функциональной  активности  антител  к

микробам;

   - выдержать в термостате 30 мин. при 37 50 0С.

   - приготовить мазок из кровяно-микробной взвеси;

   - высушить  мазок,  окрасить по методу Филлипсон:  краситель

Романовского развести этиловым спиртом 1:3.  На высушенный пре-

парат наносят  5 капель красителя и выдерживают 5 минут (однов-

ременная фиксация и окраска).  Не сливая краску,  добавляют во-

допроводную воду, 5 капель на 5 минут. Промывают водой, высуши-

вают, микроскопируют с иммерсией.

   - В мазке определяют

     а) фагоцитарный показатель - процент фагоцитирующих лейко-

        цитов (среди полиморфоядерных лейкоцитов). Подсчитывают

        100 гранулоцитов и,  например,  если 35 из них водержат

        микробы, то фагоцитарный индекс равен 35%.

     б) фагоцитарное число или индекс (количество микроорганиз-

        мов,  поглощенных одним нейтрофилом); считают суммарное

        количество микроорганизмов, например, 567 во всех фаго-

        цитирующих гранулоцитах /80/ и делят на  число  фагоци-

        тов.  Частное  от  деления  (567:80=7) отражает сруднюю

        поглотительную способность одного фагоцита.

     в) определяют опсоно-фагоцитарный индекс (ОФИ).  Для этого

        либо рассчитывают частное от деления ФЧ  (фагоцитарного

        числа) больного  на  ФЧ  здорового донора (при этом ОФИ

        должен быть больше единицы; либо ОФИ определяют эмпири-

        ческим методом,  с помощью которого анализируют состоя-

        ние 25 нейтрофилов по следующей схеме:

──────────────────────────────────────────────────────────────

Количество микро-│Оценка фагоцитоза│Количество нейт- │   ОФИ

бов, фагоцитиро- │                 │рофилов с данной │

ванный одним     │                 │степенью фагоци- │

гранулоцитом     │                 │тарной активности│

──────────────────────────────────────────────────────────────

      0                  0                  2          0х2=0

от 1 до 20         +  (один)                5          1х5=5

от 20 до 40        ++  (два)               10          2х10=20

от 40 и более      +++ (три)                8          3х8+24

                                               Итого:  ОФИ=49

   Максимальное значение ОФИ - 75,  т.е. во всех 25 нейтрофилах

фагоцитировано от 40 и более микробов. У здоровых людей ОФИ ра-

вен 10.

    ОФИ  от 10 до 24 - слабо положительный (+);

         от 25 до 49 - ясно выраженная реакция (++);

         от 50 до 75 - резко положительная реакция (+++).

   Полученые результаты внести в протокол.

   Фагоцитарный показатель у здорового человека - 70-84%.

   Фагоцитарное число у здорового человека - 4-?.

   Фагоцитарное число после обработки микробов антителами  (им-

мунной сывороткой) или комплементом -

   Опсонический индекс - больше 1.

   Фагоцитоз культуры стафилококка или микрококков в отсутствие

антител идет плохо,  при наличии антител в сыворотке или плазме

фагоцитоз ускоряется,  при добавлении комплемента или активации

комплемента в  крови  исследуемого  фагоцитоз резко ускоряется,

т.к. происходит как через Fc-, так и через С3в-рецепторы.

       2Оценка степени перекисного и радикального окисления

                     2по НСТ-тесту 0 (NBT-тест)

      1Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест)

   Тест бессубстратного  восстановления  нитросинего тетразолия

основан на способности фагоцитов утилизировать кислород с обра-

зованием высокореактогенных  свободных радикалов.  НСТ является

индикатором респираторного взрыва (показывает готовность  нейт-

рофилов к завершенности фагоцитоза).  Низкая реактивность нейт-

рофилов в динамике заболевания  может  служить  неблагоприятным

прогностическим признаком. /2737к/87/

   Сущность метода заключается в образовании нерастворимых  ок-

рашенных  зерен  формазана при восстановлении НСТ супероксидным

радикалом.

   Метод высокоинформативен

   - для оценки функциональной активности фагоцитов,

   - прогнозирования тяжести заоблевания,

   - контроля  за  эффективностью  антибактериального  лечения,

   - дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных  за-

     болеваний и пр. /2291к/

   - Получены доказательства высокого уровня  корреляции  между

образованием активных форм кислорода и киллингом.

   Метод Н.Е.Виксмана,  А.Н.Маянского (1979). Изучаемые образцы

веществ  в  количестве 20 мкл вносили в лунки иммунологического

планшета,  в контрольные лунки - 20 мкл среды 199.  В каждую из

лунок вносили по 20 мкл цельной крови,  взятой из пальца здоро-

вых людей пипеткой,  предварительно промытой раствором гепарина

250 ед/мл и добавляли 20 мкл 0,15% суспензии нитросинего тетра-

золия (Reanal,  Венгрия) на 0,1 М фосфатном буферном  растворе,

рН 7,2.  Содержимое лунок осторожно перемешивали и инкубировали

при температуре 37 5о 0С в течение 30  минут,  встряхивая  планшеты

каждые 10 минут. После инкубации содержимое перемешивали, гото-

вили мазки и высушивали на воздухе.  Готовые мазки  фиксировали

метанолом  10  минут,  высушивали и докрашивали 0,5%  раствором

сафранина.

   В качестве  активаторов фагоцитов рекомендуется использовать

опсонизированный зимозан  или  активатор протеинкиназы С - фор-

болмиристат ацетат. /2291к/

   Об интенсивности радикалообразования судят по количеству ди-

формазана, который  откладывается в виде грубодисперсных темно-

синих гранул внутри или на поверхности активированного  нейтро-

фила.  /7062/

     При микроскопии в каждом мазке подсчитывали 100  нейтрофи-

лов, среди которых определяли процент клеток,  содержащих отло-

жения диформазановых гранул (НСТ-позитивные нейтрофилы).  Далее

расчитывали индекс активации нейтрофилов (ИАН) по формуле:

              А х 0  +  Б х 1  +  В х 2  +  Г х 3

     ИАН  =   ----------------------------------- ,

                              100

где: А - количество клеток, не содержащих диформазановых отложе-

         ний;

     Б - количество клеток, в которых площадь отложений диформа-

         зана не превышает 1/3 площади ядра;

     В - количество клеток, в которых названные отложения зани-

         мают от 1/3 до всей величины ядра;

     Г - количество клеток с диформазановыми отложениями по пло-

         щади превосходит площадь ядра.

   НСТ-тест может  быть  сделан  без  дополнительной стимуляции

(спонтанный НСТ-тест) или после стимуляции нейтрофилов in vitro

(индуцированный НСТ-тест). /7062/

   При патологии чаще ПОЛ растет.  Поэтому если лечение выбрано

правильно, то процент активированных нейтрофилов быстро падает,

опережая динамику лейкоцитарных сдвигов, СОЭ и др. /7062/

   Сниженные показатели  НСТ-теста --- неблагоприятный  исход

                                       (сепсиса)

   Повышенные показатели НСТ-теста --- опасность развития гной-

                                 ных осложнений после операции.

   Нормальные показатели НСТ-теста --- успешная терапия. /1365к/

   [Преципитат с НСТ может образовывать  гепарин. /1575к/90/]

   На стекла с прилипшими клетками капают 5  капель  (0,14  мл)

1,03% раствора нитросинего тетразолия (17мг на 14 мл).

   (Pack B.I.  и соавт. // Lancet. - 1968. - V.2. - P.532):

   0,2% раствор НСТ (0,1 мл на 0,1 мл взвеси лейкоцитов,  выде-

ленных из гепаринизированной крови). Пробирку со смесью помеща-

ли в термостат (37 5о 0С) на 25 минут,  затем выдерживали при  ком-

натной температуре 15 минут,  после чего готовили мазки, фикси-

ровали в метаноле и окрашивали гематоксилином. В мазках подсчи-

тывали % гранулоцитов, включающих красители.

                2Лизосомально-катионный тест (ЛКТ)

   Растворами исследуемых полипептидов по 50 мкл заполняли лун-

ки  иммунологического  планшета,  в  которые  вносили по 20 мкл

цельной крови здоровых  доноров,  взятой  со  скарифицированной

ранки  пальца руки при помощи пипетки,  предварительно промытой

раствором гепарина 250 ед/мл.  Полученную взвесь  клеток  крови

инкубировали 1 час при температуре 37С. После инкубации готови-

ли мазки, сушили на воздухе при комнатной температуре и окраши-

вали по методу В.Е.Пигаревского и соавт. (1981) в 0,1 % забуфе-

ренном спиртовом растворе зеленого прочного с рН 8,2 в  течение

20 минут.  Дополнительную окраску мазков проводили 0,25% водным

раствором азура А.  Окрашенные препараты промывали  дистиллиро-

ванной  водой,  высушивали  на воздухе и микроскопировали с ис-

пользованием масляной иммерсии.

     При исследовании просматривали 100 гранулоцитов.  Внутрик-

леточное содержание  катионных белков крови оценивали полуколи-

чественно по  величине  среднего  цитохимического  коэффициента

(СЦК), вычисляемого по формуле:

             3а  +  2б  +  1,5в  +  1г  +  0,5д  +  0а

     СЦК  =  -----------------------------------------,

                              100

где: а-е - количество однотипных клеток с определенной степенью

           окрашиваемости цитоплазмы зеленым прочным, а цифры

           показывают степень выраженности окраски;

     0   - отсутствие окраски;

     0,5 - наличие в цитоплазме единичных окрашенных гранул;

     1   - половина цитоплазмы заполнена светлоокрашенными гра-

           нулами;

     1,5 - цитоплазма равномерно заполнена гранулами,  окрашен-

           ными в светло-зеленый цвет;

     2   - цитоплазма содержит 1/3 часть своей площади темно-

           зеленых гранул;

     3   - цитоплазма содержит 2/3 части своей площади  темно-

           зеленых гранул.

        2Определение хемотаксической активности лейкоцитов

   Недостаточный хемотаксис  сдерживает  мобилизацию фагоцитов,

способствуя опережающему размножению бактерий.  Снижение мигра-

ционной активности нейтрофилов в 2 раза сопровождается затяжным

торпидным течением пневмонии более чем у 50% детей. /7062/

          ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЙ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

                      СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА

    _Изотонический вероналовый буфер (VBS) ..

   1 л раствора содержит 5,095 г веронала и 41,5 г NaCl, рН до-

водится до 7,40 1 М раствором NaOH. Перед работой буфер разбав-

ляют в 5 раз.

    _Изотонический вероналовый буфер, содержащий ионы Са 52+ 0 и Mg 52+

 _(VBS 52+ 0) ..

   2 л раствора содержит 5,75 г веронала,  3,0 г мединала, 85,0

г  NaCl,  5  мл  1 М MgCl 42 0 и 1,5 мл 1 М СаСl 42 0,  рН доводится до

7,40. Перед работой буфер разбавляют в 5 раз.

    _Изотонический вероналовый буфер, содержащий ионы Mg 52+ 0 и ЭГТА

 _(VBS, .  _Mg 52+ 0-ЭГТА) ..

   К 850  мл изотонического вероналового буфера (VBS),  разбав-

ленного в 5 раз, добавляется 100 мл 0,1 М раствора ЭГТА, рН 7,4

и 50 мл 0,1 М раствора MgCl 42 0, рН доводится до 7,40.

    _Изотонический фосфатный буфер (РВS)

   0,85% раствор  NaCl,  содержащий  2%  по  объему  0,2 М нат-

рий-фосфатного буфера, рН 7,20.

    _Изотонический трис-буфер  с  ЭДТА  (TBSE) ..

   Содержит 5 мМ трис, 0,15 М NaCl, 10 мМ ЭДТА 5. 0Na 42 0, рН 7,2 (до-

водится 0,01 М NaOH).

    _Раствор Олсвера ..

   В 750 мл дистиллированной воды растворяли 8,0 г цитрата нат-

рия (дигидрата натриевой соли),  4,2 г NaCl и 20,0  г  глюкозы,

добавляли 4  ~ 05,5  мл  10%  лимонной кислоты до рН 6,1 и доводили

объем раствора до 1 л.  Для взятия крови раствор Олсвера стери-

лизовали.

   Другие буферные растворы готовили по  общеизвестным  методи-

кам.

    _Приготовление стандартных взвесей эритроцитов

   Эритроциты барана.  Кровь  барана из яремной вены отбирали с

соблюдением асептических условий  в  равный  объем  стерильного

раствора  Олсвера со стеклянными шариками,  перемешивали и сте-

рильно разливали по пробиркам.  Оставляли на 3-7 суток при  4 5о 0С

для стабилизации клеток.  Стерильно отобранные эритроциты можно

хранить около 2 месяцев при 4 5о 0С.

    _Приготовление стандартной взвеси бараньих эритроцитов ..

Осадок эритроцитов трижды промывали 10-20-кратным объемом VBS 52+

с последующим центрифугированием (1000 g) в течение  5-10  мин.

Отмытые эритроциты суспендировали в VBS 52+ 0 таким образом,  чтобы

после 15-кратного разбавления водой суспензия обладала поглоще-

нием при 541 нм равным 0,7, что соответствует концентрации кле-

ток в суспензии 1 5. 010 59 0 клеток/мл.  Для стандартизации  пользова-

лись формулой V 4k 0 = V 4o 5. 0A 4541 0/0,7, где V 4k 0 - конечный объем суспен-

зии,  V 4o 0 - начальный объем с концентрацией, определяемой по ве-

личине  А 4541 0.  Стандартизированные эритроциты хранили при 4 5о 0С и

использовали в работе в течение нескольких суток.

    _Приготовление сенсибилизированных эритроцитов (ЕА) ..

   К взвеси  эритроцитов  (стандартизированных  до  1х10 59 0  кле-

ток/мл) прибавляли равный объем гемолитической сыворотки,  раз-

бавленной VBS 52+ 0 в отношении 1:400, тщательно перемешивали и ин-

кубировали 30 мин при 37 5о 0С, периодически перемешивая. После за-

вершения инкубации взвесь эритроцитов доводили до  концентрации

1,5 5. 010 58 0 клеток/мл,  добавляя VBS 52+ 0 таким образом,  чтобы 0,2 мл

суспензии ЕА в смеси с 2,8 мл Н 42 0О  давали  1,0  ед.  оптической

плотности при 412 нм. Стандартизированную взвесь ЕА хранили при

4 5о 0С и использовали в работе в течение одного дня.

   Эритроциты кролика получали, отбирая кровь из ушной вены жи-

вотного в стерильный раствор Олсвера, который постоянно переме-

шивали со стеклянными бусами. Эритроциты хранили в этом раство-

ре при 4 5о 0 до 1,5-2 месяцев. Для стандартизации эритроциты отмы-

вали  трижды раствором VBS с последующим центрифугированием при

1000-1500g в течение 5 мин, дважды - раствором VBS, Mg 52+ 0-ЭГТА и

в последнем буфере приготовляли стандартную суспензию таким об-

разом,  чтобы при 15-кратном разбавлении дистиллированной водой

(0,2  мл  суспензии  и 2,8 мл Н 42 0О) она имела поглощение 1,0 при

412 нм.  Стандартную взвесь эритроцитов кролика использовали  в

работе в течение одного дня.

   Эритроциты барана и кролика более стабильны (менее подверже-

ны спонтанному лизису),  если буферы, используемые для стандар-

тизации, содержат 0,1% человеческого сывороточного альбумина.

    _Инактивация комплемента ..

   Для проведения  серологических  реакций  систему  комплемнта

часто инактивируют при 56 5о 0 30 минут. При этом теряют активность

С2,С4,фактор В,  в результате чего  прерывается  активация  как

КПК, так и АПК.

           2Определение общей гемолитической активности

                       2системы комплемента 0

   Предложено несколько методов определения уровня комплемента.

    _Классический путь активации системы комплемента . (КПК)  опре-

деляли  по  методу P.G.Adrian (1983) и S.Tanaka et al.  (1986).

Для постановки реакции использовали суспензию эритроцитов бара-

на в концентрации 109 клеток/мл,  предварительно сенсибилизиро-

ванных антисывороткой к ним. К 280 мкл веронал-мединалового бу-

фера (рН 7,4), содержащего 5 мМ MgCl2 и 0,75 мМ CaCl2, добавля-

ли 20 мкл рабочей концентрации сыворотки здоровых доноров, раз-

бавленной в том же буфере.  Рабочая концентрация сыворотки под-

биралась таким образом,  чтобы лизировалось 50-60 % эритроцитов

за 20 минут. В систему вносили 20 мкл раствора исследуемого по-

липептида (контроль- 20 мкл веронал-мединалового буфера). Пробы

инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре, пос-

ле чего вносили 200 мкл суспензии эритроцитов барана,  сенсиби-

лизированных  антителами.  Смесь  встряхивали и инкубировали 20

минут при температуре 37С в водяной бане.  По истечении времени

реакцию  гемолиза  останавливали погружением пробирок в ледяную

баню и разведением системы охлажденным забуференным  физиологи-

ческим раствором (2,5 мл буфера).  Эритроциты осаждали при 3000

об/мин в течение 5 минут. Степень лизиса эритроцитов определяли

спектрофотометрически  по оптической плотности супернатанта при

длине волны 412 нм против пробы, не содержащей сыворотку.

   Для определения  _альтернативного пути активации . системы комп-

лемента /АПК/ (Козлов Л.В.,  Соляков Л.С.,  1982;  Tanaka S. et

al.,  1986) к 280 мкл веронал-мединалового буфера (рН 7,4), со-

держащего 5 мМ MgCl2 и 10 мМ этиленгликоль-тетрауксусной кисло-

ты добавляли рабочую дозу сыворотки здоровых доноров (20 мкл) и

20 мкл исследуемого полипептида. Смесь инкубировали при комнат-

ной  температуре 20 минут,  а затем добавляли 200 мкл суспензии

эритроцитов кролика в буфере (1,5х10 58 _ 0  .клеток/мл).  Смесь встря-

хивали  и помещали в водяную баню при температуре 37С на 20 ми-

нут.  Реакцию гемолиза останавливали добавлением 2,5 мл  охлаж-

денного до 4С забуференного физиологического раствора,  а затем

содержимое пробирок центрифугировали при 3000 об/мин в  течение

5 минут.  Степень лизиса эритроцитов определяли на спектрофото-

метре при длине волны 412 нм против пробы,  не содержащей сыво-

ротку.

          Гемолитический метод титрования комплемента

                  2по  50%  или 0  2100%-му гемолизу

   Титром комплемента является наменьшее количество исследуемой

активности сыворотки, способствующее полному гемолизу добавлен-

ного количества  (0,5-1 мл) сенсибилизированных эритроцитов.

   Для титрования комплемента по 100%-му гемолизу активную исс-

ледуемую сыворотку, разведенную в 10 раз, разливают в 11 проби-

рок в количестве 0,1;  0,2;  0,3;  0,4 ... 1; 1,1 мл. Сыворотку

доводили физиологическим раствором до 1,5 мл, после чего в каж-

дую пробирку добавляют 1 мл гемолитической системы (1,5% взвесь

эритроцитов барана,  обработанных антителами в  конечном  титре

1:3). Учет результатов производили после 45-минутного инкубиро-

вания взвеси в термостате при 37 50 0С.

   Для расчета  берут пробирку,  в которой получен полный гемо-

лиз. Например,  полный гемолиз произошел в пробирке N 4 с дозой

активной сыворотки 0,4мл; следовательно, титр комплемента равен

0,04.

   СН 450 0 -  минимальное  количество сыворотки,  которое вызывает

лизис 50% сенсибилизированных бараньих эритроцитов, находящихся

в 0,5мл стандартной суспензии при 37 50 0С в течение 30 минут.

          1Количественное определение уровня комплемента

                       1в  весовых 3  1единицах

   Среди больных с бактериальными инфекциями  (пневмония,  сеп-

сис) опсонический резерв альтернативного пути активации компле-

мента нередко в 5-10 раз ниже нормы.  /7062/ Классический  путь

более устойчив  к  нарушениям внутренней среды и менее пригоден

для их регистрации. /7062/ При падении активности АПК до 30% от

среднего уровня взрослых септические проявления пиогенного про-

цесса отмечали у 80% больных. /7062/

             2Приготовление реагентов 0 для определения

           активности отдельных компонентов комплемента

    _Сыворотка человека. .  Донорскую  кровь  отбирали в сухую сте-

рильную посуду и оставляли на 2 суток при 4 5о 0С.  После этого сы-

воротку  крови сливали декантацией и центрифугировали в течение

20 мин при 3000g.  Супернатант разливали по пробиркам и хранили

при -70 5о 0С.

    _Приготовление реагента R2 для определения гемолитической ак-

 _тивности компонента С2 .. Сыворотку разливали в тонкостенные про-

бирки по 3 мл и инкубировали  в  водяном  термостате  при  50 5о 0С

(внутри пробирок).  Отбирали пробы через каждые 10 мин, опреде-

ляя активность компонентов С1, С1q, С4 и контроль на гемолиз по

методике  определения  С2,  используя  в качестве R2 отобранную

пробу. В качестве R2 выбирали сыворотку, инкубированную в тече-

ние  такого времени,  при котором сохраняется активность компо-

нентов С1 и С4 при достаточно низком контроле.  R2 хранили  при

-70 5о 0С в течение года.

    _Приготовление реагента R4 для определения гемолитической ак-

 _тивности компонента  С4 ..  К 1 мл комплемента морской свинки до-

бавляли 0,25 мл 0,075 М раствора гидразингидрата, смесь инкуби-

ровали  1,5 ч при 20 5о 0 и нейтрализовали добавлением 0,25 мл 0,15

М HCl,  после чего диализовали против РВS в течение  18  ч  при

4 5о 0С.  Реагент  хранили  при  -70 5о 0С и использовали в качестве R4

после предварительного разбавления VBS 52+ 0 в соотношении 1:3.

    _Приготовление реагента R3 для определения гемолитической ак-

 _тивности компонента С3 .. К 10 мл охлажденной до 4 5о 0С свежей сыво-

ротки  при  непрерывном  перемешивании медленно приливали 10 мл

охлажденного насыщенного при 4 5о 0С раствора КВr.  Смесь инкубиро-

вали 18 ч при 4 5о 0С, затем диализовали в течение 18 ч против PBS.

Реагент хранили при -70 5о 0С.  В качестве R3 использовали реагент,

разбавленный VBS 52+ 0 в соотношении 2:3.

    _Приготовление реагента  R3 . 5oxy _ 0 для определения гемолитической

 _активности компонента ..

   Реагент R3 5oxy 0  готовили  окислением компонента С2 в реагенте

R3.  Реагент R3 готовили как описано выше.  Окисляющий  раствор

готовили  растворением  8,3  г KI и 0,25 г I 42 0 в 4 мл фосфатного

буфера, рН 6, ионная сила 0,1 (105 мл 1 М NaH 42 0PO 44 0 + 35 мл 0,5 M

Na 42 0HPO 44 0  + H 42 0O до 1,5 л),  затем доводили объём до 10 мл тем же

буфером.  Хранили в темной склянке при  4 5о 0  в  течение  недели.

Окисляющий  раствор (10 мкл) добавляли к 2 мл реагента R3 инку-

бировали 5 мин при 4 5о 0 и нейтрализовали избыток иода добавлением

1  мг  глюкозы на 1 мл пробы.  Реагент R3 5oxy 0 хранили при -70 5о 0 и

использовали в качестве реагента R3 5oxy 0  после  предварительного

разбавления VBS 52+ 0 в соотношении 1:3.

    _Приготовление реагента R1q с помощью IgG-стекла ..

   К 10 мл сыворотки крови человека добавляли 37,2 мг ЭДТА 5. 0Na 42 0,

осторожно перемешивали на магнитной мешалке до растворения соли

(конечная концентрация 10 мМ) и доводили 0,15 М NаОН до рН 7,2.

Подготовленную  таким  образом  сыворотку наносили на колонку с

IgG-стеклом (9,5х2 см),  уравновешенную TBSE,  со скоростью  15

мл/ч.  Колонку промывали 50 мл TBSE со скоростью 35 мл/ч. Фрак-

ции несвязавшегося на колонке белка (50 мл) не проявляли актив-

ности С1q. Фракции несвязавшегося белка с максимальным поглоще-

нием при 280 нм объединяли (18 мл), добавляли раствор, содержа-

щий 0,3 М CaCl 42 0,  1 M MgCl 42 0, pH 7,4, из расчета 15 мкл раствора

на 1 мл фракции, доводили до рН 7,4, диализовали в течение ночи

против VBS 52+ 0, разливали небольшими аликвотами по пробиркам, за-

мораживали и хранили при -70 5о 0С. Использовали в качестве реаген-

та R1q,  после размораживания непосредственно перед титрованием

С1q.

    _Получение реагента R1 с помощью IgG-стекла.

   5 мл  охлажденной  сыворотки  при  4 5о 0  наносили на колонку с

IgG-стеклом (9,5 х 2 см), уравновешенную VBS pH 7,4, содержащим

0,001 М СаСl 42 0, со скоростью 8 мл/ч. Фракции несвязавшегося бел-

ка собирали по 2 мл и определяли остаточную  активность  С1q  и

С1r 42 0s 42 0, фракции с максимальным поглощением при 280 нм объединя-

ли (10мл),  диализовали против VBS 52+ 0 в течение ночи,  разливали

небольшими аликвотами по пробиркам,  замораживали и хранили при

-70 5о 0. Колонку IgG-стекло-С1 использовали в дальнейшем для выде-

ления С1q, C1r и C1s.

          1Гемолитические методы определения активности

               1компонентов и факторов комплемента

    _Определение гемолитической активности компонентов С2 и С4 .. К

0,2 мл стандартизованной суспензии ЕА в VBS 52+ 0 добавляли 0,05 мл

реагента  (R4  или  R2  в соответствующем разведении) и 0,25 мл

тестируемой пробы. Смесь инкубировали 30 мин при 37 5о 0, добавляли

2,5  мл  0,15  М  NaCl и центрифугировали при 1500g в течение 5

мин.  Степень гемолиза определяли по А 4412 0,  измеренному  против

буфера.  Кроме того,  ставили контроли на спонтанный лизис (0,2

мл ЕА и 0,3 мл буфера),  а также контроль на полный лизис эрит-

роцитов (0,2 мл ЕА и 2,8 мл Н 42 0О).  Измеренную величину гемолиза

выражали в виде Z (количество эффективных молекул), которую оп-

ределяли по формуле:

                    Z = ln  _К 4П.Л. 5_ 0 К 4R

                           К 4П.Л. 0- А 4412 0 ,

где К 4R 0  -  контроль  реагента (буфер вместо тестируемой пробы),

К 4П.Л. 0 - контроль на полный лизис эритроцитов, А 4412 0 - измеренное

значение тестируемой пробы.

    _Определение гемолитической активности компонентов С3 ..  К 0,2

мл ЕАС14 (приготовление комплекса описано ниже) добавляли  0,05

мл  реагента (R3 или R5 в соответствующем разведении),  0,25 мл

тестируемой пробы и смесь инкубировали при  37 5о 0  в  течение  30

мин.  После инкубации добавляли по 2,5 мл 0,15 М NaCl и центри-

фугировали при 5 мин при 1500g.  Степень гемолиза определяли по

поглощению  при 412 нм,  измеренному против буфера.  В качестве

контролей ставили контроль реагента (0,25 мл буфера вместо тес-

тируемой пробы),  контроль на спонтанный лизис эритроцитов (0,2

мл ЕАС1 4 и 0,3 буфера) и контроль на полный лизис  эритроцитов

(0,2 мл ЕАС1 4 и 2,8 мл Н 42 0О).  Измеренные значения гемолиза вы-

ражали в виде Z аналогично определению  активности  компонентов

С2 и С4.

    _Приготовление комплекса ЕАС14 ..  10 мл ЕА (концентрация  1  х

10 59 0  клеток/мл)  инкубировали  с 1,0 мл R2 при 37 5о 0 в течение 10

мин. Комплекс промывали VBS 52+ 0 до полного исчезновения фона (ли-

зированные  эритроциты)  с  последующим  центрифугированием при

1500g в течение 5 мин.  Отмытый комплекс  стандартизировали  до

концентрации  1,5 х 10 58 0 клеток/мл как описано для ЕА.  Комплекс

ЕАС14 использовали в работе в течение одного дня.

    _Приготовление комплекса  ЕАС1q  с ограниченным числом эффек-

 _тивных молекул С1q. .  К 200 мкл суспензии ЕА  (1,5  х  10 58 0  кле-

ток/мл)  добавляли  подобранное количество раствора С1q в общем

объеме 300 мкл.  Инкубировали 30 мин при 37 5о 0С. Реакцию останав-

ливали  охлаждением  и  добавлением 700 мкл охлажденного VBS 52+ 0.

Комплекс промывали 1 раз VBS 52+ 0/HSA и количество  гемолитических

эффективных молекул С1q определяли с помощью реагента R1q.

    _Получение комплекса ЕАС14 с ограниченным числом  эффективных

 _молекул С4b. .  К 10 мл суспензии ЕА (1,5 х 10 58 0 клеток/мл) добав-

ляли 100 мкл реагента R2 и инкубировали 5 мин при 37 5о 0.  Реакцию

останавливали охлаждением до 0 5о 0 в ледяной бане. Комплекс промы-

вали 3 раза VBS/HSA с центрифугированием и  стандартизовали  по

А 4412 0 при гемолизе.  Количество гемолитических эффективных моле-

кул С4b определяли с помощью реагента R4.

    _Приготовление стабилизированной мембраносвязанной С3-конвер-

 _тазы ЕАС142 5oxy . 0.  К 6 мл суспензии ЕАС14 (1,5 х  10 58 0  клеток/мл)

добавляли  при 0 5о 0 180 мкл реагента R3 5oxy 0,  30 мкл 0,1 М NiCl 42 0 и

инкубировали 5 мин при 37 5о 0,  реакцию останавливали  охлаждением

до  0 5о 0  в  ледяной бане.  Добавляли 4 мл VBS,  содержащего ЭДТА

(VBSE) и центрифугировали 5 мин при 1500g.  Полученный комплекс

ЕАС142 5oxy 0  промывали  3  раза VBS 52+ 0 и стандартизовали при А 4412 0,

как описано выше.

    _Определение гемолитической  активности С3-конвертазы. .  К 0,2

мл суспензии ЕАС142 5oxy 0 (1,5 х 10 58 0 клеток/мл) добавляли  0,1  мл

сыворотки, разведенной 1:9 VBS, содержащего 0,05 М ЭДТА (VBSE).

Общий объём доводили до 0,5 мл VBSE и инкубировали 30  мин  при

37 5о 0.  Реакцию  останавливали  добавлением  2,5 мл 0,15 М NaCl и

центрифугировали 5 мин при 1500 g.  Степень гемолиза определяли

в супернатанте при А 4412 0.

    _Выделение функционально активных субкомпонентов С1,  первого

 _компонента комплемента, на аффинном сорбенте. .

   20 мл  сыворотки  крови  человека  наносили  на  колонку   с

IgG-стеклом (9,5 х 2 см),  уравновешенную 0,01 М трис-HCl-буфе-

ром с 0,15 М NaCl и 0,001 М СаСl 42 0, рН 7,4, со скоростью 20 мл/ч

при  0 5о 0.  После полного нанесения сыворотки протекание раствора

через колонку останавливали и колонку инкубировали с сывороткой

40 мин при 0 5о 0 для полного связывания комплекса С1. Колонку про-

мывали стартовым буфером со скоростью 20 мл/ч, собирая белковые

фракции  (А 4280 0)  и  определяя в них остаточную активность С1q и

С1r 42 0s 42 0.

    _Получение С1r 42 . 0.  Колонку  с  IgG-стеклом  с сорбированным С1

нагревали при 30 5о 0 в течение 40 мин для активации С1. Затем про-

водили  элюирование  при  0 5о 0стартовым  буфером  со скоростью 20

мл/ч,  собирая фракции по 3 мл.  В белковых фракциях определяли

активность С1r и С1s.

    _Получение С1s. .  После элюирования С1r стартовым буфером про-

водили элюирование С1s 0,05 М ЭДТА трис-НСl-буфере,  содержащем

0,15 М NaCl,  рН 7,4, со скоростью 20 мл/ч при 0 5о 0. Фракции, об-

ладающие  активностью С1s (около 60 мл) объединяли и концентри-

ровали ультрафильтрацией до 5,5 мл.  С1s хранили при 4 5о 0 с 0,01%

NaN 43 0 в течение года.

    _Получение С1q. .  После элюирования С1s субкомпонент С1q элюи-

ровали с колонки с IgG-стеклом 0,02 М трис-НСl-буфером,  содер-

жащим 1,0 М NaCl,  0,03 ЭДТА,  рН 8,5 со скоростью 20 мл/ч  при

0 5о 0.  Фракции,  содержащие  активность  С1q,  объединяли и белок

осаждали сульфатом аммония при 33%  насыщения.  Для  дальнейшей

очистки  осадок  С1q  растворяли и фракционировали на колонке с

сефакрилом S-300, как описано в работе [48].

         ОЦЕНКА ДРУГИХ ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕКОЙ ЗАЩИТЫ

              2Определение ферментативной активности

                      2мурамидазы (лизоцима)

   Записать метод определения лизоцима  (ферментативной  актив-

ности мурамидазы).

   В опытную пробирку наливают 0,4мл 0,15М солевого  фосфатного

буфера с рН 6,2,  добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки крови.

К полученной смеси приливают 2 мл  стандартизированной  (Е=0,66

на  ФЭК в кювете N 5 при светофильтре N 6) бактериальной взвеси

суточной культуры микрококка в фосфатном буфере. Пробы помещают

в термостат  на  30 минут при температуре 37 50 0С,  затем замеряют

оптическую плотность на ФЭК в кювете N 2 с  зеленым  светофиль-

тром.

            2Мониторинг за  концентрацией фибронектина

   Слежение за  уровнем фибронектина в плазме позволяет прогно-

зировать направленность патологического процесса.  При снижении

концентрации фибронектина  до 100 мкг/мл (при норме 300 мкг/мл)

практически у всех детей развивались тяжелые токсические  синд-

ромы. Для возмещения фибронектина в терапии токсических заболе-

ваний можно использовать криопреципитат (10-15 мл на  инфузию).

Даже однократная  введение оказывает положительный эффект у 65%

больных. /7062/

               2Определение содержания серомукоида

              (Mejbaum-Kkatzenellenbogen W.,1955)

   К 0,2  мл  сыворотки  крови  добавляют 0,2 мл 0,95%  водного

раствора NaCl и 0,9 мл 0,45М сульфосалициловой кислоты. В тече-

ние 30  минут  смесь центрифугируют при 1500 об./мин.  К 0,3 мл

надосадочной жидкости дабваляют 0,6 мл физраствора и 4 мл  0,1%

водного  раствора танина,  перемешвают и помещают на 30 минут в

кипящую водяную баню.  Содержимое пробирки охлаждают и измеряют

оптическую  плотность  в кювете с длиной оптического пути 10 мм

на ФЭК при длине волны 590 нм против дистиллированной воды.

   Содержание серомукоида  в биологических жидкостях выражают в

единицах оптической плотности полученного раствора.  В норме  в

сыворотке крови  содержание  серомукоида  составляет  0,11-0,13

единиц оптической плотности.

                   2Реакция кольцепреципитации

                       определения С-РБ

   Треть капилляра заполняют антисывороткой и через этот же ко-

неч треть  - исследуемой сывороткой.  Капилляр покачивают 12-15

раз для смешивания ингредиантов и устанавливают вертикально  на

пластилиновый штатив.  оставляют 24 часа при комнатной темпера-

туре. Помутнение на границе раздела свидетельствует  о  наличии

СРБ  в  кровотоке (количество СРБ пропорционально интенсивности

деструктивных процессов в организме).

    5Результат оценивают по высоте приципитата  в  капилляре.

              2Определение концентрации фибриногена

   Гравиметрический метод.  К  1 мл плазмы крови добавляют 0,05

мл суспензии тромбопластина (10 мг/мл) для быстрого  и  полного

образования сгустка,  0,1 мл 5% раствора хлорида кальция, пере-

мешивают. Через 7-15 минут инкубации  при  37 5о 0С  образовавшийся

сгусток отжимали  до полного удаления сыворотки и взвешивали на

торсионных весах.  Полученную величину умножали на  коэффициент

0,222. Концентрацию выражали в г/л.

 ш1. 1999г. ЗАПОЛНЯТЬ ТОЛЬКО В ЛЕКЦИИ ПО НЕСПЕЦ. ФАКТОРАМ

                        Содержание БОФ

─────────────────────┬───────────────┬─────────────────────────

                     │    В норме    │  При остром воспалении

─────────────────────┼───────────────┼─────────────────────────

                     │               │

СРБ    (усл. ед.)    │70 нг/мл,т.е.  │    0,1 г/л

                     │почти нет      │

   - у новорожденных │100 нг/мл с    │

                     │постепенным    │

                     │возрастанием   │

                     │               │

Фибриноген           │2-4 г/л        │

                     │3-4 г/л        │    6-10 г/л

Гаптоглобин (Нр)     │170-300мг/л    │

                     │(70-150 мг%);  │

                     │830-2700мг/л   │

                     │0,1-0,04г%     │

                     │0,6-1,8 г/л    │    3-6 г/л

Преальбумин          │300 7+ 020 мкг/мл  │

Орозомукоид (Оm)     │550-1400 мг/л  │

                     │= мкг/мл       │

                     │0,6-0,9 г/л    │  1,5-3 г/л

Антитромбин-III      │210-300 мг/л   │

С3-компонент         │550-1200 мг/л  │

комплемента          │1,3-1,7 г/л    │  2-3 г/л /2809к/

                     │100 мг%        │

С1q-субкомпонент     │100%           │

комплемента          │               │

Трансферрин          │3030 7+ 0350 мкг/мл│

Церулоплазмин        │260 7+ 030 мкг/мл  │

                     │0,3-0,6 г/л    │  1-2 г/л

альфа-2-макроглобулин│2150 7+ 0150 мкг/мл│

                     │(500-2500 мг/л)│

альфа-1-антитрипсин  │2200 7+ 0200 мкг/мл│

─────────────────────┼───────────────┼─────────────────────────

 4альфа-1-антипротеаз- │2,5-4,0 г/л    │ 5-7 г/л

 4ный ингибитор /???/  │               │                -?

                           2Оценка ПОЛ

    2Определение активности каталазы 0. Активность каталазы опреде-

ляли в гемолизатах крови на основе способности перекиси водоро-

да образовывать окрашенных комплекс с молибдатом аммония. Инку-

бационная смесь объемом 2 мл содержала 0,03% Н 42 0О 42 0. Реакцию ини-

циировали внесением 0,1 мл гемолизата в разведении 1:1000. Про-

должительность инкубации - 10 минут.  Температура 25  градусов.

По  окончании  инкубации приливали 1 мл 4%  молибдата аммония и

измеряли поглощение при длине волны 410 нм.  Для расчета актив-

ности фермента использовали коэффициент мольной экстинции цвет-

ного комплекса Н 42 0О 42 0 и молибдата аммония - 10 52 0  М 5-1 0см 5-1 0.  Актив-

ность каталазы выражали в ммолях Н 42 0О 42 0 с 5-1 0л 5-1 0.

    2Определение содержани МДА 0. МДА определяли в цельной крови по

цветной реакции с ТБК (Бородин Е.А.,Арчаков А.И.,1987).  К 1 мл

образца добавляли 1 мл 30%  ТХУ  и  центрифугировали  при  3000

об./мин.  в  течение 10 минут.  К надосадку приливали 1 мл 0,8%

ТБК и ставили на кипящую водяную баню на 15 минут. По окончанию

инкубации пробирки охлаждали, приливали 1 мл хлороформа и цент-

рифугировали при 3000 об./мин.  в течение 5 минут для  удаления

мутости. Верхнюю окраенную фазу осторожно переносили в кювету и

измеряли светопоглощение при 532 нм. При расчете содержания МДА

в  пробе  использовали  коэффициент мольной экстинции 1,56х10 5-5

М 5-1 0см 5-1 0. Содержание МДА выражали в наномолях на 1 мл крови.

    2Определение диеновых конъюгатов 0.  0,1 мл спиртового раствора

липидов вноили в кювету спектрофотометра СФ-16, в которой нахо-

дились 2,9 мл абсолютного спирта. Оптическую плотность измеряли

при длине волны 233 нм с ходом луча 10 мм.  Для перерасчета ис-

пользовали  коэффициетн  мольной  экстинции  2,2х10 5-5 0   М 5-1 0см 5-1

(Стальная  И.Д.,1977).  Величину диеновых конъюгатов выражали в

наномолях на 1 мл крови.

    2Определение гидроперекисей липидов 0.  Количество гидропереки-

сей липидов определяли на основе их способности  окислять  ионы

Fe 52+  0c  последующей реакцией на Fe 53+ 0 с тиоцианатом аммония (Ро-

манова Л.А.,  Стальная И.Д.,1977 в  модификации  Е.А.Бородина).

Для расчета  содержания гидроперекисей использовали коэффициент

мольной экстинции образующегося цветного комплекса Fe[Fe(CNS)] 46

при 490  нм  1,1х10 55  0М 5-1 0см 5-1 0,  а в расчете на ион Fe 53+ 0 0,55х10 55

М 5-1 0см 5-1 0 (Бородин Е.А.  и соавт.,1992).  Величину гидроперекисей

выражали в наномолях на мл крови.

    2Определение окисляемости сыворотки крови 0. Окисляемость сыво-

ротки крови изучали по степени накопления МДА при индукции Fe 52+

аскорбат-зависимого или НАДФН-зависимого  ПОЛ  в  инкубационной

смеси объемом  1  мл,  содержащей 12 мкМ Fe 52+ 0;  0,8 мМ аскорбат

(или 1 мМ НАДФН);  0,2 мМ пирофосфат натрия; 50 мМ трис-НСl бу-

фер, рН 7,4;  0,1 мл сыворотки крови и выражали в наномолях МДА

мин 5-1 0мл 5-1 0 сыворотки крови.

    2Определение антиокислительной   0(антиоксидантной)   2активности

 2(АОА) крови 0.  АОА сыворотки крови оценивали в условиях in vitro

по их  способности  тормозить  аскорбат (НАДФН)-зависимое ПОЛ в

суспензии микросом (М.А.Штарберг,1996) и выражали в  процентах.

Опытная инкубационная  смесь  объемом 1 мл содержала 0,8 мМ ас-

корбат (или 1 мМ  НАДФН);  0,2  мМ  пирофосфат  натрия;  50  мМ

трис-НCl буфер, рН 7,4; 0,5 мг фосфолипида микросом, 0,1 мл сы-

воротки крови. ПОЛ инициировали внесением ионов 5  0Fe 52+ 0 в конечной

концентрации 12 мкМ.  Контрольная проба аналогичного состава не

содержала сыворотки крови. АОА рассчитывали по формуле:

          МДА 5  4контроль  0- МДА 4 опыт

   АОА = ──────────────────────── 4─ 0 х 100%.

                МДА 4 контроль

    2Определение токсигенной зернистости нейтрофилов 0. Токсигенную

зернистость изучали с иммерсионной системой микроскопа в препа-

ратах крови,  окрашенных по Паппенгейму,  Нохту.  В сравнении с

нейтрофильной зернистостью  нормальных  лейкоцитов  она   более

крупная и  интенсивнее  окрашивается.  Учет ведут суъектвино по

количеству гранул, их размерам и интенсивности окраски: (-) или

(+) (Ронин В.С., Старобинец Г.М.,1989).

    2Парамецийный тест 0.

   Сущность методы оценки токсичности биологических жидкостей с

парамецийным тестом (Пафомова Г.А. и соавт. /1980/ с добавлени-

ем условий  по Нифантьеву О.Е.  и соавт.  /1988/) заключается в

измерении времени жизнеспособности парамеций (инфузорий) - "па-

рамецийного времени" в присутствии токсического фактора,  нахо-

дящегося в биологической жидкости.  В качестве контроля опреде-

ляли время  выживаемости инфузорий в присутствии плазмы или сы-

воротки крови здоровых людей. 0,01 мл исследуемой биологической

жидкости и столько же взвеси,  содержащей от 8 до 10 парамеций,

тщательно перемешивали и под увеличением объектива в 25 раз оп-

ределяли время  полной гибели парамеций.  Образец исследовали 3

раза и использовали средние данные.  С целью повышения точности

способа использовали 11-15-суточную культуру парамеций.

    _Проверка дефицита Se в организме .: кончики пальцев рук проте-

реть спиртом,  затем 7,5% Н 42 0О 42 0. Если кожа побелеет, то дефицит.

/со слов проф. М.А.Джулай/

              2Определение бактерицидной  активности

                         2сыворотки (БАС)

         (= комплемент, + лизоцим, + катионные белки)

   В пробирки  с  2,5 мл стерильного бульона Кольбака добавляют

по 0,5мл испытуемой сыворотки.  Затем микропипеткой во все про-

бирки  вносятпо  0,1  мл 24-часовой бульонной культуры кишечной

палочки.  Содержимое пробирок тщательно перемешивают и отбирают

1,5  мл  для нефелометрического измерения оптической плотности.

Смесь, оставшуюся в пробирках, помещают в термостат при 37 50 0С на

3  часа.  (Расчет бактерицидной активности в процентах произво-

дится по ниже описанной формуле.) Таким образом,  удается снять

2  показателя:  первый  -  характеризующий  исходную оптическую

плотность бульона с культурой и сывороткой сразу  после  смеше-

ния, и второй - регистрирующий оптическую плотность той же сме-

си после 3-часовой инкубации смеси в термостате.

   (Д опыта через 3 часа - Д опыта сразу) х 100

   ───────────────────────────────────────────── =

   (Д контроля через 3 часа - Д контроля сразу)

     (0,18 -0,163) х 100

   = ──────────────────── = 7,8%

        0,312 - 0,095

             2Биологический метод - парамецийный тест

   Сущность метода заключается в измерении времени жизнеспособ-

ности парамеций (инфузорий) -"парамецийного времени" в присутс-

твии токсического фактора, находящегося в биологической жидкос-

ти. В качестве контроля определяют время выживаемости инфузорий

в присутствии  плазмы или сыворотки крови здоровых людей.  0,01

мл исследуемой биологической жидкости и столько же взвеси,  со-

держащей от  8  до  10 парамеций,  тщательно перемешивают и под

увеличением объектива в 25 раз определяют время  полной  гибели

парамеций.Образец исследуют  3  раза и расчитывают средние дан-

ные. С целью повышения точности способа используют 11-15 суточ-

ную культуру  парамеций.  время  жизнеспособности парамеций при

добавлении к их культуре биологической жидкости здоровых  людей

составляет 25-30  минут  (106,137,47-ЛИИ - лейкоцитарный индекс

интоксикации)

       2Определение содержания МСМ в сыворотке крови, лимфе

                           (молекулы средней массы)

   Принцип метода  основан на осаждении белков исследуемой жид-

кости 10%  р-ром ТХУ с последующим центрифугированием при  3000

об/мин в течении20 мин. и определением поглощения супернатанта,

в 10 раз разведенного дистиллированной водой,  (при длине волны

280 нм)  против воды.  Сдержание МСМ выражают в условных едини-

цах, соответствующих величине оптической плотности разведенного

супернатанта. В  норме  количество МСМ составляет 0,260,280 ус-

ловных единиц (24, 102)

          2Определение общей протеолитической активности 0

   В кювету спектрофотометра вносили 0,03 мл цельной  сыворотки

крови, 1,97 мл 0,05М трис НС1 буфера и 1,0 мл 1,5*10  5-3 0М БАЭЭ в

этом буфере,  перемешивали. Оптическую плотность измеряли в те-

чении 30 мин. через каждые 10 мин при длине волны 253 нм против

раствора не содержащего сыворотку крови.  Протеолитическую  ак-

тивность выражали в МЕ/мл. (100)

                  2Оценка активности катепсина D 0

   Определение количества кислоторастворимых продуктов фермент-

ного гидрролиза гемоглобина (6).  Инкубационная смесь содержала

0,5 мл сыворотки крови,  0,5 мл 0,2М ацетатного буфера и 0,2 мл

0,3% раствора гемоглобина в ацетатном буфере. Продолжительность

инкубации60 мин. t=45 50 0 С. По окончании инкубации приливали 4 мл

3% ТХУ  (трихлоруксусная  кислота),  замеряли  при  длине волны

280нм. Содержание катепсина Д выражается в условных единицах.

         2Определение содержания альфа-1-АТ и альфа-2-МГ

   Способ определения  альфа-1-АТ  и альфа-2-МГ в плазме (сыво-

ротке) крови основан на различном механизме взаимодействия их с

трипсином при использовании в качестве субстрата БАЭЭ (N-бензо-

ил-L-аргинин этиловый спирт)1.  Альфа-1-АТ образует с  трипсином

комплекс,  неспособный гидролизовать комплекс БАЭЭ. Поэтому его

активность оценивается по торможению БАЭЭ-эстеразной активности

трипсина сывороткой крови.

   В кюветах  спектрофотометра  готовили  контрольную и опытную

пробы. Опытная проба содержала 1,9 мл 0,005 М трис  НС1  буфера

(рн 8,0),  0,1 мл разведенной в 50 раз сыворотки крови и 0,1 мл

0,1% раствора трипсина. Контрольная проба содержала 2 мл 0,05 М

трис НС1 буфера (рн8,0) и 0,1мл 0,1% раствора трипсина. Инкуби-

ровали при t=25 50 0 5 мин и добавлялти по 1 мл 1,5мМ раствора  БА-

ЭЭ. Быстро перемешивали и измеряли прирост оптической плотности

растворов при длине волны 253 нм против контроля.Отсчеты  произ-

водили каждую  минуту  в течении 5 мин.  При расчете активности

фермента использовали разность средних значений прироста актив-

ности за 1 мин. Активность альфа-1-АТ выражается в ИЕ/мл.

   Альфа-2-МГ образует с трипсином комплекс,  сохраняющий  спо-

собность к  гидролизу  БАЭЭ  с  сывороткой  крови и последующей

инактивацией несвязавшегося с альфа-2-МГ трипсина соевым  инги-

битором трипсина (86). В кювету спектрофотометра вносили 1,75мл

0,05М трис НС1 буфера,  рн 8,0, 0,1 мл разведенной в 10 раз сы-

воротки крови  и 0,05МЛ 0,1%  раствора трипсина .Инкубировали 5

мин при t=25 50 0С, добавляли0,1 мл 0,3% раствора ингибитора из бо-

бов сои,  перемешивали и инкубировали 5 мин.  Затем добавляли 1

мл 1,5 мМ раствора БАЭЭ,  пробу перемешивали и измеряли прирост

оптической плотности при длине волны 253 нм через 2 мин в тече-

нии 10 мин против контрольной пробы, содержащей только реактивы

(2мл 0,05М трис НС1 буфера, рн8,0 и 1 мл 1,5мМ раствора БАЭЭ)

расчета активности фермента использовали среднее значение  при-

роста оптической плотности за 1 мин.  Активность альфа-2-МГ вы-

ражали в ИЕ/мл сыворотки крови.

                 3Оценка фагоцитарной активности 0

                   5(+ см. материал 1-2 лекции)

    1Фагоцитарный индекс 0 - среднее количество частиц или микробов

                         в одном фагоците (норма 3-8).

    1Фагоцитарное  0ч 1исло 0  - количество фагоцитов, участвующих в фа-

                         гоцитозе (норма 60-80%).

    5Оценка показателей через разные промежутки времени позволяет

 5оценить динамику фагоцитоза.  В норме через 90 минут фагоцитар-

 5ный индекс должен быть ниже, чем через 45 и 60 минут, в связи в

 5перевариванием микробов.  При нарушении переваривания он не ме-

 5няется. /2551к/

    _Переваривание микробов . можно оценивать путем посева  лизатов

лейкоцитов на  питательные  среды  и подсчета выросших колоний.

Метод предполагает использование в качестве объекта  фагоцитоза

живых микроорганизмов. После инкубирования с микробами фагоциты

осаждают центрифугированием,  омывают и лизируют. Их лизаты вы-

севают на твердую питательную среду.  Переваривающую активность

фагоцитов оценивают по числу выросших колоний. /2551к/

    _Метаболическую активность фагоцитов . определяют после окраски

их 0,25%  раствором нитросинего тетразолия.  В норме метахрома-

тично (диффузно  и  в  виде глыбок голубого цвета) окрашивается

15-18% нейтрофилов, при инфекциях их число увеличивается до 40%

и более. /2551к/

   Показатели фагоцитоза снижаются при иммунодефицитах, повыша-

ются  при благоприятном течении инфекции. /2551к/

                2Оценка комплементарной активности

   1)  3Общая  гемолитическая  активность комплемента 0 должна быть

                         100 _+ .20% от уровня здоровых доноров.

   Степень гемолиза  можно определить фотометрически (с помощью

нефелометра, спектрофотометра,  фотоколориметра) или  визуально

путем сравнения  интенсивности  гемолиза в опытных пробирках со

стандартной шкалой лизированных эритроцитов. /2551к/

   2) Уровень отдельных компонентов 4 можно оценить по  реагентам

 4(R)  по  степени компенсации отсутствующего в них белка при до-

 4бавлении сыворотки больных.  (R1 - cыворотка с дефицитом компо-

 4нента С1, 0

  4R2 - сыворотка с дефицитом компонента С2,

  4R3 - - " - С3,

  4R4 - - " - С4 и т.д.)

    _В сыворотке крови

   С1q - 190 мг/л,

   С1s - 120

   С2  -  30

   С4  - 430

   С3  -1300

   С5  -  75

   С6  -  60

   С7  -  55

   С8  -  60

   С9  - 160

 ф. Р  -  25

 ф. В  - 240

С1-In  - 180 мг/л. /2551к/

   3) Выявление отдельных продуктов активации - С5а (по степени

агрегации лейкоцитов), С4а, С3а, С3в, С2в-кинина  и др.

   4) Определение комплемент-связывающих рецепторов на лейкоци-

тах (CR1, CR2, CR3). /2551к/

                       2ОБЩАЯ ИММУНОГРАММА 0

              2┌─────── Специфическая защита ───────┐

             │                                    │

        Гуморальная                           Клеточная

        - АТ                                  - Тк

    5Различают следующие степени иммунитета:

    51. полная восприимчивость инфекции (100% гибель);

    52. Слабый иммунитет;

    53. умеренный иммунитет;

    54. сильный иммунитет (летальных случаев нет);

    55. полный иммунитет (абсолютная резистентность)./261/66/

    5Широкая вариабельность показателей иммунитета,  изменчивость

 5в течение года не всегда позволяет полно оценить картину систе-

 5мы иммунитета. /1677к/

    5Вторичный ИО на экзогенные АГ не отражает состояния иммунной

 5системы. Для оценки иммунного статуса необходима  информация  о

 5первичных гуморальных   или   клеточных  реакциях  на  антиген.

 5/7576/84/

                     2НОРМАЛЬНАЯ ИММУНОГРАММА

    2Общее количество лейкоцитов - 4-9 0  2тыс./мкл

    5Подсчет в камере Горяева (25 больших квадратов)

           5N х 4000 х 20 (разведение)         N х 1000

    5L = ────────────────────────────────  = ─────────── = N х 200

                   525 х 16                       5

   N должно быть от 20 (4 тыс.) до 40 (8 тыс.).

    2Лейкоцитарная формула: 0   Размер

   Нейтрофилов - 50-60%     10-12 мк

   Эозинофилов - 3-5        12-17 мк

   Базофилов - 0,5-1        10-12 мк

   Моноцитов - 5-8          12-15 мк (тканевые - больше)

   Лимфоцитов - 25-35%      7-8 мк малые; около 12 мк - большие

                            (тканевые лимфоциты - еще больше)

                            Эритроциты - 7 _+ .0,5 мк

                            Тромбоциты - 2(-4) мк

     [ 5ПОЛ на стекле --- лимфоцитоз 0]

    5Лимфоцитов от 25% (т.е. от 1000 до 2250 мкл-1)

               5до 35% (т.е. от 1200 до 3000 мкл-1).

    5Подсчет абсолютного количества лимфоцитов у больного:

    5Например, общее количество лейкоцитов - 5 тыс/мкл,

              5количество лимфоцитов в лейкоцитарной формуле - 20%

              5(=относительное количество лимфоцитов);

              5Абсолютное количество - 20% от 5 тыс, т.е. 1 тысяча

              5в 1 мкл. Вывод: меньше нормы.

Количество лимфоцитов - 1800-3200 мкл 5-1 0, (800-3600 в мкл);

                      - 25-35%  (20-26%  /2551к/) всех лейкоци-

                        тов.

 _В крови В-лимфоцитов - 15% .  /2338к/94/ (15-25%);  CD19+, CD22+,

                       CD72 5+ 0-клетки - 10-15% (В-клетки);

                       (CD72+ -клетки - 30-35%) - ???

         _Т-лимфоцитов - 60% ., из них Тх - 20% 1  0(CD4 5+ 0-клетки-36-42%)

                                   Тs - 12% (CD8 5+ 0-клетки-28-35%

                                        = Тs + Тк)

                       CD3 5+ 0-клетки - 55-70% (общие Т-лимфоциты)

         _О-лимфоцитов - 25% . /2338к/94/, (10%)

 _Т-лимфоциты .:

  - CD 3 - 600-2500 (1000-1400) мкл 5-1 0 (в среднем 1400);

  - в тесте розеткообразующих клеток  (Е-РОК)  Т 4общие 0  (=То)  -

    50-60 (50-70%, 40-90)% от общего количества лимфоцитов;

  - CD2+, CD3+ - 70-85% /2551к/98/

  - Та-лимфоциты (Т 4активные 0=Та) - 700-1100 мкл 5-1 0 или 25-35%;

    Для выявления активированных Т-лимфоцитов определяют рецеп-

    тор  к  ИЛ-2 (CD25),  HLA DR-антигены и CD 71 (рецептор для

    трансферрина).

 _Тх-лимфоциты . (CD4+) - 700-1100 мкл 5-1 0 (930);

  - Теофиллин-резистентные Е-РОК  (Тх)  - 50-63%.

  - CD4+ - 35-48% /2551к/98/

    При снижении Тх до 200 - СПИД  прогрессирует;

    < 150 - присоединение вторичной инфекции (сепсис).

 _Тs-лимфоциты . (CD 8+) - 300-500 мкл 5-1 0 (500);

   - CD8+ - 18-25%  /2551к/98/

   = Теофиллин-чувствительные Е-РОК  (Тs)  - 17-20%

Соотношение Тх/Тs (= CD4+/CD8+) - 2,0-2,5 (1,5-2,5$ 1,4-2,0);

   - При СПИДе соотношение уменьшается до 0,04.

   - При аутоиммунных и аллергических заболеваниях индекс боль-

     ше 2,0. /2551к/98/

 _В-лимфоциты . (CD 19,CD22, CD72)- 350-500 (100-900;600-800) мкл 5-1

            или 15-25 (10-30)% /?/  (в тесте В-РОК=ЕАС-РОК)

 _Иммуноглобулины сыворотки крови

- Ig M  -  1-2  (0,35-3; 0,2-2) г/л или мг/мл

- Ig G  - 11-15 (8-13, до 20 - у пожилых лиц) г/л или мг/мл

- Ig A  -  1-3  (0,4-4,4; 1,4-3) г/л или мг/мл

  У новорожденных уровень Ig G близок к материнскому, Ig M и Ig

A имеются  в следовых концентрациях.  К 4-6 месяцу уровень Ig G

падает до 5-6 г/л, а затем увеличивается. При нормальном разви-

тии уровень иммуноглобулинов к 2 годам у детей близок величинам

их у взрослых. /2551к/98/

-  4Разброс значений Ig E (0-386 кЕ/л) не позволяет рекомендовать

   4этот тест для диагностики атопии. /1676к/

   При иммунодефицитах (ИД) уровень Ig снижается,  а при стиму-

ляции ИС и воспалении - повышается. /2551к/

                Иммуноглобулины сыворотки крови

────────┬───────┬────────┬────────────────┬─────────┬──────────

Классы  │ МЕ/мл │  мг/мл │     мг%        │   г/л   │В слюне

────────┼───────┼────────┼────────────────┼─────────┼──────────

Ig G    │130-160│  11-15 │  1800-1800 (1200) 0│12,8 7+ 00,54│0,06 7+ 00,01

- Ig G1 │       │        │                │2,61-10,8│г/л

- Ig G2 │       │        │                │1,12-4,08│

- Ig G3 │       │        │                │0,22-2,88│

- Ig G4 │       │        │                │0,05-1,56│

Ig M    │110-150│ 0,5-2,0│  1 60-200  (120) 0 │ 1,3 7+ 00,1 │0 г/л

Ig A    │ 90-150│   1-3  │  1 90-450  (400) 0 │ 1,6 7+ 00,7 │0,03-0,4

        │       │        │                │         │г/л

        │       │        │                │         │= sIg A

 1Ig E     0│ 1        0│ 1         0│ 10,006-0,6(<0,5) 0 │         │

75,9 7+ 09,3 КИ/л   │        │                │         │

 1Ig D     0│ 130,9 6+ 14,0         0│ 1 0,3-40     (3) 0 │         │

        │ 1 МЕ/л-?│ 0        │                │         │

────────┴───────┴────────┴────────────────┴─────────┴──────────

              Иммуноглобулины слюны /1652к и др./

───────────────────────────────────────────────────────────────

   Классы  │ МЕ/мл │  мг/мл │     мг%        │   г/л   │ КИ/л

───────────────────────────────────────────────────────────────

   Ig G    │                                 │0,06 7+ 00,01│

   Ig M    │                                 │0        │

   Ig A    │                                 │0,07 7+ 00,01│

  sIg A    │                                 │0,72 7+ 00,05│

───────────────────────────────────────────────────────────────

   Определение уровня  иммуноглобулинов не всегда полезно.  Для

иммунной защиты имеет значение количество  специфических  анти-

тел, а не общая концентрация иммуноглобулинов сыворотки.

       Антитоксические и антимикробные антитела /1652к/

───────────────────┬─────────────────┬─────────────────────────

   Виды антител    │    по РПГА      │         по РА

───────────────────┼─────────────────┼─────────────────────────

   Дизентерийные   │                 │       3,8 7+ 0  0,5

   - Зонне         │   21,2 7+ 0  3,2    │

   Коклюшные       │  716,2 7+ 0105,2    │      90,2 7+ 0 64,4

   Дифтерийные     │  362,9 7+ 0105,7    │      43,0 7+ 0 16,1

   Стафилококковые │  969,7 7+ 0210,3    │     238,6 7+ 0128,7

   Столбнячные     │ 1823,5 7+ 0211,1    │      55,7 7+ 0 32,2

───────────────────┴─────────────────┴─────────────────────────

   Будущее покажет, что конкретные числовые значения малоинфор-

мативны и подобный подход к оценке иммунного  статуса  неверен.

Нормальное  количество В-лимфоцитов может обеспечиваться совер-

шенно разными сочетаниями АГ-специализированных  клеток.  Повы-

шенное количество Тх еще ничего не значит, если не хватает мак-

рофагов и т.д.  Наоборот,  малое число Тх может быть идеальным,

если снижены Тs. /2338к-5/ Иммунная система имеет территориаль-

ные особенности, поэтому показатели кровотока могут не отражать

процессы, происходящие в конкретном больном органе.   5Для ИС ха-

 5рактерна высокая мобильность, связанная с тем, что все ее глав-

 5ные  компоненты практически всегда находятся (или рабочем) сос-

 5тоянии и определенный  уровень  активации,  вероятно,  является

 5нормальным состоянием ИС.  В 1987г. Р.В.Петровым сформулирована

 5концепция иммунологических мобилей, сущность которой заключает-

 5ся в том,  что под влиянием АГ-ых и неАГ-ых воздействий, непре-

 5рывно поступающих во внутреннюю среду организма или в нем  воз-

 5никающих,  ИС  постоянно  меняет  свой облик,  постоянно меняет

 5уровни своих составных частей (Тх,Тs, контрсупрессоров и т.д.).

 5Поступивший в организм АГ-ый стимул выводит из равновесия прак-

 5тически всю ИС, и она будет "возмущена" до тех пор, пока не пе-

 5рейдет в новое равновесное состояние. Это состояние сохраняется

 5лишь до тех пор, пока другой стимул не поступит или не возника-

 5ет в организме.  А так как антигенные стимулы поступают в орга-

 5низм непрерывно,  то очевидно, что ИС непрерывно меняется и на-

 5ходится в движении. В свете концепции иммунологических мобилей,

 5а также на многоступенчатом уровне  регуляции  иммунологических

 5процессов  по-новому встает вопрос о нормативных параметрах ИС.

 5/2338к/94/ 0 В свете этих особенностей функционирования иммуните-

та возможны такие ситуации, когда развиваются изменения или на-

рушения в ИС,  которые практически никогда не ведут к возникно-

вению иммунопатологических процессов, так как другие компоненты

этой системы берут на себя функции нарушенной структуры. Приме-

ром  являются  случаи селективного дефицита Ig A при полном от-

сутствии каких-либо иммунопатологических проявлений. /2338к/94/

С другой стороны, возможно наличие патологического процесса без

видимых нарушений в иммунной системе. /2338к/94/

    5В 1987г.  американский иммунолог R.Hong разработал трехэтап-

 5ную систему  оценки  ИС. 0   5Р.В.Петровым создан 2-этапный принцип

 5оценки иммунного статуса. 0

    _Выделяют 3 уровня иммунологических тестов .:

    31. Первый  уровень. 0  Первый  этап предназначен для выявления

"грубых" дефектов иммунитета с помощью ориентировочных  тестов.

   - Определение лейкоцитарной формулы и общего количества лей-

коцитов в периферической крови.

   - Подсчет  относительного  и  абсолютного  количества  Т-  и

     В-лимфоцитов.

   - Определение уровня иммуноглобулинов и их субклассов. Изме-

рение концентрации Ig G, Ig M, Ig A (дефицит Ig A может не соп-

ровождаться патологией. /2338к/94/)

   - Оценка специфического гуморального ответа  (иммунизация  с

последующим определением уровня АТ).

   - Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов.

   - Определение активности системы комплемента.

   - Кожные тесты.

   - Определение морфологиии лимфоцитов.

   - Рентгенография  и рентгеноскопия лимфоидных органов.

    32. Второй  уровень. 0  /6812/84/ Тесты 2 уровня обозначают как

аналитические.  К ним могут относиться практически  все  тесты,

позволяющие оценить функциональную активность клеток.

   - Определение уровня цитокинов (фактора,  ингибирующего миг-

рацию макрофагов /МИФ/,  интерлейкинов,  ФНО и др.) в крови и в

других биологических жидкостях.

   - Анализ  поверхностных  маркеров  субпопуляций   лимфоцитов

     (CD-АГ)

     -- субпопуляций Т-лимфоцитов (хелперы,  супрессоры, эффек-

        торы);

     -- опредение  поверхностных   иммуноглобулинов   различных

        классов на В-лимфоцитах;

     -- количественное определение ЕКК.

   - Оценка  развития клеточного и гуморального иммунного отве-

     та.

   - Определение функциональной  активности  клеток ИС

     -- анализ пролиферативного ответа мононуклеарных клеток на

Т- и В-митогены и специфические антигены  (реакция  бласттранс-

формации на митогены: ФГА, Кон А, ЛПС, митоген лаконоса; на ми-

тогены в СКЛ),

     -- оценка функциональной активности В-клеток (фенотип, по-

ликлональная активация,  продукция иммуноглобулинов в  культуре

in vitro, антиген-специфическая стимуляция, иммунизация убитыми

вирусными вакцинами, гемоцианином или бактериофагом ФХ 174),

     -- анализ цитотоксичности (NK-клетки, Т-киллеры).

        --- определение активности ЕКК;

        --- оценка функциональной активности Т-клеток (фенотип,

поликлональная  активация  митогенами,  антигенами  в смешанной

культуре лимфоцитов /СКЛ/,  тесты Т-хелперной и  Т-супрессорной

активности, антиген-специфический ответ, цитотоксическая актив-

ность,  кожные тесты ГЗТ на туберкулин, стрептокиназу, кандидин

и пр.);

     -- оценка  функциональной активности макрофагов (адгезии и

хемотаксиса,  стадий фагоцитоза и его завершенности, внутрикле-

точной  инактивация  Staphylococcus aureus,  тест кожного окна,

хемилюминесценции).

   - Количественное определение отдельных  компонентов  компле-

     мента (субкомпонента С1q, С3, С6-С8).

   - Оценка  миграционной  активности  лейкоцитов  (макрофагов,

нейтрофилов, лимфоцитов). Анализ молекул адгезии.

     -- тест торможения миграции лейкоцитов на ФГА.

    5- Оценка HLA.

    33. Третий уровень.

   - Генетический и цитологический анализ хромосомного материа-

ла.

   - Определение ферментов лимфоцитов (аденозиндезаминаза,  пи-

риннуклеозидфосфорилаза), ассоциированных с иммунодефицитами.

   - Анализ смешанных клеточных культур с целью определения им-

муноглобулин-продуцирующей функции В-лимфоцитов.

   - Гистохимический анализ лимфоидных органов.

    Хорошо диагносцируются первичные (врожденные) иммунодефици-

ты, вторичные четко регистрируются при хронических патологичес-

ких состояниях.

   В настоящее  время нет достаточно универсального набора тес-

тов для оценки первичных и вторичных иммунодефицитов. /6812/84/

   Определение уровня  иммуноглобулинов не всегда полезно.  Для

иммунной защиты имеет значение количество  специфических  анти-

тел, а не общая концентрация иммуноглобулинов сыворотки.

───────────────────────────────────────────────────────────────

               3РАЗДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

            (для изучения функциональной активности,

                      определения HLA-АГ)

   Принципы разделения:

   По различным   адгезивным   способностям  (АГ-предентирующие

клетки - моноциты и В-лимфоциты адгезируют к твердым поверхнос-

тям):

   - к стеклу (стеклянным бусам),  клетки отделяют от  сорбента

встряхиванием),

   - найлоновая вата в шприце (В-лимфоциты снимают  5-6-кратным

сдавлением ваты поршнем шприца)

   - сефадекс.

    2Аффинная хроматография 0  основана  на  избирательной  сорбции

клеток различных субпопуляций к носителю, содержащему вещества,

к  которым  клетки  данной  субпопуляции имеют высокое сродство

(АГ, мембранные Ig,  через "пришитые" FcR,  белок А стафилокок-

ков, CR1).

   -  4Желатин смешивают с АГ,  покрывают центрифужные пробирки +

 4суспензию  лимфоцитов.  С АГ связываются АОК --- нагрев до 37оС

 4выход АОК. 0

    4- Эритроциты  нагружают  белком  А  стафилококка + суспензия

 4лимфоцитов --- связывание зрелых В-лимфоцитов. Элюция гипотони-

 4ческим раствором или лизостафином.

    4- Монослой эритроцитов,  нагруженных ИК + суспензия лимфоци-

 4тов. Свободные В-лимфоциты получают гипотоническим шоком.

    4- Через CR1 В-лимфоцитов  (на сефарозе-С3)

   - Аффинная  хроматография  на  колонках с лектинами;  элюция

раствором углевода,  по отношению к которому лектин  специфичен

(отделение агглютинированных клеток центрифугированием). Связы-

вание лектина Helix pomatia Т-лимфоцитами  на  колонке  (лектин

связывает обработанные нейраминидазой Т-лимфоциты); Клетки элю-

ируют N-ацетил-D-галактозамином.

   Очищенные Т-лимфоциты можно получить путем отрицательной се-

лекции HLA-DR положительных клеток (т.е.  В-лимфоцитов), разру-

шая их соответственно антисывороткой и комплементом.

          Распределение Т- и В-лимфоцитов в организме

                      и их характеристика

──────────────────────┬───────────────────┬────────────────────

   Показатель         │    Т-лимфоциты    │    В-лимфоциты

──────────────────────┼───────────────────┼────────────────────

Источник              │Костный мозг       │Костный мозг

Место формирования    │Тимус              │Красный костный мозг

                      │                   │Группы    лимфоидных

                      │                   │фолликулов

 1Распределение 0, % 1: 0     │                   │

Красный костный мозг  │      0            │      15

Тимус                 │    100 (тимоциты) │       0 (0,3)

ЛУ                    │     60 (65)       │      20 (21)

Пейеровы бляшки       │     30            │      60

Селезенка             │     30 (35)       │      60 (42)

Кровь                 │     60            │      20 (15)

Лимфа                 │     85            │      15

                      │                   │

Наличие АГ            │ CD4+,CD8+         │     CD19+ и др.

                      │                   │

HLA                   │ I  класса         │     I и II классов

─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ │ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ │ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─

Локализация           │                   │

- в ЛУ                │Паракортикальная   │Центры размножения

                      │зона,              │(зародышевые центры),

                      │перифолликулярное  │медуллярные тяжи

                      │пространство       │

- в селезенке         │Белая пульпа, окру-│Красная пульпа,

                      │жающая артериолы   │центры размножения

- в пейеровых         │Перифолликулярная  │Центр фолликула

бляшках               │зона               │

Рециркуляция          │                   │

в организме           │Быстрая            │Менее быстрая

Продолжительность     │                   │

жизни                 │Месяцы             │Недели

                      │                   │

Поверхность           │Гладкая            │Ворсинчатая

                      │                   │

 2Рецепторы к ЭБ 0 (Е-РОК)│                   │

(эритроцитам барана=Е)│         +         │          -

 2Рецепторы к С3в 0       │                   │

(ЕАС-РОК)             │         -         │          +

 2FcR                    0│ 2         -          0│ 2          +

Стимуляция синтеза ДНК│                   │

- митогены микробного происхождения       │

   - ЛПС Г- бактерий  │         -         │          +

   - туберкулин       │         - /?/     │          + /2551к/98/

- митогены животного происхождения        │

   - анти-Ig          │         -         │          +

   - смешанная культура                   │

     лимфоцитов (СКЛ) │         -         │      + (АПК на HLA)

- митогены растительного происхождения (лектины)

   - ФГА              │     +(для Тs)     │          -

   - Кон А            │     +(для Тs)     │          -

    _- митоген лаконоса  .│ _         +          .│ _          +

    5- джекалин          0│ 5         +          0│ 5 связывает Ig A

                      │                   │  5(используется для

                      │                   │  5выделения В-клеток

                      │                   │  5на колонке)

Связывание лектина    │                   │

Helix pomatia         │         +         │          -

                      │                   │

Чувствительность      │                   │

к кортикостероидам    │Высокая            │Низкая (Л 496 0)

                      │                   │

Функции               1.Участие в реакциях│1.АТ--образование

                      │ клеточного типа   │2.Регуляция ИО

                      │ (Тк)              │  (В-лимфоциты- АПК

                      2.Иммунорегуляторная│  = АГ-презентирую-

                      │ (Тх, Тs)          │  щие клетки)

──────────────────────┴───────────────────┴────────────────────

   3а. Д-лимфоциты  -  двойные лимфоциты,  несущие на своей по-

                       верхности маркеры Т- и В-лимфоцитов.

              ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

            (количественный аспект; без разделения)

             5I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

                5МЕТОДОМ МЕМБРАНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ /метод МИФ/

   Анализ поверхностных маркеров субпопуляций лимфоцитов,

(хелперы, супрессоры, эффекторы).

1ЕКК (CD3- _CD56+ .),

В-клетки (СD19+)

Т-лимфоциты ( _ 2СD3+ . 0,CD56-) 1 - Образует комплекс с рецептором для АГ.

Тх - CD4+

Ts,Tk - CD8+.

   Выделение лимфоцитов на фиколе --- мазок --- высушивание ---

фиксация --- обработка МАТ к определенному АГ --- обработка ан-

тисывороткой к  МАТ (к Fc-фрагменту),  меченых флюорохромом ---

микроскопия под люминисцентным микроскопом.

   (Или в пробирке смешать суспензию лимфоцитов с МАТ --- мазок)

        _Определение субпопуляции лимфоцитов с помощью МАТ

    (моноклональных антител) методом непрямой поверхностной

                      иммунофлуоресценции

   Для постановки этой реакции в центрифужную стеклянную пробир-

ку вносят  500  тысяч  лимфоцитов,  выделенных  в  градиенте фи-

колл-верографин. К 30 мкл суспензии клеток добавляют 20 мкл  го-

тового коммерческого раствора МАТ,  осторожно перемешивали и ин-

кубировали в течение 30 минут при комнатной  температуре.  После

инкубации к лимфоцитам добавляли 1 мл раствора Хенкса, перемеши-

вали легким покачиванием пробирки и центрифугировали 2 - 3 мину-

ты при 1200 об./мин.  Надосадочную жидкость осторожно сливали, а

оставшиеся капли среды убирали фильтровальными полосками.

   В пробирку  к отмытым клеткам вносят 20 мкл вторых (антимыши-

ных) антител, меченных ФИТЦ (FITC anti Mi), нежно перемешивают и

помещают в рефрижератор при 4 5о 0С на 30 минут.  После реакции лим-

фоциты дважды отмывают раствором Хенкса и к осадку клеток добав-

ляют 50 мкл того же раствора, клетки ресуспендируют легким пока-

чиванием пробирки.  Суспензию клеток переносят в лунки парафилма

на сухое предметное стекло, предварительно обработанное в 0,005%

растворе poly-L-lysine (Sigma),  и инкубируют там в  течение  20

мин при комнатной температуре. После адгезии клеток к стеклу ос-

торожно полосками фильтровальной бумаги убирали среду и  вносили

по 20 мкл 50%-го раствора глицерина.  При люминесцентной микрос-

копии использовали объектив микроскопа х90,  окуляр х10.  Оценку

реакции осуществляли по проценту светящихся клеток.

             Характеристика моноклональных антител

      в реакции непрямой поверхностной иммунофлуоресценции

──────────────┬ 5──────┬──────┬─────────────── 0┬──────────────────

Моноклональное│ 5Изотип│  Клон│ Молекулярная   0│ Специфичность

  антитело    │ 5      │      │ масса антигена 0│

──────────────┼ 5──────┼──────┼─────────────── 0┼───────────────────

DT-Anti-CD 3  │ 5IgG 2a│ICO 90│ 26,20,16 кДа   0│Зрелые Т-лимфоциты

              │ 5      │      │                0│

DT-Anti-CD 4  │ 5IgG 1 │ICO 86│    56 кДа      0│Зрелые Т-хелперы/

              │ 5      │      │                0│ индукторы

              │ 5      │      │                0│

DT-Anti-CD 8  │ 5IgG 1 │ICO 31│    32 кДа      0│Супрессорные/ цито-

              │ 5      │      │                0│токсические (киллер-

              │ 5      │      │                0│ные) лимфоциты

              │ 5      │      │                0│

DT-Anti-CD 16 │ 5IgG 1 │ICO116│   50-65 кДа    0│NK-клетки, грануло-

              │ 5      │      │                0│лоциты, макрофаги

              │ 5      │      │                0│

DT-Anti-CD 22 │ 5IgG M │ICO 91│    140 кДа     0│ В-лимфоциты

              │ 5      │      │                0│

──────────────┴ 5──────┴──────┴─────────────── 0┴─────────────────────

           5II. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОГО КОЛИЧЕСТВА

               5СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ РОК

   Подсчитать относительное количество Т- и В-лифоцитов в гото-

вых мазках. Сделать заключение о наличии иммунодефицита.

               5ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ РОК

   В крови - 60-80% Е-РОК,

   в лимфе - 95%,

   в ЛУ - 65-70%,

   в селезенке - 35-40%,

   в тимусе - более 95%.

   Данный тест - мера количества, а не функциональной активнос-

ти клеток. /6504/90-?/

   CD2 - рецептор для эритроцитов барана.  При смешивании  сус-

пензии лимфоцитов  с  эритроцитами барана последние приливают к

ним, образуя т.н. "розетку". Процент розеток с эритроцитами ба-

рана /ЭБ/ по отношению к общему количеству лимфоцитов, оценива-

емое при проведении микроскопии,  отражает относительное  число

 _Т-лимфоцитов (Т-РОК . = Т-розеткообразующая клетка).

   - Теофиллин-резистентные Е-РОК  (Тх)  - 50-63%.

   - Теофиллин-чувствительные Е-РОК  (Тs)  - 17-20%.

   Количество Т-лимфоцитов (Е-РОК)

   - в крови - 60 (80)%,

   - в лимфе - 95%,

   - в ЛУ - 65-70%,

   - в селезенке - 35-40%,

   - в тимусе - более 95%.

                 ┌───┐                 ┌───┐

             CD2 4─ 0┤ 6  0Т 6  0├ 4─ 0CD2         FcR 4─ 0┤ 6  0В 6  0├ 4─ 0СR1

                 └───┘                 └───┘

    _Определение Т-лимфоцитов . осуществляли с помощью розеткообра-

зования  с эритроцитами барана (Е-РОК).  С этой целью лимфоциты

человека, взвешенные в среде 199, в концентрации 2 х 10 56 0 в 1 мл

предварительно инкубировали с исследуемыми образцами полипепти-

дов в различной конечной концентрации при температуре 37С в те-

чение 1 часа. После инкубации к 0,1 мл взвеси лимфоцитов добав-

ляли 0,1 мл 1% взвеси отмытых эритроцитов барана, центрифугиро-

вали в течение 5 минут при 1000 об/мин. После центрифугирования

осадок ресуспендировали и подсчитывали процент "активного"  ро-

зеткообразования Т-лимфоцитов с эритроцитами барана.  Для опре-

деления общего числа  Т-лимфоцитов  лимфоцитарно-эритроцитарную

взвесь оставляли при температуре 4 5о 0С в течение 2-х часов,  после

чего подсчитывали в камере  Горяева  процент  розеткообразующих

клеток.

   - Теофиллин-резистентные Е-РОК  (Тх)  - 50-63%.

   - Теофиллин-чувствительные Е-РОК  (Тs)  - 17-20%.

      _Определение В-лимфоцитов .  осуществляли с помощью розетко-

образования с  эритроцитами барана,  обработанными антителами и

комплементом.  В этом случае также лимфоциты человека, взвешен-

ные  в среде 199,  в концентрации 2 х 10 56 0 в 1 мл предварительно

инкубировали с исследуемыми образцами полипептидов в  различной

конечной концентрации  при  температуре  37 5о 0С в течение 1 часа.

После инкубации к 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляли 0,1 мл  1%

взвеси  отмытых  эритроцитов барана,  обработанных антителами и

комплементом,центрифугировали  в  течение  5  минут  при   1000

об/мин.  После центрифугирования и повторной инкубации при тем-

пературе 37 5о 0С в течение 30 мин.  осадок ресуспендировали и подс-

читывали процент розеткообразующих клеток.

   Рецептор к ЭБ имеется на тимоцитах,  Т-лимфоцитах (в перифе-

рической крови - 60-79%  Е+ клеток), тромбоцитах, гранулоцитах.

Т-лимфоциты практически все без исключения  связываются  с  ЭБ,

и в меньшй степени с эритроцитами козы, крысы, морской свинки и

кролика. При 45 5о 0 происходит обратимая утрата  рецепторов  к  ЭБ

Оптимальная температура  - 4-18 5о 0С (При 37 5о 0 число розеток снижа-

ется до 20%). /6504/90-?/

    _В-лимфоциты ., имеющие FcR и рецепторы к С3-компоненту компле-

мента (CR1), образуют розетки с эритроцитами барана, обработан-

ными антителами к ним и сывороткой мыши (как источника  компле-

мента). Также подсчитывается процент РОК  по  отношению  к  100

лимфоцитам ( _В-РОК .).

   В крови В-лимфоцитов - 15% (10-25%).

    5Рецептор к ЭБ имеется на тимоцитах,  Т-лимфоцитах (в перифе-

 5рической крови - 60-79%  Е+ клеток), тромбоцитах, гранулоцитах.

 5Т-лимфоциты практически все без исключения  связываются  с  ЭБ,

 5и в меньшей степени с эритроцитами козы,  крысы, морской свинки

 5и кролика.  При 45о происходит обратимая утрата рецепторов к ЭБ

 5Оптимальная температура - 4-18оС (При 37о число розеток  снижа-

 5ется до 20%). /6504/90-?/ 0

              5ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ

                     5СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

   Определение активности лимфоцитов - реакция БТЛ в  ответ  на

митоген лаконоса. (функциональный аспект)

   Др. функциональные тесты (экспрессия рецепторов к определен-

ным регуляторам и пр.)

                2Определение HLA (по В-лимфоцитам 0,

            имеющим и I, и II класс антигенов HLA 2)

   К суспензии  лимфоцитов  добавляют в 100 лунках по трафарету

МАТ к определенному HLA.  В 6-12 лунках из 100 происходит обра-

зование ИК, которые выявляют последующим добавлением комплемен-

та (ксеногенной сыворотки).  Под микроскопом определяют лунки с

разрушенными лимфоцитами.  Если лимфоциты целы, то данного АГ у

человека нет.

    5[Из фракции лимфоцитов выделяется В-субпопуляция на нейлоно-

 5вой вате;  срывается с нейлона.  HLA определяется по В-лимфоци-

 5там, т.к. на них имеется HLA и I, и II классов.] 0

    4Из гепариновой крови человека выделяют лимфоциты (аналогично

 4методике определения РОК),  раскапывают по 1 мкл в примерно 100

 4лунок планшетки.  В  каждую лунку добавляют МАТ (1 мкл) к соот-

 4ветствующему АГ и 1 мкл кроличьего комплемента  (цельную  сыво-

 4ротку). 1 час. 37о. Добавляют эозин, формалин. Планшетку ставят

 4под микроскоп и определяют лунки с деструктированными  лимфоци-

 4тами, т.е. с АГ человека. Если в данную лунку добавлялись МАТ к

 4А8 и у человека имеется HLA А8,  то антитела связываются с лим-

 4фоцитом, т.е. образуется ИК, который активирует систему компле-

 4мента и МАК разрушает лимфоцит.

                 3ОЦЕНКА ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА

   - Подсчет относительного и абсолютного  _количества . В-лимфоци-

     тов.

   - Развитие гуморального  _иммунного ответа

     -- после иммунизации АГ-ом.

   - Определение функциональной  _активности . В-клеток:

     -- фенотип,

     -- поликлональная активация - пролиферация  мононуклеарных

        клеток  в  культуре клеток на среде 199 (реакция бласт-

        трансформации на митогены: ЛПС, на митогены в СКЛ),

     -- антиген-специфическая  стимуляция  (иммунизация убитыми

        вирусными вакцинами,  гемоцианином или бактериофагом ФХ

        174),

     -- продукция иммуноглобулинов в культуре in vitro,

     -- оценка   _миграционной активности . (с помощью миграция-ин-

        гибирующего фактора = МИФ).

   - Определение  медиаторов  гуморального  иммунного  ответа в

     крови и тканях ( _уровень ИЛ-1,2,6,4 .).

   - Оценка  функциональной   _активности Т-регуляторов . (фенотип,

     поликлональная активация митогенами,  тесты Т-хелперной  и

     Т-супрессорной активности, антиген-специфический ответ).

   - Определение поверхностных иммуноглобулинов различных клас-

     сов на В-лимфоцитах (МИФ и др.).

   - Общий уровень (нормальные,  анамнестические АТ) иммуногло-

     булинов ( _Ig М.G,A .);

      4-- ракетный электрофорез (ЭФ)

      4-- реакция преципитации (РП) по Манчини

      4-- РПГА.

     -- Уровень специфических АТ

     --- определение титра АТ у больного к определенному  инфи-

         цирующему агенту   (прямая  и  развернутая  РА,  РСК):

         столбнячных,  дифтерийных, стафилококковых, коклюшных,

         дизентерийных и др.  антител.

   - Определение  морфологиии лимфоцитов (должны быть шерохова-

     тыми)

                МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ /259,2551к/

────────────────────────────────────┬─────────────────────────

              Методы                │Чувствительность методов

                                    │(выявляемое количество

                                    │антител,  г/мл)

────────────────────────────────────┴─────────────────────────

РА (реакция агглютинации)                  10 5-6 0-10 5-7

   - сальмонелл                            10 5-6

   - пневмококков                          10 5-2

РГА (реакция прямой гемагглютинации)       10 5-4

РПГА (реакция пассивной гемагглютинации)   10 5-7 0- 10 5-9

   - Реакция Кумбса                        10 5-7

Реакция коагглютинации (РКОА)              10 5-8 0-10 5-9

РП (реакция преципитации)

   - в геле                                10 5-2 0-10 5-3

   - кольцепреципитация                    10 5-3

   - нефелометрия,  турбидиметрия

   - колориметрия (с реактивом Фолина)

   - встречный иммуноэлектрофорез /ИЭФ/    10 5-6 0-10 5-7

Реакция иммунофлюоресценции (ИФМ)          10 5-7

РЭМА                                       10 5-9  0и менее

РИМ                                        10 5-9  0и менее

Иммуноблоттинг  (вестерн-блот)             10 5-7 0-10 5-9

РСК (реакция связывания комплемента)       10 5-6

Реакция иммунного лизиса                   10 5-8 0-10 5-9

РН (реакция нейтрализации)                 10 5-4 0-10 5-6

Реакции анафилаксии, кожная проба

нейтрализации токсина (in vivo)

──────────────────────────────────────────────────────────────

    4Выявлена негативная  корреляция между Ig M и альфа-2-макрог-

 4лобулином (r=-0,85)  и   максимальная   позитивная   корреляция

 4(r=0,87) между Ig M и , бета-2-гликопротеином и C3а-активатором

 4и церулоплазмином.  Максимальному уровню Ig G соответствовали и

 4максимальные уровни других белков (комплемента,  С1-инактивато-

 4ра,альфа-1-антитрипсина, альфа-2-макроглобулина и пр.), что да-

 4ло основание  предположить  наличие конституционных типов орга-

 4низма по белково-синтетической функции.

                     2Способы получения антител

    2I. Иммунизация (in vivo)

    Иммунизация человека или животных с последующим получением

    - цельной сыворотки

    - гипериммунной сыворотки

    - гамма-фракции (гамма-глобулинов)

    Используют по жизненным показаниям.

   Недостатки антисывороток:

   Выделенная из крови сыворотка, сколько бы ее не очищали и ни

концентрировали, содержит набор различных антител.  Поэтому  ее

называют поликлональной. Лишь небольшая часть антител направле-

на против специфичных антигенных детерминант,  а остальные реа-

гируют с самыми разными антигенами.  Этим объясняются многочис-

ленные "перекрестные" положительные реакции, которые приводят к

ошибочным диагнозам.

   Еще один серьезный недостаток:  для получения антител каждый

раз необходимо  заново  иммунизировать животных и очищать выде-

ленную сыворотку. Это стоит немалых денег.

    3Этапы получения антисывороток

    31. Иммунизация

   Один объем  антигена смешивают с 3 объемами полного адъюванта

Фрейнда и тщательно  перемешивают.  Полученную  эмульсию  вводят

внутрикожно по 0,1мл в 10 точек спины,  расположенных по 5 в ряд

на расстоянии 2 см по обе стороны от  позвоночника.  Общая  доза

иммуногена равна 10-100 мкг на кролика.  Иммунизируют 6 кроликов

массой по 2 кг.  Через 8-10 недель проводят пробное  кровопуска-

ние.  При  удовлетворительном  качестве антисыворотки последова-

тельно проводят до 3 кровопусканий, после чего кроликам дают от-

дохнуть  в течение 1 месяца и затем делают следующие кровопуска-

ния.  При неудовлетворительном качестве  антисыворотки  проводят

вторичную  иммунизацию,  используя  половинную дозу иммуногена в

неполном адъюванте Фрейнда. Иммунизируют подкожно в складку кожи

на шее. Через 10 суток делают пробное кровопускание и определяют

качество антисыворотки.  При неудовлетворительном качестве инди-

видуальной  антисыворотки иммунизируют новую группу кроликов или

животных другого вида. /6817/84/

    32. Адсорбция (очистка) 0 и тестирование

   - высаливание (осаждение сульфатом натрия или сульфатом  ам-

     мония)

   - осаждение спиртом

   - аффинной хроматографией

   - обработкой полиэтиленгликолем

   - каприловой кислотой

   - выделение на белок А-сефарозе

    33. Фракционирование 0

    2II. MAT (in vitro).

    Получение МАТ (гибридомная технология)

   а) В-лимфоциты  +  вирус Эпштейна-Барра --- быстро перестают

синтезировать АТ

   б) В-лимфоциты + миеломная лимфоцитарная клетка --- гибридо-

ма (под действием ПЭГа).

   МАТ с запрограммированной  специфичснотью  впервые  получили

аргентинец Ц.Мильштейн (C.Milstein) и мюнхенец Г.Келер  (G.Koh-

ler) /Nature.  - 1975. - V.256. - P.495-497/, за что получили в

1978 году Нобелевскую  премию.  Они  рассчитывали  использовать

гибридомы лишь для изучения генетики антител,  а результат при-

вел к подлинному буму.

   В основу метода положен давно известный принцип гибридизации

(слияния) соматических, неполовых, клеток с последующим выделе-

нием и культивированием необходимого гибридного клона. Для сли-

яния используют клетки двух видов.  Первые - плазмоцитомы (опу-

холевые плазмоциты)  из  линий,  культивируемых в искусственных

условиях, in vitro. Как и все злокачественные клетки они интен-

сивно размножаются без всякого внешнего стимула.  Другие клетки

- иммунные лимфоциты.  Они несут в себе способность  синтезиро-

вать и  выделять  необходимые  антитела.  Однако в пробирке эти

клетки существуют лишь несколько дней.

   Образовавшийся при  слиянии  двух  клеток  гибрид  наследует

признаки обоих "родителей".

   Получение гибридом включает 6 основных этапов.

   1. Иммунизация, многократное введение мышам или крысам анти-

гена, против которого необходимо получать антитела.

   2. Слияние иммунных лимфоцитов селезенки животного с его  же

опухолевыми клетками.  Для  соединения клеток используют обычно

полиэтиленгликоль, разрушающий поверхностиные мембраны  и  спо-

собствующий соединению клеток.

   3. Отбор гибридов.  Клетки культивируют в среде,  содержащей

гипоксантин. Плазмоциты погибают из-за отсутствия фермента, его

разрушающего, а лимфоциты - просто потому,  что не умеют  долго

поддерживать свое существование вне организма.

   4. Скрининг, то есть отбор тех гибридных клеток, которые вы-

рабатывают антитела против антигена,  использованнного для имму-

низации. Антиген прикрепляют к какому-либо носителю,например, к

пластиковым шарикам или пленке.  Такой иммобилизованный антиген

обрабатывают культуральной жидкостью, в которой растут гибридо-

мы,  а затем наносят меченые антитела против мышиных или крыси-

ных гибридомных антител (их метят радиоактивными,  флуоресцент-

ными или ферментными метками).  Иными словами,  проводят анализ

культуральной  жидкости на присутствие антител к искомому анти-

гену.  Если гибридомы производят антитела, то они осядут на ан-

тигене,  а к тем, в свою очередь, прикрепятся меченые антитела.

В результате метка соединится с антигеном на носителе и  зафик-

сируется.

   5. Клонирование.  Для  этой  цели несколько гибридных клеток

переносят на питательную среду таким образом,  чтобы они  росли

на достаточном  расстоянии друг от друга.  Через несколько дней

вокруг каждой образуется колония дочерних клеток.  Это  и  есть

гибридома. Клетки  колонии  снова  разводят и помещают на пита-

тельную среду,  чтобы устроить новые колонии. Клонирование пов-

торяют 3-4 раза,  после чего получается устойчивая и продуктив-

наялиния клеток.

   6. Повторный скрининг и получение специфических моноклональ-

ных антител. Эти антитела можно выделить из питательной среды в

искусственных условиях или непосредственно из животных,  приви-

тых гибридомными клетками (как и многие злокачественные  опухо-

ли, гибридому можно прививать).

    _Преимущества МАТ .:

   1. Главная  особенность МАТ - чрезвычайная моноспецифичность

(против одной антигенной детерминанты)  и  абсолютная  однород-

ность.

   2. Возможность многократного получения в течение длительного

времени (воспроизводимость).

   3. Неограниченное количество получаемых антител.

   3. По  специфичности и чувствительности МАТ достигают значе-

ний, предельных для живой природы. Отсюда возможность использо-

вания для анализа антигенов не высокой степени чистоты.

   К настоящему времени получены тысячи разнообразных МАТ.

   МАТ предполагается  использовать в лечебных целях в качестве

целенаправленных носителей,  в состав  которых  будут  включены

токсины (рицин и пр.) или другие фармакологически активные пре-

параты. Такие конъюгаты можно использовать в химиотерапии  опу-

холей и при трансплантации органов и тканей (введением МАТ про-

тив ОКТ 4,8,11;  через 13 суток вырабатывались АТ на  введенные

МАТ)./6815,6816/

    _Недостатки МАТ .:

   1. Одна из проблем,  связана с тем, что МАТ - продукты мыши-

ных гибридом. В настоящее время разрабатываются способы получе-

ния человеческих МАТ.

   2. Реакции лишь с одной антигенной детерминантой  и  отсутс-

твие перекрестных реакций с другими детерминантами на одной мо-

лекуле антигена.   5Недостаток МАТ - отсутствие  преципитационных

 5свойств,  в  связи с чем чаще всего в тестах используются смеси

 5моноклональных антител. 0

   3. Возможность  непредсказуемых  пекрестных  реакций с поли-

функциональными антигенными детерминантами.

   4. Вследствие этого - низкий аффинитет МАТ.

           _Исследование влияния на антителообразование

    5Для изучении влияния фармакопрепаратов на первичный  иммунный

 5ответ животным вводят вещество (допустим, кордиалин в физиологи-

 5ческой дозе 0,15 мг/кг в течении 3  недель  3  раза  в  неделю).

 5Контрольная  группа должна получать такое же количество физиоло-

 5гического раствора.  Допустим, на 14-е сутки, после первого вве-

 5дения, животных иммунизируют эритроцитами барана в дозе 108 кле-

 5ток на мышь (внутрибрюшинно). На 20-е сутки эксперимента в реак-

 5циях  гемагглютинации и гемолиза можно определить титр гемагглю-

 5тининов и гемолизинов.

    5В селезенке животных оценивают количество антителообразующих

 5клеток (АОК) по методу A.Cunningham (1965),  сравнивая их коли-

 5чество в опыте и контроле. Коэффициент стимуляции антителообра-

 5зования в обеих сериях  рассчитывают  по  отношению  количества

 5АОК, приходящихся на 106 ядросодержащих клеток в опыте, к соот-

 5ветствующему количеству АОК в контроле.

  5Литература: Зимин  ...  Лабораторное дело.  - 1984.  - N 9.  -

 5С.556. 0

                  3ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА

   - Подсчет относительного и абсолютного  _количества . Т-лимфоци-

     тов. Персистирование высоких  количеств  CD8-клеток  может

     указывать на хроническую вирусную инфекцию. /1575к/90/ Ко-

     личество СD4 5+ 0-клеток снижается при СПИДе.

   - Определение  медиаторов клеточного иммунного ответа /ИО/ в

     крови и тканях (ИЛ-2).

   - Развитие клеточного  _иммунного ответа ..

   - Определение функциональной   _активности .  иммунокомпетентных

     клеток:

     -- оценка функциональной активности Т-клеток (фенотип, по-

        ликлональная активация митогенами, антигенами в смешан-

        ной  культуре  лимфоцитов  /СКЛ/,  тесты  Т-хелперной и

        Т-супрессорной активности, антиген-специфический ответ,

        цитотоксическая активность,  кожные тесты ГЗТ на тубер-

        кулин, стрептокиназу, кандидин и пр.),

     -- пролиферация мононуклеарных клеток (реакция бласттранс-

        формации на митогены:  ФГА, Кон А, митоген лаконоса /на

        Т- и В-лимфоциты/),

     -- тест торможения миграции лейкоцитов на ФГА.

   - Определение ферментов лимфоцитов.

   - Определение морфологии лимфоцитов.

            2ВЫЯВЛЕНИЕ ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ

   Иммунопатологические состояния проявляются

   - повышенной реактивностью

   - сниженной реактивностью (иммунодефицитами).

   Возможно сочетание данных состояний (в старости), разная ре-

акция на разные АГ.  Поэтому данные два противоположных состоя-

ния можно лечить одними и теми же иммуномодуляторами (имммунос-

тимуляторами).

    4Иммунопатологические состояния проявляются развитием преиму-

 4щественно 4 основных синдромов:

    4- аллергического синдрома (ГНТ-1)

    4- аутоиммунного синдрома (ГНТ-2)

    4- инфекционного синдрома (ИД)                     │

    4- лимфопролиферативного синдрома (недостаточность │ИД

                                     4апоптоза-?)      │

                    3ВЫЯВЛЕНИЕ ИММУНОДЕФИЦИТОВ

             5(+ см. ИД в лекции по иммунопатологии)

   - Снижение функциональной активности лимфоцитов,  моноцитов,

     нейтрофилов

     -- сниженный уровень антител.

   - Снижение количества иммунокомпетентных клеток.

   - Падение комплементарной активности.

   - Сниженная реакция лимфоидных органов на инфекцию (незначи-

     тельное увеличение ЛУ на локальный воспалительный очаг).

   - Кожный тест с пирогеналом.  Внутрикожно вводят пирогенал и

     измеряют величину возникающей эритемы. При ее размере 4-10

     мм диагносцируют нормальную реактивность.  Значения, выхо-

     дящие за рамки этих пределов, трактуются как сниженные или

     повышенные. /1652к/

                   5Диагностика недостаточности

                      5Т-системы иммунитета

    5Клиническая картина ─────  нет

             5│да

             5│

    5Кожная реакция на туберкулин ───── нет

             5│отрицательная

             5│

    5Индекс стимуляции лимфоцитов Кон А или ФГА ───── менее 15

             5│более 15                                  │

             5│                                          │

    5Вспомогательные клетки ───── менее 400/мл ───────  нет

             5│более 400/мл                              │

             5│                                          │

    5Соотношение лимфоцитов с CD 4/CD 8 ────────────── более 1

             5│менее 0,8

             5│

    5Недостаточность Т-системы иммунитета

            3ВЫЯВЛЕНИЕ СОСТОЯНИЯ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

    4Основным методом диагностики ГНТ является сбор "аллергологи-

 4ческого" анамнеза, основной задачей которого является выяснение

 4связи заболеваний с наследственной предрасположенностью и дейс-

 4твием аллергенов внешней среды.

    4ГНТ 1 типа. Анамнез  отягощен и есть связь заболевания с ал-

                4лергенами.

    4ГНТ 2 типа. То же, но связь не выявляется. Необходимо специ-

                4фическое обследование.

    4ГНТ 3 типа. Анамнез  не отягощен и нет влияния аллергенов. В

                4обследовании аллергологов не нуждается.

    4Обследование больных с ГНТ использует те же приемы и методы,

 4что и при других заболеваниях, т.е.

    4- общий осмотр,

    4- объективное обследование по органам и системам,

    4- специфическая лабораторная диагностика. /2300к/

    _Диагностика с использованием кожных проб ..

   Время реакции

   - при ГНТ 1 типа через 1-30 минут. Реакция обусловлена анти-

                    телами класса Ig E.

   - при ГНТ 3 типа реакция через 4-12 часов (с участием иммун-

                    ных комплексов, содержащих Ig M, Ig G).

   - при ГЗТ 4 тип (Тк) - через 24-48 часов.

             _ВЫЯВЛЕНИЕ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ I ТИПА

   Основная черта аллергического статуса является  чувствитель-

ность к аллергенам экзогенного происхождения.

   Аллергологическое обследование включает 2 вида методов:

   1. Провокационные тесты (кожные пробы).

   2. Лабораторные методы.

   - Выявление анафилатоксинов (профилактика анафилатоксическо-

го шока)

   ( 2Клиническая диагностика. 0)

   В острый период аллергического заболевания специфические ме-

тоды отрицательные,  а использование аллергенов  может  усилить

обострение, поэтому специфическое обследование проводят в пери-

од ремиссии.

    1Диагностические критерии аллергии

   - наличие характерных анамнеза (наследственной  предрасполо-

женности и пр.) и клинических проявлений

   - пароксизмальное приступообразное течение и быстро наступа-

ющая ремиссия при элиминации аллергенов или провоцирующих  фак-

торов, наоборот, резкое их обострение при повторном воздействии.

   - эозинофилия крови,  мокроты, секретов и других биологичес-

ких жидкостей и выделений

   - характерное  поражение  тканей  при  местном аллергическом

процессе

   - положительные кожные пробы со специфическим аллергеном

   - положительные провокационные тесты с аллергенами или  при-

чинными факторами

   - наличие в значительном количестве специфических Ig E-анти-

тел в сыворотке крови и секретах,  увеличение уровня неспецифи-

ческих Ig E, выявление Ig G4, обнаружение пассивно-сенсибилизи-

рованных ТК, базофилов и других лейкоцитов (нейтрофилов)

   - выявление аллерген-специфических лейкоцитов

   - положительные  провокационные  тесты на медиаторы аллергии

(гистамин и др.)

   - эффективность специфической и неспецифической антиаллерги-

ческой терапии (антигистаминные препараты, КС и др.). /2300к/

    2Биологическая диагностика 0.

    1Правила постановки кожных проб.

    4- Кожные  пробы ставятся в период ремиссии (через 1-2 недели

      4после обострения). При этом должны быть в наличии

      4-- средства оказания неотложной помощи,

      4-- противошоковый набор.

    4- У аллергена должны отсутствовать токсические свойства, до-

      4за и объем минимальны.

    4- Перед постановкой пробы берут кровь для лабораторного исс-

      4ледования, так как возможна дисенсибилизация.

    4- Пробы не ставят с веществами, в ответ на которых был шок.

    4- Адекватный набор кожных проб и  правильная  последователь-

      4ность их применения (от менее чувствительной, но более бе-

      4зопасной /накожной/ к более чувствительным  /внутрикожной/

      4и опасной). /2300к/

    1Противопоказания для проведения кожный проб 0.

    41. Острый  период  аллергического или любого другого средней

 4степени тяжести или тяжелого заболевания.

    42. Во  время беременности,  кормления ребенка и в первые 2-3

 4дня менструального цикла.

    43. Присутствие  убедительного  анамнеза. /2300к/

    1Интерпретация результатов кожных проб 0.

    _1. Ложноотрицательные бывают

    4- при угнетении кожной реакции на фоне приема  антигистамин-

 4ных препаратов, бета-адреномиметиков, кортикостероидов, у детей

 4до года и пожилых людей (ИД),

    4- недостаточной  чувствительности  кожи (слабая фиксация ал-

 4лергена)

    4- при низкой концентрации аллергена

    4- при десенсибилизации на аллерген (при постоянном  контакте

 4с ним). /2300к/

    _2. Ложноположительные реакции могут быть

    4- при  псевдоаллергических реакциях,  если вводимый препарат

 4обладает раздражающими свойствами

    4- при постановке проб в острый период аллергической реакции,

 4когда кожа повышенно реагирует на раздражитель

    4- при введении внутрикожно больших объемов растворов,  вызы-

 4вающих дегрануляцию ТК от сдавливания тканей.

    4- при недостаточной частоте аллергена в наличии в нем приме-

 4си других веществ, вызывающих аллергическую реакцию. /2300к/

    2Лабораторная диагностика 0.

    _1) Анализ крови

   Важным признаком аллергии является  эозинофилия  (увеличение

на 2-4% от нормы или более 500 в 1 мкл крови).

    _Гиперэозинофилия . наблюдается  также  4при паразитарных инвази-

 4ях,  эозинофильных инфильтратах легкого и кишечника, коллагено-

 4зах,  эозинофильных лейкозах, лимфогранулематозе, введении эст-

 4рогенов и андрогенов, блокаде бета-рецепторов. Глюкокортикосте-

 4роиды, наоборот, приводят к исчезновению эозинофилов. /2300к/ 0

    _2) Определение антител в сыворотке крови больных

    4- реакции преципитации, РНГА (РПГА).

    4- ИФМ (иммуно-флюоресцентный метод),

    4- Радио-аллергосорбентный тест. /2300к/

    4- Антиглобулиновые  реакции  (со  специфическим аллергеном).

      4/2300к/

   3 _) Определение гистамина ..  Непрямой и прямой тест дегрануля-

ции базофилов и тучных клеток (ТК). /2300к/

   4) Определение простагландинов,  _лейкотриенов .. /2300к/

   5) Определение функционального состояния системы гипофиз-ко-

ра надпочечников. /2300к/

   6) Реакция  _агрегации тромбоцитов .. /2300к/

   а)  1При лекарственной аллергии:

   - ускорение СОЭ

   - лейкопения

   - тромбоцитопения

   - агранулоцитоз

   - гемолитичиеская анемия. /2300к/

    1б) При бронхиальной астме

   - в мокроте обнаруживаются кристаллы Шарко-Лейдена,

     эозинофилия (в мокроте)

     (без увеличения количества микробов). /2300к/

    5- рентгеноскопия,  рентгенография, эндоскопический и эхогра-

 5фический методы диагностики. /2300к/

    2Кожные пробы.

   1)  _"Проба на эозинофилы" ..

   Сравнивается число эозинофилов в капле крови,  полученной из

очага кожной реакции и в симметричном участке нормальной  кожи.

При увеличении  их  числа в пораженном участке более чем на 10%

заболевание считается аллергическим. /2300к/

   2) " _Проба на ТК . (тучные клетки)".

   Дермографизм отражает  реактивность  кожи,  ее  капилляров и

ВНС. Его оценивают на коже груди, живота или спины после прове-

дения нескольких полос тупым твердым предметом.  Иногда исполь-

зуют специальные дермографы,  позволяющие оценить силу надавли-

вания на кожу. Обычно через 15 секунд появляется эритема по ли-

нии надавливания,  а затем возникает отечность.  В норме  линия

надавливания слабая или умеренная, красная быстро исчезает. Ур-

тикарный слой в виде отечных белых полос наблюдается при масто-

цитозе (пигментная крапивница),  повышенной лабильности нервной

системы, некоторых аллергических заболеваниях (атопическом дер-

матите), появляется  сразу  после  надавливания на кожу и может

сохраняться от 30 минут до суток, сопровождаться зудом. /2300к/

   -  _Реакция Праустница-Кюстнера . - реакция пассивного  переноса

сенсибилизации  (перенос  сывороткой крови здоровому человеку).

На первом этапе несенсибилизированному реципиенту вводят  внут-

рикожно в предплечье 0,05-0,1мл сыворотки крови больного аллер-

гией в несколько точек на расстоянии не менее 6 см. Затем через

24-48 или 72 часа в эти места, а также в участки введения анти-

сыворотки (самого реципиента) и разводящей жидкости  (контроль)

делают внутрикожно разрешающую инъекцию аллергена  по  0,02  мл

(на расстоянии 0,5-1 см от точки введения сыворотки). В одно из

мест введения сыворотки крови больного вместо аллергена  вводят

его растворитель (контроль). Реакция возникает в случае взаимо-

действия антител введенной сыворотки крови больного и  аллерге-

на.  Ее результат учитывют через 20 мин после иньекции аллерге-

на,  так же как в/к пробу.  Если использовать разведенную сыво-

ротку,  то можно определить ее титр. Минимальное время, необхо-

димое для фиксации реагинов,  составляет 3 ч.  Однако в связи с

возможностью переноса вирусного гепатита и СПИДа, а также с на-

личием других методов диагностики в последнее время реакция ут-

ратила свое значение.  Более приемлемо ее применение в комбина-

ции "больной ребенок - реципиент один из родителей". Иногда ал-

лерген вводят не в/к, а через рот (например, пищевой продукт).

   3)  _Пробы на аллергены . (аллергические  пробы).  Недостаток  -

добавочная аллергизация организма.

   -- конъюнктивальные

   -- назальные

   -- ингаляционные

   -- кожные (скарификационные, внутрикожные, пробы уколом, на-

      кожные /капельные, аппликационные, компресные, электрофо-

      ретические/) /2300к/,

   -- экспозиционные

   -- подъязычные

   -- пероральные  (с  регистрацией  по изменению картины крови

/лейкопенические, тромбоцитопенические,  эозинофилоцитопеничес-

кие/, по подавлению миграции лейкоцитов in vivo в коже или сли-

зистых, по изменению функции внешнего дыхания).

   В основе провокационных тестов лежит специфическая вторичная

повышенная иммунная реакция на вводимый  в  организм  аллерген.

/2300к/

   Различают аллерген-специфические и неспецифические  провока-

ционные тесты.

   -  _Специфические .  основаны  на  вызове аллергической ответной

                    реакции шоковых тканей и органов к специфи-

     ческим  аллергенам  и  5регистрация результатов этих реакций

      5по ряду показателей. 0 /2300к/

   -  _Неспецифические .  тесты  позволяют выявить состояние гипер-

                     чувствительности различных тканей к медиа-

     торам аллергической реакции (гистамину,  АХ-ну, брадикини-

     ну,  серотонину,  простагландинам и другим) или неспецифи-

     ческим раздражающим факторам (холод, физическая нагрузка и

     др.). /2300к/

     -- Ингаляционные  с  бронхоконстрикторами  (с  медиаторами

        /гистамин,  АХ,  Pg F 42-альфа 0, брадикинин, серотонин/, с

        неспецифическими раздражителями /холодный воздух, физи-

        ческая нагрузка/). /2300к/

     -- Ингаляционные с бронходилататорами (селективными стиму-

        ляторами бета-2-адренорецепторов /беротек/, с холиноли-

        тиками /атропин или атровен/, с ингибиторами фосфодиэс-

        теразы /теофиллин,  эуфиллин/,  с медиаторами /Pg  E/).

        /2300к/

     -- Кожные неспецифические (с медиаторами /гистамин/,  дер-

        мографизм). /2300к/

   Количественные тесты указывают на степень чувствительности к

аллергену или фактору,  а качественные - на специфичность реак-

ции.

    _ 2Профилактика и лечение . 0 аллергий

   Гипосенсибилизация более 70 лет является основой лечения ал-

лергий респираторного тракта.

    _1. Препараты, оказывающие действие на иммунную стадию

   - Влияющие на процесс образования Ig E. /2275к/

     -- повторное  введение  увеличивающихся доз аллергена (за-

        пуск синтеза Ig G ── 76 0 блокада АГ до подхода к ТК)

        (получение чистых  индивидуальных аллергенов --- преры-

   +-     вистые повторные инъекции экстратов АГ  на  адъювантах;

        повышение интервалов между инъекциями)

     -- введение per rectum (запуск пероральной толерантности)

      5-- индукция  иммунологической  толерантности   (супрессией

         5синтеза  Ig E адъювантом Фрейнда;  переводом АГ в толе-

         5рантную форму, т.е. формирование клеток-супрессоров)

   - Влияющие на связывание Ig E c  Fc(Е)-рецепторами. /2275к/

     -- введение Fc-фрагмента Ig E

     -- введение 1-валентного аллергена

     -- введение анти-Ig E

     -- модификация антигенных детерминант аллергена

    1- Регуляция гамма-ИФ-ом:  ИФ является прямым  антагонистом

 1ИЛ-4 в ИЛ-4-индуцированной продукции Ig E. /2262к/98/

    1- Влияющие на синтез ИЛ-ов, участвующих в Ig E-ответе. /2275к/

    1-- ИЛ-10 (предотвращающего ИЛ-4-индуцированный синтез  Ig  E

 1путем ингибиции вспомогательной функции моноцитов) 0. 1 /2262к/98/

    1-- ИЛ-12,  регулирующего уровень секреции ИФ-гамма,  ИЛ-4  и

 1ИЛ-10 антигенспецифическими лимфоцитами. /2262к/98/

    1- ИЛ-8 селективно ингибирует Ig E-продукцию ПК-ми, индуциро-

 1ванными ИЛ-4-ом 0. 1 /2262к/98/

    _2. Препараты, оказывающие действие на патохимическую стадию.

   - Стабилизаторы мембран клеток-мишеней аллергии. /2275к/

     -- гормональная терапия (преднизолон и пр.),

     -- препараты кетотифен,  промогликат-? Nа --- стабилизация

        мембраны ТК.

   - Соединения,  тормозящие активацию этих клеток (влияющие на

поступление и либерацию ионов кальция, на синтез и обмен медиа-

торов аллергии,  на систему аденилатциклаза-цАМФ-фосфодижстера-

за). /2275к/

   -- группа  кромолинов  (кромогликат натрия - интал) угнетает

      освобождение медиаторов из ТК. /2275к/

    _3. Препараты,  оказывающие  действие  на патофизиологическую

 _стадию. /2275к/

   - Антагонисты  медиаторов  аллергии (гистамина,  серотонина,

ЛТ-ов, ФАТ). /2275к/

     -- антигистаминные средства (цетиризин = зиртек) /2275к/,

     -- бронхолитики,

   - Соединения,  снижающие чувствительность эффекторных тканей

к аллергии (стимуляторы бета-адренорецепторов, альфа-адренобло-

каторы, ингибиторы М-холинорецепторов). /2275к/

   4. Препараты, оказывающие действие одновременно на различные

стадии аллергического  процесса -  _полифункциональные (глюкокор-

тикостероиды, кетотифен). /2275к/

             _ВЫЯВЛЕНИЕ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ II ТИПА

   Аутоиммунными принято считать те заболевания, в основе кото-

рых лежит иммунная реакция на собственные антигены тканей и ор-

ганов.

    1Причины и механизмы заболевания

   - Измененные собственные АГ.

     -- Индуцированный вирусами и другими  агентами  мутации  и

        модификации активности аутогенов - онкогенов, регулиру-

        ющих продукцию цитокинов и их рецепторов.

   - Нарушение барьеров "забарьерных органов" или физиологичес-

     ки изолированных АГ-ов.

   - Нарушение распознавания "своего" и "чужого" (данные  имму-

     ногенетики).

     -- Антигенная мимикрия аутоАГ и АГ микробов.

   - Активация аутоактивных клонов лимфоцитов

     -- снижение функции клеток-супрессоров.

     -- снижение  апоптоза Тх,  активирующих В-лимфоциты (CD5).

        /2300к/

   - Нарушение иммунологической сети идиотип-антиидиотип (выяв-

ление свободных антиидиотипических антител).

   - Индукции экспрессии HLA DR-антигенов, их не имевших,

    2Диагностика

   Диагноз аутоиммунных заболеваний может быть поставлен на ос-

новании клинической картины заболевания, лабораторных показате-

лей.

    1Критерии аутоиммунных заболеваний 0.

   - Наличие четких доказательств участия АТ в поражении клеток

     (наличие аутоантител различной специфичности),

   - положительный клинический эффект от лечения  иммуномодуля-

     торами

   - эффективность десенсибилизации. /2300к/

    1Анализ крови 0:

   - снижение Т-клеток (особенно Тs),

   - увеличение числа В-лимфоцитов

   - поликлональная гипер- или дис-иммуноглобулинемия

   - ИК в крови

   - снижение концентрации комплемента /? - ПОЛ/

   (- определение уровня ИЛ-1,  ИЛ-2, ФНО, лимфо- и цитокинов).

/2300к/

    2Кожные пробы 0: (клеточные реакции)

    4Экстракты аллогенных тканей в качестве антигенов малопригод-

 4ны, так как они могут стимулировать лимфоциты в результате гис-

 4тонесовместимости.  К некоторым из них может наблюдаться сенси-

 4билизация (после переливания крови и пр.). Чтобы контролировать

 4активность лимфоцитов на аллоАГ контрольные АГ должны быть при-

 4готовлены из другой ткани того же индивидуума.  Если сенсибили-

 4зации к тому АГ нет, а к опытному АГ есть, то только тогда мож-

 4но делать заключение о ее тканевой специфичности. /2300к/

    4ГНТ 2-го типа осложняется ГЗТ.

    2Лабораторная диагностика 0 (см. отд-е формы)

   - Определение антител, связанных с клетками

    3Температурные реакции

   - Кожные неспецифические (холодовые, тепловые) пробы.

   1) Протеины теплового шока (" _тепловая аллергия .")

    4Протеины теплового  шока (ПТШ) локализуются внутриклеточно и

 4на клеточной поверхности.  В частности,  иммунную  роль  играет

 4пептид 180-188 (ПТШ65),  индуцирующий Т-клеточный ответ, корре-

 4лировавший с тяжестью заболевания. /2289к/96/

    4Иммунизация ПТШ65 может защитить мышь от индукции  адъювант-

 4ного артрита. В артритных тканях мышей обнаружены пептиды ПТШ60

 4и ПТШ70,  в крови - Т-клетки и антитела к ПТШ65. Ragno постули-

 4ровал существование механизма молекулярной мимикрии для инициа-

 4ции и пролонгации артрита. /2289к/

    4ПТШ60 обнаруживаются на макрофагах,  активированных гамма-ИФ

 4и альфа-ФНО. /2289к/

    1Кожная проба 0: Пробирку с горячей водой (40-42 5о 0С) помещают на

10 минут на кожу внутренней поверхности предплечья. При положи-

тельной реакции через 15-20 минут наблюдается гиперемия,  отек,

волдырь. /2300к/

   2) " _Холодовая аллергия ."

    1Кожная проба 0:  кусочек  льда  помещают на предплечье и через

10-20 минут на этом месте появляются волдыри при непереносимос-

ти холода. /2300к/

    3Аутоиммунное заболевание щитовидной железы

    _1) Тиреоидит Хашимото.

    1Лабораторная диагностика

    4- HLA B8 и DRS. /2300к/

    4- Аутоантитела против АГ к тиреоглобулину  (РСК,ИФА,РПГА,РП,

      4РИМ, латексный метод). /2300к/

    4- АТ против микросомных АГ и "второго коллоидного  АГ"  (ис-

      4пользуют непрямую иммунофлуоренценцию на срезах щитовидной

      4железы./2300к/

    4- АТ   против  основного  белка  микротрубочек  -  тубулина.

      4/2300к/

    4- АТ против поверхности клеток эпителия. /2300к/

    4- Подавление тироксином миграции лимфоцитов. /2300к/

    4- Цитотоксическое действие лимфоцитов на  различные  клетки,

      4покрытые АГ-ом железы /2300к/ (Тк=4 тип ГЗТ-?).

    4- Повышено количество Тх2 типа с рецептором к ИЛ-2 в  крово-

      4токе. /2300к/

    4- Cоотношение Тх  к  Тs  (CD4/CD8)  повышено  незначительно.

      4/2300к/

    _2) Тиреотоксикоз.

   - АТ, стимулирующие гиперплазию эпителия.

   - Стимулятор щитовидной железы (LATS).

   - АТ,  стимулирующие накопление в щитовидной железе коллоида

и цАМФ.

   - АТ,  ингибирующие связывание  тиреотропина  с  рецепторами

клеток

   - Снижение числа CD8-лимфоцитов и повышение соотношения Тх к

Тs (CD4/CD8). /2300к/

    _Сахарный диабет

    5Инсулинзависимый сахарный диабет - аутоиммунное заболевание;

 5аутоиммунная реакция приводит к разрушению инсулино-продуцирую-

 5щих клеток.  Больные имеют высокий риск развития других аутоим-

 5мунных заболеваний.  Часто развивается поражение щитовидной же-

 5лезы - аутоиммунный тиреоидит или болезнь Грейвса. /2239к/95/ 0

    _1) Первый тип (инсулин-зависимый)

    4Приобретая DR-АГ, бета-клетки становятся АПК (АГ-презентиру-

 4ющими клетками), запускающими ИО. Появление DR-АГ на бета-клет-

 4ках под влиянием ИФ,  индуцируемого некоторыми  вирусами  или/и

 4стимуляция ими синтеза макрофагами ИЛ-1 и ФНО, повреждающих бе-

 4та-клетки. /2300к/

    4Особую проблему представляет сенсибилизация больных к  инсу-

 4лину животного происхождения (Ig G и Ig A).

    _2) 2-ой тип

    4АТ к рецептору для инсулина /?/

    4Лабораторная диагностика:

    4- Генетическая предрасположенность (HLA DR 3/4,  и  особенно

 4HLA DQ, А1 и HLA DQ, В1. /2300к/

    _Рассеянный склероз

- Ассоциирован с АГ HLA A3, B7, DR2. /2300к/

- Повышено содержание Ig в спинномозговой  жидкости  (СМЖ),   _ 2АТ

   _ 2против белка миелина . 0 СМЖ и крови.

- Общее количество Т-лимфоцитов не меняется или снижено.

- Повышено количество В-лимфоцитов.

- Повышен уровень Тх (CD4+-лимфоцитов), ИЛ-2

- Снижено количество Тs, на которых в 3 раза повышено число бе-

  та-адренорецепторов.

- На моноцитах снижена экспрессия DR-АГ.

- В СМЖ обнаруживаются МИФ (миграции-ингибирующий фактор), ФНО,

  гамма-ИФ. /2300к/

    _Миастения гравис

    2- АТ  против  АХ-ых рецепторов и АХЭ 0 (ацетилхолинэстеразы) -

 490% больных. /2300к/

    4- АТ против АГ скелетных мышщ.

    4- Имеется связь между АГ мышечной ткани и АГ вилочковой  же-

 4лезы (тимуса).  Тимэктомия  приводит  к  клиническому улучшению

 4состояния больных /2300к/ - у 30%-?.  АТ могут интенсивно взаи-

 4модействовать  с комплексом тимопоэтин-АХ-ый рецептор (тимопоэ-

 4тин снижает нервно-мышечную передачу импульсов). /2300к-с.136/

    4- Уровень  Т-клеток нормальный,  но снижается после тимэкто-

 4мии, хотя состояние больных улучшается.

    4- Супрессорная активность клеток умеренно уменьшена.

    4- Увеличена субпопуляция Т-клеток, имеющих СR1/?/-рецепторы.

    4- Снижена  цитотоксическая  активность  ФГА (фитогемагглюти-

 4нин)-активированных Т-клеток. /2300к/

    3Шизофрения

   - аутоиммунная форма

                 3Антифосфолипидный синдром 0 (АФС)

         (Синдром ПФА - противофосфолипидных антител)

──────────┬──────────────────────────────────────┬─────────────

Компоненты│         Патогенное действие          │Лабораторные

гемостаза │      антифосфолипидных антител       │проявления

──────────┼──────────────────────────────────────┼─────────────

Сосудисто-│Взаимодействие с мембраной тромбоцитов│Тромбоцито-

тромбоци- │--- повышение адгезии к ЭК --- подав- │пения

тарный    │ление выработки  простациклина --- АТ │

          │                                      │

Коагуляци-│Торможение образования протромбинового│Повышение

онный     │комплекса (фактора V+X+Ca+ФЛ), блокада│протромбино-

гемостаз  │действия на протромбин                │вого времени

          │Повышение способности тромбина катали-│

          │зировать образование свертка крови    │

          │                                      │

Противо-  │Снижение синтеза эндотелием тромбомо- │

свертываю-│дулина --- снижение активности белка С│

щая систе-│Подавление активности АТ-III.         │Снижение АТ-

ма        │                                      │III

          │                                      │

Фибриноли-│Ингибиция образования прекалликреина. │Замедление

тическая  │Нарушение клиренса фибрина (активная  │лизиса эугло-

система   │фаза фактора ХII + калликреин + ВМК). │булинов

          │Снижение выделения активатора плазми- │

          │ногена.                               │

──────────┴──────────────────────────────────────┴─────────────

    _Лабораторная диагностика:

   - наличие  антител к фосфолипидам /3609/ --- эффект антикоа-

     гулянта (блокада образования протромбиназы). /3609/86/

   - АТ  типа  волчаночного увеличивают время рекальцификации в

     присутствии различных видов фосфолипидов. /8000/87/

   - удлинение протромбинового времени /3615/82/,

   - удлинение  активированного  (каолином) частичного тромбо-

     пластинового времени. /8001/89/

   - снижение уровня белка S, снижение белка С /7999/

    5Фибринолитическая активность снижается. /3615/82/ Тормозится

 5Хагеман-зависимый фибринолиз (Табл.  1) /определение каолин-за-

 5висимого фибринолиза по Ogston /3615-11/. /3615/82/

                                             5Таблица 1.

 5───────────────────────────────────────────────────────────────

            5Плазма                    │  Время лизиса (мин.)

 5───────────────────────────────────────────────────────────────

 5Нормальный уровень                          7-14 минут

 5Врожденный дефицит прекалликреина           более 120 минут

 5Врожденный дефицит фактора ХII              более 120 минут

 5Больные СКВ                                 25,

                                             575,

                                             515 минут

 5───────────────────────────────────────────────────────────────

 5Снижается уровень активатора плазминогена  эндотелиальных  кле-

 5ток. /3615/82/

            _ВЫЯВЛЕНИЕ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ III ТИПА

    2Лабораторная диагностика

   - Реакции лизиса и повреждения лейкоцитов

   - Определение ЦИК (повышенный уровень)

   - Снижение уровня комплемента  /с/

   - Повышение титра АТ /с/

   - повышение СРБ /с/

   - ПОЛ /с/

                         2Определение ЦИК

              (циркулирующих иммунных комплексов)

    _Значение теста .. Содержание ИК помогает в оценке и мониторин-

ге активности болезни при таких состояниях,  как РА, СКВ. Опре-

деление АГ-специфических ИК может оказаться полезным при обсто-

ятельствах, когда  свободные  АТ  в  сыворотке  не  выявляются.

/1575к/90/

    _Варианты методик

   1) Биологический тест

   - Тест угнетения ЕА-розеткообразования (FcR) лимфоцитов боль-

ных под влиянием 10-20%  аутологичной сыворотки (контроль сыво-

ротки доноров).  Причем,  данный тест более  чувствителен,  чем

другие методы.

   - Реакция   коагглютинации    (агглютинация    стафилококков

сывороткой больных. /с/

   - Агглютинация эритроцитов, покрытых белком А (FcR) золотис-

того стафилококка. /2300к/

   - ЦИК выявляют с помощью клеток (тромбоцитов,  клеток Райи),

имеющих Fc-рецепторы,  которые связывают агрегированные Ig. ЦИК

угнетает связывание с FcR частиц, например, эритроцитов, покры-

тых агрегированных иммуноглобулинами или АТ-ми. /2300к/

   2) С1q-cвязывающий тест

      ИК= АГ+АТ

      АТ=Fab+Fc

      Fc + C1q, иммобилизованный на носителе (колонке с сефаро-

зой).

   Пропускают сыворотку больного через колонку, промывают, сры-

вают (высокомолярным, "кислым" /рН 3/ и пр. раствором) лиганд и

измеряют элюат спектрофотометрически.

   Недостаток: ЦИК кровотока,  связанные с С1q, не сядут на ко-

               лонку.

   3)  _Осадочные реакции . (желательно с последующим  определением

в осадке содержания антител /посадкой на колонку с C1q/).

   Недостаток: в осадок выпадают все крупные  комплексы  плазмы

(обрывки мембран,  фибрина,  СРБ-лиганд,  фибронектин-лиганд  и

пр.). /с/

    4а) Водно-кислотные методы.

    4- Сыворотка смешивается с 10% ТХУ (трихлоруксусной кислотой)

 4в соотношении 1:0,5.  Надосадок после центрифугирования измеря-

 4ется на спектрофотометре при длине волны 254нм. Экстинция менее

 40,24 ед.  считается нормой. 10% ТХУ определяет (в конечной кон-

 4центрации 3,3%) осаждает белки с М. более 100 кД.

    4- Осаждение "ЦИК" дистиллированной водой,  подкисленной о,1М

 4раствором уксусной кислоты (рН 4,6).

    4К 0,1 мл инактивированной сыворотки добавляют 2 мл охлажден-

 4ной до 4оС воды,  перемешивают и центрифугируют  30  минут  при

 43000 об./мин.  (при 4оС).  Осадок промывают подкисленной водой,

 4растворяют в 3 мл 0,1Н NaOH и  измеряют  количество  белка  при

 4280нм, т.е. количество ЦИК. /2300к/

    4б) Осаждение ПЭГ (полиэтиленгликолем)

    4ПЭГ добавляется в определенное количество сыворотки, образу-

 4ется осадок, который растворяют в физрастворе и спектрофотомет-

 4рируют.

            43% ПЭГ - Норма - 23-124 (показания СФ)

            44% ПЭГ - Норма - 90-148

    4[4) Конглютининовый тест]

    45) АГ-специфические методы  (после  выделения  специфических

 4ЦИК) базируются на выявлении АГ-ов или АТ после диссоциации ЦИК

 4при рН 2,8-3,2 или путем обработки раствором мочевины, цистеина

 4и других веществ. /2300к-с.234/

    3Коллагенозы

    5- иммунная патология  диффузных  заболевания  соединительных

 5тканей.  Возможен врожденный волчаночный синдром (+ АТ к ДНК, +

 5врожденный порок сердца). Характерен дефицит С2.

    _ 5Патогенез

    5В норме антинуклеарные,  антицитоплазматические и  антимито-

 5хондриальные антитела выявляются в высоком титре (> 1:160) у 1%

 5здоровых обследованных (уровень существенно повышается  с  воз-

 5растом). /2258к/

    5Антисыворотки против нуклеарных АГ:

    5- WHO 66/233, WHO 4/80.

    5- Стандарты АГ -  AF#CDC ANA No1; AF/CDC No 3, N 4, N 8.

    _ 5Клиническая картина

    5Клиническая картина СКВ характеризуется полиморфизмом. Долж-

 5но быть не менее 4 признаков.

    51. Недеформирующий артрит (80-90% больных).

    52. Наличие LE-клеток (70-90%).

    53. Цилиндроурия (15-50%), плеврит или перикардит (50-70%),

    54. Алопеция (облысение) - (40-70%)

    55. Эритема лица в форме бабочки (40% больных)

    56. Синдром Рейно (20-40%)

    57. Повышенная чувствительность к УФ лучам (30-40%).

    58. Дискоидная волчанка (20-30%)

    59. Изъязвление в полости рта или носоглотки (15-40% больных).

   510. Выраженная протеинурия (более 4 г/л), 15-30% больных.

   511. Психозы или судорожные припадки (10-20% больных).

   512. Гемолитическая анемия (15%),

   513. Лейкопения (ниже 4х109л-1) /40% больных/ или

       5тромбоцитопения (ниже 100 х109 л-1 (10% больных),

       5лимфопения.

   514. Положительная реакция Вассермана в течение 6 месяцев  (АТ

       5к кардиолипину).

    _ 5Лабораторная диагностика

    5- снижение уровня Т-лимфоцитов,  преимущественное  угнетение

      5Тs;

    5- снижение ИЛ-1 макрофагами и моноцитами, ИЛ-2

    5- уменьшение нормальной концентрации в сыворотке крови С4  и

      5С2 компонентов комплемента

    5- поликлональная активация В-системы

    5- повышение уровня АТ  Ig G1, G3.

    5- АТ к ДНК и АТ 2-го порядка (АТ к АТ)

    5- наличие АТ против определенных субпопуляций лимфоцитов

    5- связь с HLA гаплотипом А2, B7, В8, D3,

      5или с гаплотипом А11,  B7,  В35,  DR2,  DR3; рекомендуется

      5обследовать  родственников  больного  для выявления ранних

      5форм заболевания. /2300к/

    3Склеродермия

    5- Нарушение функции фибробластов (несовершенный коллаген)

    5- Антиядерные АТ (80% больных)

    5- антифосфолипидные АТ,

    5- АТ к Scl (70%)

    5- АТ к РНК-полимеразам, топоизомеразе ядер

    5- ревматоидный фактор (РФ) - антитела класса Ig M к Fc-фраг-

      5менту Ig G и Ig Е. /2300к/

    5- АТ против центромеры

    5- лимфоцитотоксины

    5- гипер-гамма-глобулинемия,

    5- ЦИК

    5- снижение уровня Т-лимфоцитов. /2300к/

    3Синдром Шегрена

    5Шегрен в 1933г.  описал синдром,  состоящий из трех основных

 5симптомов:

    51. сухого кератоконъюнктивита, │sicca-синдром

       5(ксерофтальмия-?)           │

    52. ксеростомии,                │

    53. ревматоидного артрита. Ревматическое поражение начинается

 5раньше, к нему присоединяется поражение слюнных желез. /1407к/

    5+ синуситы,

    5+ сухость кожи,

    5+ анацидность,

    5+ цистит, пиелит,

    5+ анемия,  СКВ, макроглобулинемия, полимиозит, склеродермия,

 5васкулит, узелковый периартериит,  иммунный тиреоидит, иммунный

 5гемолиз и прочие аутоиммунные болезни. /1407к/

    5Болезнь характеризуется разрушением железистого эпителия  во

 5всем организме. /1407к/

    _ 5Этиология

    5Аутоиммунный процесс.  Органоспецифические аутоантитела про-

 5тив 0

    5- щитовидной железы,

    5- слизистой желудка,

    5- мышц,

    5- ревматоидный фактор (Ig G против Ig M),

    5- противоядерный фактор. /1407к/

    _ 5Патогенез

    5В слюнных железах лимфоцитарная инфильтрация,  в первую оче-

 5редь вокруг полосатых протоков. В эпителии протоков наблюдается

 5пролиферация  лимфоцитов,  эпителий ацинусов погибает (остаются

 5островки пролиферирующего эпителия). = доброкачественное лимфо-

 5эпителиальное  поражение.  Может  переходить  в злокачественную

 5лимфосаркому. /1407к/ 0

    5- Лейкопения

    5- РФ (70-90%)

    5- антиядерные АТ (50-70% больных)

    5- АТ к АГ слюнных желез

    5- снижение  Т-клеток  и  соотношения  CD4/CD8=Тх/Тs   (норма

 51,5-2,5). /2300к/

    _ 5Клиника

    5- Набухание  слюнных желез,

    5- сухость во рту (в тяжелых случаях у больного полностью от-

 5сутствует слюна). В таком случае затруднено глотание.

    5- По всему телу прощупываются ЛУ, ревматические узлы.

    5- Депрессия. /1407к/

    _ 5Лечение

    5- кортикостероиды, ударные дозы преднизолона,

    5- витамин В12

    5- психо- и физиотерапия. /1407к/

    3Узелковый периартериит

    _ 5Лабораторная диагностика

    5- Лейкоцитоз

    5- Гипо-гамма-глобулинемия

    5- Антинуклеарные АТ

    5- РФ

    5- АТ против кардиолипина

    5- HBs-АГ или его АТ (30% больных). /2300к/

    3Ревматоидный артрит

    5ИК --- активация комплемента.

    5Ревматоидные узелки состоят из фибрина, лимфоцитов, макрофа-

 5гов.

    _ 5Лабораторная диагностика

    5- РФ = аутоАТ (класса Ig M) к Fc-фрагменту Ig - ревматоидный

      5фактор (выявляются у 70-90% больных).

    5- Увеличение СОЭ

    5- Повышение СРБ

    5- Повышение альфа-2-глобулинов, а затем и гамма-глобулинов.

    5- Анемия

    5- Умеренный лейкоцитоз

    5- Генетическая связь с HLA А11,  DR4,  DR53,  DQ4.

    5- Наличие  муциновых  преципитатов  в синовиальной жидкости.

      5/2300к/

    5- Уменьшение количества лимфоцитов. /2300к/

    5- Повышается уровень бета-2-макроглобулина  в  крови  в  2-5

      5раз. /2300к/

             _ВЫЯВЛЕНИЕ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ IV ТИПА

    2Лабораторная диагностика

   - Анализ крови и подсчет лимфоцитов. Количество Т-лимфоцитов

     определяют по АГ и рецепторам.

   - Рентгенологическое обследование вилочковой железы.

   - Функциональную активность Т-лимфоцитов определяют по  про-

     лиферации  (РБТЛ),  образованию цитокинов,  лимфокинов,  а

     также по цитотоксическим и регуляторным эффектам. /2300к/

   - Подавление миграции лейкоцитов.

   - Изменение прилипаемости лейкоцитов.

   - Изменение  розеткообразования  Т-лимфоцитов с эритроцитами

     барана.

   - Кожные пробы

     -- пробы с ФГА (оценивают по диаметру папул;  гиперемия не

        определяется "работой" Тк-ов),

     -- динитрохлорбензолом /ДНХБ/

     --"мультитест" (набор распространенных АГ-ов). /2300к/

     -- Кожный тест с пирогеналом

   Внутрикожно вводят пирогенал и измеряют величину возникающей

эритемы. При  ее размере 4-10 мм диагносцируют нормальную реак-

тивность. Значения, выходящие за рамки этих пределов, трактуют-

ся как сниженные или повышенные. /1652к/