Рисунок 1 -  Классификация методов определения показателей качества косметических товаров         (Вилкова С.А., 2000).

 Экспертным считают метод получения характеристик продукции, основанный на анализе  специалистов – косметологов, дерматологов, парикмахеров или специалистов по сертификации. Оценка экспертов может выражаться в количественной или качественной форме. Практический метод основан на проведении испытаний с помощью лабораторных животных или группы добровольцев – волонтеров, а также специалистов в течение определенного времени. Однако для определения большинства показателей такие методы еще не разработаны.

                   Многие методы оценки качества in vivo часто не дают количественных характеристик. Они сводятся к внешнему анализу состояния кожного покрова или волос  при применении двух аналогичных средств  или контрольных образцов. Использование одновременно практического и экспертного методов позволяет повысить достоверность и объективность результатов исследований.

          К преимуществам измерительного метода in vivo необходимо отнести большую точность и достоверность результатов, которые выражены количественно. Но при этом предприятие несет значительные финансовые затраты.         Изготовители парфюмерно-косметической продукции при разработке технических условий на новые товары стремятся, как правило, уменьшить количество регламентируемых показателей качества. Вследствие чего на рынок поступает масса фальсифицированных и низкокачественных товаров широкого потребления.

В ряде стран существуют организации, контролирующие допустимость использования различных компонентов в косметические средства.  В странах Европейского Союза контроль за использованием консервантов определен Директивой 76\768\ЕЕС, принятой в 2000г. Существует так  называемый «белый список» веществ, разрешенных к использованию в косметике, который постоянно обновляется. В Бразилии был принят примерно в то же время похожий список. Существует список ингредиентов в США, которые разрешены к использованию в косметических средствах. Этот список опубликован в Международном словаре косметических ингредиентов, изданном  СТFA (Ассоциация косметических, парфюмерных товаров и отдушек).  В Японии  имеются два официальных источника  информации о составе косметических средств : JSCI ( Японские стандарты косметических ингредиентов) и  CLS (Разъяснительные стандарты косметических средств для лицензирования). JSCI был опубликован в 2001 году  Министерством здравоохранения Японии. CLS содержит информацию о том, в какой категории косметических  продуктов ( всего 11 категорий) могут использоваться конкретные косметические ингредиенты (Баранникова О., 2002).

          При оценки биологической активности и качества новых видов косметической продукции существует ряд проблем :

-   определение номенклатуры оцениваемых показателей качества;

- разработка новых показателей для подтверждения эффективности продукции ;

-   разработка новых методов контроля качества ;

-сравнительная оценка конкурентоспособности и потребительских свойств  нового товара.

Успешное разрешение данных проблем возможно при условии создания системы управления качеством на производстве.

1.4.4. Система управления качеством производства косметической продукции

Долголетний опыт борьбы за качество в нашей стране и за рубежом показал, что никакие эпизодические, разрозненные мероприятия не могут обеспечить устойчивое улучшение качества. Эта проблема может быть решена только на основе четкой системы постоянно действующих мероприятий. На современном этапе принята система, установленная в международных стандартах – ИСО серии 9000. Фундаментальным понятием в данной системе является понятие жизненного цикла продукции, как совокупности  взаимосвязанных процессов изменения состояния продукции при ее  создании и использовании (Брюханов В.А., 1996). Разработана модель обеспечения качества в виде непрерывной  окружности, составляющими которой служат отдельные этапы жизненного цикла ( рисунок 2).

                                                      1. маркетинг

  11.утилизация                                                              2. проектирование и закупка      

  10. послепродажная                                                      3.закупки

деятельность                                              т                    4.производство

  9. техническое                                                                5.проверка      

обслуживание

  8. эксплуатация                                                              6. упаковка и хранение 

                                                         7. реализация  

Рисунок  2 -  Модель жизненного цикла продукции (Лившиц И.М., 2004)

Эту модель раньше называли «петлей качества», а в последней версии ИСО 9000 – процессами жизненного цикла продукции. Важнейшее требование к системе  состоит в том, что управление качеством должно охватывать все этапы цикла. На этапе маркетинговых исследований  осуществляется систематическая работа по изучению рынков сбыта, возможности поставки качественного сырья и вспомогательных материалов. На этапе проектирования и разработки новых видов продукции, выявленные по результатам маркетинга  потребительские требования трансформируются в  конструкторскую и технологическую документацию, экспериментальный образец. В процессе закупок предприятие оценивает и выбирает поставщиков. В процессе производства  осуществляется подготовка и обеспечение технологического процесса  изготовления  продукции, отработка и проверка параметров технологического процесса и овладения практическими приемами изготовления продукции со стабильными значениями показателей  в заданном объеме выпуска. 

Проверка продукции включает в себя контроль, измерения и испытания, осуществляемые на всех этапах цикла. Заключительным этапом проверки является приемочный контроль, по результатам которого проводится стандартизация готового продукта. Распределение и реализация заключаются в закупке продукции оптовыми организациями с целью осуществления отпуска розничными организациями товаров покупателям. На этом этапе субъектом управления качеством становится персонал организации сферы услуг.

 На этапе эксплуатации к управлению подключается потребитель продукции. От того, насколько грамотно он будет использовать продукцию, зависит срок ее службы. На стадии утилизации разрабатываются мероприятия по охране  окружающей среды. Но на этом не заканчивается деятельность организации. Она начинает изучать потребности рынка, проводит маркетинговые исследования и приступает к разработке новой продукции. Так возникает новый виток  деятельности   в области качества – от этапа маркетинга до этапа утилизации.

Современная система основывается на двух подходах: технологическом и управленческом (Парций Я.Е., 2003). Первый предусматривает использование эффективных методов для оценки стабильности производственных процессов, обеспечения достоверности результатов измерений, контроля и испытаний продукции. Второй  подход базируется на требованиях стандартов ИСО серии 9000, принципах и методах менеджмента.

Эффективная работа предприятия возможна только при умелом сочетании обоих подходов. Необходимость фиксации управленческих решений существует в любом аппарате – от высших органов государственной власти до небольших коммерческих организаций. К управленческой документации относятся организационно-распорядительная, внешнеторговая, отчетно-статистическая, бухгалтерско-финансовая и другие ее  разновидности (Алешин Б.С., 2002). Особый статус среди данной документации имеет организационно-распорядительная, так как именно с ее помощью  осуществляется четкое управление работой всего предприятия. Требования к ней установлены ГОСТом 6.38.

В последние годы в мире стремительно растет число компаний, сертифицировавших свои системы  качества на соответствие стандартам ИСО серии 9000. В настоящее время эти стандарты применяют более 150 стран. По данным Регистра Ллойда, предприятия  имеющие международные сертификаты, работают в 2-3 раза эффективнее по сравнению с остальными ( Лившиц И.М., 2003). Тенденция стремительного роста систем управления качеством связана как с внешними, так и с внутренними причинами.

  К важным внешним причинам следует отнести  тот факт, что многие зарубежные органы и системы сертификации  включают  наличие системы управления качеством в обязательные условия сертификации. Так, в ЕС семь из одиннадцати действующих директив  обязательной сертификации предусматривают наличие данной системы.

 Как показывает анализ международного рынка, продукция имеющая сертификат ИСО 9000, имеет цену в среднем в 1,5-2 раза выше, чем аналогичная продукция не прошедшая данную процедуру. Это связано с рейтингом безопасности данного товара. Кроме того, предприятия, имеющие данный сертификат, могут претендовать на льготное кредитование и победу в различных тендерах. При возникновении судебных исков, связанных с браком продукции, наличие данного сертификата расценивается судом как доказательство невиновности (Тимко В.Я., Панкина Г.В.,2000).

 К внутренним причинам, побуждающим предприятие к созданию системы управления качеством, следует отнести уменьшение числа проверок со стороны надзорных органов и связанное с этим  сокращение издержек производства.

Таким образом, создание системы управления качеством на производстве парфюмерно-косметической продукции позволяют оптимизировать научно-методические основы мониторинга косметической продукции в соответствии с требованиями международного стандарта ИСО 9000. Внедрение данной системы в производство имеет социальный и экономический аспекты, так как обеспечивает выпуск безопасной высококачественной продукции и увеличивает конкурентоспособность предприятия.

Авторами не встречено исследований, касающихся обоснования процентного соотношения входящих в фитокомпозицию лекарственных трав, о сохранении синергизма действия в зависимости от количественного содержания компонентов в композиции.  Поэтому представляло интерес изучить возможность подбора количественного соотношения лекарственного растительного сырья с помощью биомоделирования. Решению этих проблем и посвящены настоящие исследования.

Перспективным и недостаточно исследованным направлением, исходя из проанализированных литературных данных, являются: экспериментальный подбор лекарственных растений в композицию, сохраняющую, с одной стороны, индивидуальные качества БАВ растений, а с другой стороны - синергизм действия фитокомплекса; наличие искомого терапевтического эффекта. Вместе с тем, с нашей точки зрения, недостаточно освещены вопросы биотехнологии с точки зрения экспериментальной оценки биологической активности и безопасности разрабатываемого средства, что имеет важный социальный аспект, так как каждый человек в течение всей своей жизни ежедневно пользуется различными парфюмерно-косметическими средствами. Об актуальности поиска универсальной биологической модели для оценки токсичности различных соединений свидетельствует значительное число публикаций. 

Разработка  биотехнологии эффективных липидных тоников для проблемной кожи способствует импортозамещению на отечественном рынке.

ГЛАВА 2. Материалы  и методы исследования

2.1.Характеристика материалов, вспомогательных веществ и оборудования, применяемых в исследованиях

1.     Сырье:

Фитокомпозиция лекарственных растений :

-         цветки и трава зверобоя, соответствовали требованиям ФС 42-1754-81;

-         листья крапивы, соответствующие требованиям ГФ;

-         цветки календулы, соответствовали требованиям ВФС 42-1868-88

-         цветки ромашки, соответствовали требованиям ГФ;

-          листья шалфея, соответствовали требованиям ВФС 42-946-80.

-          Масла эфирное  лавандовое и  розовое   соответствующие требованием СаНПиН 1.2.681-97, характерно наличие ароматического запаха.           

-         Глицерин косметический, выпускающийся в соответствии с требованиями ГОСТ 6824-76- бесцветная маслянистая жидкость, смешивается с водой, гигроскопичен.  

-           Кислота лимонная  порошкообразная, выпускающаяся по ФС 42-0008-00, ГФ ХI. , представляющая собой белые кристаллы.                                                                                                                                    

- Спирт этиловый  ректифицированный ГОСТ 5962-67.

- Бензоат натрия, белый порошок или гранулы, НД 42-9900-99, производства фирмы Берингер Ингельхайм КГ, Германия                                                                                                                                                                                                           

         - Дистиллированная вода, выпускающаяся по ГОСТ   6709.                                                     

        - Родниковая слабоминерализованная вода, соответствующая требованиям СаН ПиН 2.3.2.1078-01.

-         Масло растительное подсолнечное , соответствующее требованиям ГОСТ 1129-93, со свойственным подсолнечному маслу цвету и запаху, без привкуса горечи.

2.     Вещества, применяемые в методах контроля:

      Ацетилен, соответствующий требованиям  ГОСТ 5457, газообразный  в баллонах.

Аммиак водный, х.ч., соответствующий требованиям ГОСТ 3760, раствор с массовой долей 5%

           Изоамиловый эфир уксусной кислоты (изопентилацетат), выпускающийся по ТУ 6-09-1240

      Кадмий металлический, ч.д.а, выпускающийся  по ГОСТ 1125.

      Цинк гранулированный, ч.д.а. по ТУ 6-09-5294 или цинк окись, х.ч. по ГОСТ 10262.

      Свинец азотнокислый, х.ч., выпускающийся  по ГОСТ 4236.

      Соль закиси железа и аммония двойная сернокислая (соль Мора), х.ч. по ГОСТ 4208.

       Медь сернокислая, х.ч., выпускающаяся  по ГОСТ 4165.

       Кислота азотная, выпускающаяся  по ГОСТ 11125, ос.ч. или другой квалификации перегнанная; раствор в бидистиллированной воде (1:1) по объему и раствор с массовой долей 1%.

        Кислота соляная, выпускающаяся  по ГОСТ 14261, ос.ч. или другой квалификации, перегнанная; раствор в бидистиллированной воде (1:1) по объему и раствор массовой долей 1%.

Калий йодистый – порошкообразный по ГОСТ  9678

Метанол, выпускающийся по ГОСТ 6995 77, прозрачная жидкость с характерным запахом спирта.

Агар Хоттингера: мясопептонный бульон с содержанием 120-140 мг аминного азота, 15 г агара, 3 г натрия фосфата двузамещенного. ГОСТ 10444.

Среда Эндо:  мясопептонный бульон, лактоза, индикатор.  По МУК 4.2.671

Оборудование и химическая посуда:

Компрессор воздушный, соответствующий требованиям технической инструкции для спектрофотометра. Баллоны со сжатым воздухом.

      Баллоны с ацетиленом  газообразным техническим по ГОСТ 5457 в;

     Весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200г не ниже 2-го класса точности.

     Весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 500г 4-го класса точности.

       Бюретка 1-1-2-50-0,1 по ГОСТ 29169.

       Колбы мерные 2-25-2,2-50-2,2-100-2 и 2-1000-2 по ГОСТ 1770.

       Пипетки 2-1-2-1 или 1-1-2-1, 2-1-2-2 или 1-1-2-2, 1-2-2-5 и 1-2-2-10 по ГОСТ 29169.

      Цилиндры мерные 1-25 или 3-25, 1-50 или 3-50 по ГОСТ 1770.

      Стаканы Н-1-100 или Н-1-150 по ГОСТ 25336.

      Воронки делительные ВД-1-100 или ВД-1-250 по ГОСТ 25336.

      Пробирки со шлифом П-4-5-1423 или П-4-10-1423 по ГОСТ 25336.

      Капельница по ГОСТ 25336.

      Воронки лабораторные по ГОСТ 25336.

      Фильтры бумажные обеззоленные диаметром 7 или 9 см по ТУ 6-09-1678.

Термометры стеклянные жидкие (не ртутные), диапазон измерения (0-100) С, цена деления шкалы 1⁰ С по ГОСТ 9177-74.

Термостат, позволяющий поддерживать температуру (15-55) ⁰ С, с отклонением от заданной температуры ± 1⁰ С.

Шкаф сушильный лабораторный, произведенный по ГОСТ 7365-55.

Спектрометр атомно-адсорбционный, определяющий наличие металлов в исследуемых образцах.

Альфа радиометр, регистрирующий альфа-излучение в воде.

Бетта - и гамма- спектрометр с программным обеспечением «Прогресс», регистрирующий радиационную активность.

Хроматограф газовый лабораторный с пламенно-ионизационным детектором и программированием температуры, термостатом на температуры не ниже 200⁰ , с испарителем температуры не ниже 300⁰

3.     Биологические модели:

-         при изучении бактерицидного и/или бактериостатического действия веществ использовали референтный штамм Staphylococcus aureus 209 P.

-         в опытах по изучению гистологических и фармакологических характеристик эффективности действия сконструированного липосомального лечебно-профилактического средства использовали нелинейных белых крыс самок массой до 200 г. из питомников Пятигорской фармацевтической академии.

2.2. Методы исследования

 Органолептические и токсикологические методы стандартизации

(субъективные)

К органолептическим методам относят установление внешнего вида, запаха, а также при возможности и вкуса исследуемого объекта. Данным  испытаниям на соответствие нормативной документации подвергалось как сырье, так и готовые косметические изделия.

Токсикологические показатели, кожно – раздражающее, кожно – резорбтивное и сенсибилизирующее действие косметического средства определяли согласно требованиям СанПиН 1.2.681-97 и Инструкции по экспериментально-клинической апробации (1986г.).

 Физико-химические методы стандартизации

(объективные)

Определение содержания радионуклидов в растительном лекарственном сырье

Исследования проводили в соответствии требованиями ОФС 42-001-03.

Определение цезия-137 при экспонировании счетного образца 1800с  проводили с использованием аттестованной геометрии – сосуда Маринелли объемом 1 л. Предварительно сырье измельчали  до размера частиц менее 7 мм. Анализ на содержание стронция-90  проводили в  аттестованной геометрии – кювете. Лекарственные травы измельчали до фракции «порошок», проходящей сквозь сито с отверстиями 1мм.

            Для определения удельной активности  цезия-137  использовали гамма-спектрометр, имеющий сцинтиляционный детектор, находящийся в свинцовой камере, с толщиной стен более 50 мм. Измерение  удельной активности стронция-90  проводили на бетта-спектрометре, установленном в свинцовой камере. Перед измерением проводили  концентрирование исследуемого объекта. При регистрации результатов использовали  программное  обеспечения «Прогресс».

          Радиационные измерения готовой продукции проводили аналогичными методами.

Исследование радиационной активности воды из природного родника       г. Ставрополя

                Радиационная безопасность воды определялась ее соответствию нормативам по  показателям общей a - и b- активности Сан Пин2.3.2. 1078-01с дополнениями и изменениями   № 2.

              Измерение общей a - радиоактивности  проводили по методике с применением «толстослойных» счетных образцов, приготовленных из воды  путем выпаривания. Выпаренные образцы измеряли на Альфа радиометре с использованием программно-аппаратурного комплекса «Прогресс». Сущность методики заключается в регистрации альфа излучения, испускаемого веществом счетного образца, с последующей обработкой зарегистрированных импульсов на компьютере.  Измерение бета радиоактивности проводили на Бета радиометре также с использованием программно-аппаратурного комплекса «Прогресс», регистрирующем бета излучения.

          При измерении   счетного образца на Альфа радиометре значение суммарной удельной активности альфа излучающих радионуклидов определяли из выражения (МИ 2707-2001):

                                                   А _уд    =            S-F                          

                                                                       S _i    ^ТЛР _i К_i            (1),

где А _{уд    -} суммарная удельная активность альфа излучающих радионуклидов в счетном образце;

S -  скорость счета импульсов при измерении счетного образца;

F -  фоновая скорость счета;

К_i – предполагаемый относительный вклад радионуклидов с энергией альфа частиц  Е_i  в суммарную активность альфа излучающих радионуклидов в данном счетном образце.

В соответствии с этим                  S _i   К_i  = 1      (2)

   ^ТЛР _I  - значение эффективности регистрации излучения частиц с энергией Е_i

                                   Е_i   - Е_g                

                                                ^ТЛР _I = ^ТЛР ₀    х    Е₀ – Е_g                        (3),

где  Е_{g      -}     нижний энергетический порог регистрации частиц радиометром;

Е₀ – энергия альфа частиц в образцовом градуировочном «толстослойном» источнике известной удельной активности  (образце сравнения).

                                                                       S₀ - F

                         ^ТЛР ₀     =                     ^ТЛА _0,уд                          (4) ,

Здесь  ^ТЛА _0,уд      - удельная эффективность альфа- излучающего радионуклида в образце сравнения;

F – фоновая скорость счета.

Суммарную бета активность измеряли на бета спектрометре также с использованием программно-аппаратурного комплекса «Прогресс», регистрирующем бета излучения.

Измерение массовой доли металлов в сырье и готовой продукции

          Для установления массового содержания металлов в сырье и готовой продукции применяли атомно-адсорбционный спектрофотометр, укомплектованный горелкой для воздушно-ацетиленового пламени корректором фонового поглощения и источниками резонансного излучения свинца, кадмия, цинка, меди, железа (лампами с полым катодом, безэлектродными разрядными лампами или другими равноценными источниками). Допускается применение спектрофотометра без корректора фонового поглощения при условии проведения экстракционного концентрирования.

Метод основан на деструкции органической основы  минерализацией,

последующем растворении в водных растворах кислот и поглощении света свободными атомами химических элементов. На спектрофотометре измеряется оптическая плотность, прямо пропорциональная концентрации элемента в пробе .

Определение количества липидов в лекарственных травах

Количество липидов в 1 мл экстракта определяли по следующей формуле:

                                                 М = М₂-М₁                   (5),

                                                             V

где М – масса липидов в 1 мл в мг;

М₂ -  масса колбы с сухим остатком фосфолипидов в мг;

М₁ – масса пустой колбы в мг;

V – объем раствора фосфолипидов, взятого в опыте в мл.

Сущность метода заключается в определении  количества липидов по весу сухого остатка после удаления  органической фазы.

Биологические методы исследования

Микробиологические исследования санитарного состояния производственных помещений и оборудования, сырья и готовой продукции

Так как при санитарной обработке помещений и оборудования были использованы дезинфицирующие растворы, содержащие хлор, то необходимо также производить контроль на полноту споласкивания от остатков хлора. Для этого в коническую колбу вносят 0,5 г  химически чистого йодистого калия, растворяют его в 1-2 мл дистиллированной воды, затем туда же прибавляют буферный раствор в количестве, равном полуторной величине щелочности воды, после чего прибавляют 100 мл испытуемой воды.

                При малом содержании активного хлора берут для титрования больше объема воды. Выделившийся йод оттитровывают  тиосульфатом натрия, прибавляя его  из микробюретки до слабо- желтоватого окрашивания, затем прибавляют 1 мл раствора крахмала и жидкость дотитровывают тиосульфатом натрия до обесцвечивания. Расчет проводят по формуле:

                                                     Х=  п*0,177*100

                                                                   V                   (6),

где Х – содержание хлора, мг\л;

п – количество мл раствора тиосульфата натрия;

V – объем взятой для определения воды, мл.

                 Смывы для контроля  КМАФАнМ (кое/см²) с оборудования берут стерильным тампоном с поверхности 10*10 см. После протирания тампон помещают в банку, колбу или пробирку с определенным количеством стерильной водопроводной воды, выдерживают его в воде не менее 10 мин, энергично перемешивают тампоном в пробирке и пипеткой высевают 1  с м³

Количество микроорганизмов вычисляют по формуле:

                                                                Х= А*Б              (7),

                                                                         В

где Х – число микроорганизмов на 1 см² поверхности;

А – число колоний, выросших на питательной среде в чашке;

Б – количество воды, находящейся в банке или пробирке;

В – площадь ограничения    поверхности.

Общее количество проб при контрольных исследованиях одного маршрута мойки должно составлять не менее трех.

Микробиологический контроль родниковой воды

Определение общего количества бактерий в исследуемой  минерализованной воде проведено согласно требованиям ГОСТ 18963-73. Сущность метода заключается в определении в 1см³ воды общего содержания мезофильных, мезотропных аэробов и факультативных анаэробов, способных расти на питательной среде  при температуре (37± 0,5)⁰  в течении 24±2  ч, образуя колонии, видимые  при увеличении в 2-5 раз.   Из каждой пробы делали посев не менее двух различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы на  чашках выросло от 30 до 300 колоний. После внесения воды в чашки Петри ее заливали 10-12  мл остуженного питательного агара. И отставляли чашки до застывания среды. Затем, когда среда застыла, чашки с посевами помещали в термостат.     Подсчитывали 20 квадратов, площадью 1см²    каждый в разных местах чашки, после чего выводили среднее арифметическое число колоний на 1см²  , величину которого умножают на площадь чашки, вычисленную по формуле:

                                                               S = r ²  Х   p.    (8).

        При  определении количества бактерий группы кишечная палочка согласно требованиям ГОСТ 18963-73 учитывалось, что к группе кишечных палочек относят грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при (37± 0,5)⁰  С в течении 24 часов и не обладающие оксидазной активностью. Количество бактерий группы кишечной палочки определяют методом мембранных фильтров и бродильным методом.

          Мы применяли бродильный метод, так как  при его выполнении не требуется закупка дорогих реактивов. Уже на начальной стадии анализа можно судить о наличии микробной загрязненности. Сущность методики заключается в посеве  на питательные среды определенных объемов анализируемой воды, и подращивании бактерий при (37± 0,5)⁰  С в средах накопления с последующим высевом бактерий на плотную среду Эндо, дифференцировании выросших бактерий и определении наиболее вероятного числа бактерий в 1 мл воды. Воду помещают в пробирки с глюкозопептонной смесью и индикатором, снабженные поплавками, а затем инкубируют в течение 24 ч.  В  результате анализов в пробирках  с посевами отсутствовало помутнение и образования кислоты и газа, что позволило сделать вывод об отсутствии бактерий в исследованном объеме воды.

      Исследования воды на наличие Pseudomonas aeruginosa  состоит из 3-х этапов: 1) накопление в жидкой среде обогащения; 2) выделение на плотной селективно- дифференцированной среде; 3) идентификация с использованием ограниченного набора наиболее надежных тестов. При анализе использовали концентрат Бонде с красителем - кристаллическим фиолетовым.  На втором этапе производили высев на среду «блеск».  Засеянную среду помещали в термостат при 37⁰ на 24-42 часа, с предварительным просмотром через  24 часа.  Металлический блеск колоний Pseudomonas aeruginosa не был обнаружен.

Микробиологический контроль качества тоника

Посевы делались  в  чашках Петри, которые заливали расплавленной и охлажденной до 48-50 ⁰С агаризованной средой. Чашки с посевами инкубировались  при температуре (30±1)  ⁰ С    в течении (72±3) ч..

Количество микроорганизмов в 1,0 г тоника (М) вычисляли по формуле:

                                                 М    =             N  

                                                                   m       *   C       (9),

где   N  - степень разведения навески;

        m – количество инокулята, внесенное в чашку Петри, мл;

       C -   среднее арифметическое значение числа колоний.

 По результатам микробиологических исследований количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, выраженное кое/г (кое колониеобразующие единицы) составило 2 кое/г.

              Определение дрожжей и плесневых грибов осуществляли с помощью методики, основанной на посеве определенных количеств тоника в селективные среды, культивировании посевов, подсчете всех видимых колоний дрожжей и плесневых грибов, типичных по макро- и микроскопической морфологии.  Нами был использован метод мембранной фильтрации,  при котором в воронку фильтровального аппарата вносили тоник. Затем фильтр переносили в чашки Петри на поверхность агаризованной среды. Чашки с посевами выдерживали в термостате при температуре (24±1)⁰С в течение 5 суток с  предварительным учетом выросших колоний через 2 суток. По истечению 5 суток нами не были обнаружены крупные, выпуклые, матово-блестящие или плотные с ровными краями серовато-белые колонии.

      При анализе тоника на Pseudomonas aeruginosa   использовали концентрат Бонде с красителем - кристаллическим фиолетовым.  На втором этапе производили высев на среду «блеск».  Засеянную среду помещали в термостат при 37⁰ на 24-42 часа, с предварительным просмотром через  24 часа.  Металлический блеск колоний Pseudomonas aeruginosa не был обнаружен.

                 Методы выявления и определения стафилококков посевом с предварительным обогащением основаны на высеве навески в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризированной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний стафилококков. Перед посевом рН тоника при помощи стерильных растворов лимонной кислоты  доводили  до 7,0±0,2 для предотвращения снижения  рН   среды. Посевы инкубировали при температуре  (36±1)⁰  в течение 48 часов.

 Статистическая обработка результатов экспериментов

Результаты экспериментальных исследования обрабатывались на IBM PC 550 с использованием пакета прикладных программ EXCEL.

Результаты исследований обработаны статистически с вычислением средней арифметической, ее стандартной ошибки и доверительного интервала; сравнение значения средних различий проводили по Стьюденту с использованием критерия t.

Данные исследований обрабатывали по ме­тодике И.А. Ойвина,. По результатам серии опытов, для каждого показателя выводили значение средней арифметической (М). На основе полученных М вычисляли величины квадратичных отклонений (а) по формуле:

                     (10)        

где а² - сумма квадратов отклонений каждой измеренной величины от М, n - число опытов. Из значений s и n вычисляли среднюю ошибку (m) по формуле:                                                               (11)           

Определяли показатель существенности разницы - число, показы­вающее во сколько раз разность между средними арифметическими величинами больше значения корня квадратного из суммы квадратных средних ошибок, рассчитывали по формуле:

                         (12)                     

На основании полученных результатов по таблице Стьюдента вычисляли вероятность различия (р). Различие расценивалось как достоверное при р < 0,05.  В этом случае правильность вывода о существовании различий величин может быть подтверждена в 95% случаев.

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА ОСНОВНЫХ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПРОИЗВОДСТВА ТОНИКОВ ДЛЯ ПРОБЛЕМНОЙ КОЖИ

(результаты собственных исследований)

3.1. Подбор компонентов для производства тоников для проблемной кожи

           В программу профессионального  ухода за проблемным типом кожи,  входит очищение, тонизирование, увлажнение, питание, а также защита от вредных факторов окружающей среды. Завершающим этапом очищения кожи является тонизирование, в результате которого удаляются остатки загрязнений, восстанавливаются  липидные пласты  в  межклеточном пространстве,  активизируются  мембраны  клеток.

           Для повышения  стимулирующих,  витаминизирующих и  бактерицидных свойств данное  средство должно содержать биологически активный  комплекс, состоящий  из  водно-спиртовых экстрактов лекарственных трав, эфирных масел  и косметического глицерина.

3.1.1. Разработка состава  фитокомпозиции

Подбор лекарственных растений в фитокомпозицию тоника для проблемной кожи осуществлялся в два этапа. В начале изучили литературные данные о противовоспалительных и ранозаживляющих свойствах трав, влиянии биологически активных веществ растений на уровень секреции сальных желез и  противомикробное действие (Марголина, 2003). Особый интерес представляли травы, обладающие бактерицидными свойствами.  Изучив действие  различных  растений на кожный покров (Петрухина А. Т., 2003), мы остановились на листьях крапивы двудомной и  шалфея лекарственного, цветках ромашки аптечной, календулы лекарственной и зверобоя продырявленного.

  В выбранных нами растениях содержатся различные биологически активные компоненты. В листьях крапивы  имеется хлорофилл, флавоноиды, дубильные вещества, кремневая и муравьиная кислоты, обладающие  кровоостанавливающим  и  вяжущим  действием, макро  и  микроэлементы: витамин С, кальций, железо, калий,  а  также липиды.  Экстракты  календулы содержат каротиноиды, эфирное масло, органические кислоты, обладающие противомикробным, противовоспалительным, ранозаживляющим и  болеутоляющим действием (Воронков В.Н.,1993). В надземной части зверобоя продырявленного  содержатся биофлавоноиды, эфирное масло, дубильные вещества, аскорбиновая кислота, сапонины, небольшое количество холина и другие вещества, оказывающие бактерицидное действие. Листья  шалфея богаты эфирным маслом, биофлавоноидами, фитонцидами и алкалоидами. Цветы ромашки содержат эфирные масла, аскорбиновую кислоту, холин, липиды и других биологически активные соединения (Gibson J. R., 1996). Биологически активные вещества ромашки аптечной (сесквитерпены, флавоноиды, каротиноиды, кумарины, эфирные масла) и шалфея лекарственного (терпены, сесквитерпены, олеиновая кислота, дубильные вещества), календулы лекарственной (каротин, ликопин, фитонциды, органические кислоты) в сочетанном применении обеспечивают бактерицидное, противовоспалительное и вяжущее действие. Антраценовые производные, флавоноиды зверобоя оказывают регенерирующее,  биостимулирующее и мощное антимикробное  действие. Компоненты экстракта крапивы (витамины С, А, В2,  муравьиная кислота, минеральные соли, дубильные вещества) оказывают  витаминизирующее и регенеративное действие на кожу.

 Правильность сделанного вывода о составе растений подтверждали  на втором этапе с использованием биологической модели – культуры патогенного пиогенного Staphylococcus aureus.  Используя метод серийных разведений в жидкой питательной среде, была изучена  бактерицидная и бактериостатическая активность  водно-спиртовых экстрактов лекарственных растений и сборов в отношении пиогенного стафилококка. Для этого  брали  водно-спиртовые экстракты моно трав и разводили от 1:2 до 1:128 в бульоне Хоттингера.  По результатам исследования бактерицидной активности  каждого объекта, мы увидели целесообразность увеличения концентрации календулы и шалфея в  сборах № 2 , №  3 и № 4, так как эти травы обладают наибольшей активностью в отношении пиогенного стафилококка. Экстракты сбора №1, содержащего все травы в равной доле ; сбора №2, содержащего по   2 части календулы и шалфея и по 1 части крапивы, зверобоя и ромашки; сбора № 3, содержащего по 3 части календулы и шалфея и по 1 части зверобоя, крапивы и цветков ромашки; сбора    № 4,  содержащего по 4 части календулы и шалфея и по 1 части зверобоя, крапивы и цветков ромашки. Полученные данные по водно-спиртовым экстрактам  лекарственных растений приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Определение бактерицидной и бактериостатической активности водно-спиртовых экстрактов лекарственных растений

Примечание: - КОЕ – колониеобразующие единицы;

                        - (-)   -   отсутствие роста микрофлоры.

Учет результатов проводили визуально по отсутствию или наличию помутнения содержимого пробирок, а также путем высева изучаемых препаратов  каждого разведения и из контрольных пробирок на плотные питательные среды: желточно-солевой агар и 5% кровяной агар. Последнее разведение экстрактов  лекарственных трав, высев из которого не дал  роста колоний стафилококка, принимали за минимальную ингибирующую концентрацию – бактерицидное действие испытуемого препарата. О бактериостатическом действии изучаемых препаратов судили по количеству КОЕ стафилококка в конкретном разведении препарата, по сравнению с КОЕ стафилококка, высеянного из контроля культуры. Снижение в опыте КОЕ стафилококка на порядок и более, по сравнению с контролем, свидетельствовало о бактериостатическом действии изучаемых препаратов.

Бактерицидная активность 40 % спирта этилового, с помощью которого проводилась экстракция, отмечена в разведении 1:4, а бактериостатическая в разведении 1:8 – 1:16. Следовательно, бактерицидная и бактериостатическая активность водно-спиртовых экстрактов зверобоя, шалфея, ромашки., календулы, сборов №1, 2,3,4 проявлялась не только за счет действия спирта, но и благодаря действию на стафилококк экстрагируемых из данных лекарственных трав биологически активных веществ.

Для приготовления фитокомпозиции мы выбрали сбор № 3, так как  он обладает наибольшей активностью в отношении стафилококка.   Оптимальный  бактерицидный, витаминизирующий и дезодорирующий эффект обеспечивается за счет синергетического действия биологически активных компонентов, извлеченных в ходе водно-спиртовой экстракции фитокомпозиции.

Основным  источником липидов в косметических тониках для проблемной кожи являются лекарственные растительные средства. Для исследования фракционного состава фосфолипидов, извлекаемых в ходе водно-спиртовой экстракции  из фитокомпозиции зверобоя, шалфея, календулы, ромашки и крапивы, нами был проведен хроматографический анализ экстракта. Результаты данного исследования представлены на таблице 2.

 Таблица 2 - Фракционный состав суммарных экстрактов фосфолипидов растительного сырья (М±m).

На основании полученных данных  можно сделать вывод, что 40 % раствором спирта извлекается комплекс фосфолипидов,  использование которого в косметических препаратах будет способствовать  активному  участию липидов в  процессах  клеточной  регуляции  и  регенерации  липидных  пластов  в  межклеточном  пространстве  кожи.

Количественное определение  липидов, извлекаемых водно - спиртовым раствором из растительного сырья проводили весовым методом. Подробно метод анализа описан во второй главе.  Содержание  липидов  дано  в  таблице 3.

Таблица 3 - Количество липидов, извлекаемое 40%-м  раствором  спирта  этилового из лекарственных трав.

Как видно из таблицы, содержание липидов в  разработанной  фитокомпозиции  колеблется от 37 до 48 мг\мл реднем данное значение составило 42,33± 1,75.

3.1.2.  Выбор вспомогательных сырьевых компонентов

Кроме фитокомпозиции в состав тоников входят следующие компоненты: глицерин косметический для смягчения и увлажнения кожи, масла эфирные в качестве дополнительного компонента БАВ,  консерванты и вода.

Хроническая недостаточность жизненно необходимых элементов в организме закономерно проявляется патологией, сопровождаясь существенными морфологическими и клиническими нарушениями. Так, например, недостаток цинка в  кожном  покрове  вызывает следующие патологические изменения: дерматит, экзему, фурункулез, трофические язвы, слабый рост и выпадение волос (Марголина А.А., 2002).  Медь, цинк, железо играют роль активаторов биологических процессов в  коже. Кремний способствует биосинтезу коллагена, образованию кальция  в костной ткани, обеспечивает заживление ран. Органический кремний играет существенную роль в метаболизме липидов.

Содержание в  природной воде различных компонентов позволяет использовать ее в качестве сырья для производства косметических препаратов. Минеральные воды оказывают на кожу человека лечебное действие, обусловленное основным ионно-солевым и газовым составом.  Химические  элементы, находящиеся в природной воде оказывают существенное влияние на процессы, происходящие в коже. Так, например,  Zn  регулирует работу сальных желез и оказывает противовоспалительное воздействие,  Mg  и Ca  улучшают обменные процессы, происходящие в коже. Введение в рецептуру тоника минеральной или родниковой воды позволяет интенсифицировать некоторые процессы в клетках кожи за счет поступления широкого спектра эссенциальных микроэлементов, содержащихся в применяемом типе воды.

По предложению заслуженного деятеля науки, доктора медицинских наук, профессора В.И. Ефременко нами изучена возможность и целесообразность использования для получения липидного тоника  слабоминерализованной воды источников Северного Кавказа. Нами была взята родниковая вода из природного источника г. Ставрополя, называемого в народе «Родник Пресвятой Богородицы». Оценка   типового  состава этой воды проведена нами, совместно с сотрудниками ассоциации «Биотех» на базе отдела изучения курортных ресурсов Государственного НИИ курортологии Минздрава России, в соответствии с требованиями ГОСТ 2874-82 и ГОСТ 13273-88. Анализ показал, в отличии от водопроводной воды, по макро ионным показателям родниковая  вода относится к бессульфидным, слабоминерализованным водам, слабощелочной реакции среды. Вода обогащена сульфатными и карбонатными анионами и катионами магния, натрия и кальция.  Следует отметить, что по результатам исследований, в родниковой воде содержание сероводорода отсутствует. Основным анионом, превосходящим по содержанию другие, является гидрокарбонат-ион, а основным катионом является кальций, что и характеризует слабощелочные   свойства этой воды. Химический анализ микроэлементного состава природной воды свидетельствует  о содержании меди, железа, цинка, а также кремния.  Особый интерес представляет повышенное содержание кремния в исследуемой природной воде. Кремний необходим для нормального функционирования эпителия и соединительных тканей, которым он  придает прочность и эластичность.             

Для очистки, увлажнения с одновременным питанием проблемной кожи нами предложена следующая рецептура липидного тоника  для домашнего применения, массовая доля, % :

Фитокомпозиция лекарственных растений                                      25.0±0,3

масло эфирное розовое                                                              0.06±0,02

масло эфирное лавандовое                                                       0.02±0,01

глицерин косметический                                                          0.8±0,1

кислота салициловая                                                                 0.01±0,01

кислота лимонная                                                                      0.06±0,01

спирт этиловый, 96 %                                                                3,5±0,5

бензоат натрия                                                                            0,01±0,01

         дистиллированная вода                                                         15,0±0,5

родниковая вода                                                                      до  100

Для профессиональных косметических кабинетов предложен следующий состав липидного тоника  серии «Profi line», рекомендуемый для использования при наблюдении врача-косметолога, (массовая доля %):

Фитокомпозиция лекарственных растений                                  45.0±0,6

масло эфирное розовое                                                              0.06±0,02

масло эфирное лавандовое                                                       0.02±0,01

глицерин косметический                                                          0.8±0,1

кислота салициловая                                                                 0.01±0,01

кислота лимонная                                                                      0.06±0,01

спирт этиловый, 96 %                                                                3,5±0,5

бензоат натрия                                                                            0,01±0,01

         дистиллированная вода                                                             15,0±0,5

родниковая вода                                                                          до  100

В рецептуру тоника введен комплекс масел эфирных розы  и лаванды. Выраженное противовоспалительное, бактерицидное действие лавандового и розового эфирных масел, а также смягчающий и седативный эффект масла  розы позволяют существенно усилить желаемый эффект  и  не вводить  в  рецептуру  синтетическую  отдушку.  Применение  массовой концентрации эфирных  масел  ниже заявленной в рецептуре, не обеспечивает нужного тона аромата и концентрации биологически активных веществ, при введении в состав тоника количества масла  выше указанного в рецептуре средство приобретает  резкий запах.

В качестве смягчающего и увлажняющего  компонента в рецептуру введен глицерин косметический.  Уменьшение концентрации глицерина  ниже указанного предела не обеспечивает смягчающего и увлажняющего эффекта, увеличение дозировки создает плотную консистенцию.

От эффективности антибактериального действия консерванта зависит  качество и безопасность тоника, поэтому его подбор  играет немаловажную роль. Критерием  эффективности консерванта является снижение числа жизнеспособных клеток микроорганизмов в препарате за определенный период времени. В качества  консерванта  в рецептуру введены кислота салициловая, обладающая кератолитическим действием и  бензоат натрия, предотвращающий и ингибирующий рост микроорганизмов.  Бензоат натрия  часто применяется в пищевой промышленности  при  консервации  продуктов. Уменьшение дозы консерванта не обеспечивает заданный эффект, а увеличение – может повлечь за собой аллергические реакции кожи.

В качестве регулятора рН раствора  тоника  в рецептуру  достаточно ввести кислоту лимонную.  Одновременно  лимонная  кислота  усиливает  бактерицидность  тоника. Увеличение ее концентрации выше предлагаемой может привести к аллергической реакции и сухости кожи.

Заявленное содержание спирта этилового, в соответствии с общими требованиями ГОСТ Р 51579-2000 «Изделия косметические жидкие. Общие технические условия» на тоники косметические, обеспечивает некоторый  консервирующий эффект и растворение компонентов. Введение спирта этилового в количестве выше выбранного предела нецелесообразно, т.к. избыток спирта оказывает дубящее воздействие на кожу, пересушивает ее, а недостаток спирта не обеспечивает искомое, консервирующее и растворяющее действие на компоненты.

3.2.         Разработка биотехнологии приготовления тоника для проблемной кожи

      Технологический процесс приготовления липидных  тоников для проблемной кожи состоит из нескольких стадий производства:

-         подготовки сырья;

-         получения экстракта лекарственных растений;

-         приготовления растворов для производства;

-         получения готового продукта;

-          фасовки, упаковки и хранения тоника.

Рассмотрим подробнее каждый из этих процессов.

Стадия подготовки сырья

Подготовка сырья включает в себя процессы взвешивания порошков, отмеривания жидкостей, измельчения растений. Нами разработана блок-схема данной технологической стадии (рисунок3).

                                 На стадию приготовления растворов                                 На стадию экстракции