Серологические реакции
2СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ
СЕРОЛОГИЯ - раздел иммунологии, изучающий взаимодействие АГ
и АТ в пробирочных реакциях (in vitro).
Серологические реакции - реакции с использованием АГ или АТ
(проводящиеся in vitro).
Серологическими методами (в диагностике инфекционных заболе-
ваний) называют совокупность пробирочных реакций, основанных на
АГ-АТ-взаимодействии. /2640к/99/
1) Направленны на выявление в сыворотке крови и других жид-
костях организма АТ к АГ возбудителей инфекционных болезней.
2) Проброчные реакции, имеющие целью обнаружение в сыворотке
крови и других субстратах растворимых микробных АГ с помощью
стандартных иммунных сывороток.
Серологические реакции проводятся с использованием
1) АГ для поиска АТ
2) АТ для поиска АГ
4+ 0 /?/ 4 IN VIVO (кожные пробы, РН in vivo ...)
4- серопрофилактика (введение АГ, АТ)
4В серологчиеские методы не входят реакции, которые ставят на
4людях или животных (реакция Шика, Дика), и серологическая иден-
4тификация культур микроорганизмов (это один из этапов бактерио-
4логического метода.
КЛАССИФИКАЦИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ
1. Двухкомпонентные
- простые (РА,РП)
-- розеточные тесты (РОК)
-- цитофлюоресцентные методы
- сложные (РН /гемадсорбции, токсина, ...,РТГА,РНГА, ре-
акция прямой имунофлюоресценции, реакции адгезии).
Реакции адгезии отличаются взаимодействием частиц, например,
клетки, с серологически активной поверхностью, в т.ч. с другой
клеткой. /2260к/
2. Трехкомпонентные
- простые
-- реакция бактериолиза,
-- реакция коагглютинации
- сложные
-- реакция непрямой иммунофлюоресценции,
-- РИА,
-- РЭМА,
-- литические тесты (РСК, определение АОК с помощью
эритроцитарных АГ-ов),
-- использование электронного парамагнитного и ядер-
но-магнитного резонанса) /7271/87/,
Материал для серологических реакций:
- сыворотка крови (парные сыворотки). Заморозка в течение
10-14 дней.
- ликвор,
- моча,
- фильтрат испражнений,
- промывные воды бронхов, полости рта, глотки, носа /2640к/,
желудка.
- Слизь (шейки матки, ... - здесь АТ порой больше, чем вы сы-
воротке)
Учет серологических реакций осуществляется видуально, иногда
с помощью лупы и редко - микроскопа. /2640к/99/
При оценке серологических реакций применяют 3 главных крите-
рия /2640к/99/:
- наличие и интенсивность реакции (в плюсах и др.),
- диагностический титр, заранее отработанный для всех забо-
леваний,
- нарастание титра АТ в течение болезни в 4 и более раза.
В процессе оценки серологических реакций часто возникает не-
обходимость дифференцировки
1) специфической реакции (на видовые и типовые антигены) от
группоспецифической (на межвидовые АГ) [Группоспец. АГ
Salm. - табл.]
4-- дифференцировка по моноспецифическим антисывороткам,
4-- по скорости нарастания титра АТ, которая выше к специ-
4фическим АГ, 0
4-- по реакции адсорбции АТ избытком антигена
4-- по легкости диссоциации ИК под влиянием диссоцирующих
4факторов 0
2) ИО на текущую инфекцию от ИО на перенесенное ранее заболе-
вание и иммунизацию. /2640к/99/
5-- Оценивают по темпу нарастания АТ.
При постановке любой серологической реакции параллельно с
опытом ставятся _контроли на каждый компонент реакции .:
- микробная культура не должна образовывать хлопья при ана-
логичном встряхивании;
- сыворотка и антисыворотка не должны быть с хлопьями
(хлопья появляются в процессе хранения белков в связи с посте-
пенным оголением углеводных компонентов; углеводные компоненты
белков, будучи жесткими разветвленными структурами, "запутыва-
ются друг в друге", обуславливая агрегацию белков);
- эритроциты не должны быть лизированы;
- сыворотка морской свинки, используемая как источник комп-
лемента, должна лизировать эритроциты (т.е. работать): компле-
мент + ЭБ --- лизис;
- диагностикум не должен содержать хлопьев и пр.
- при поиске АГ обязательно используется параллельно музей-
ный АГ, который должен однозначно выявляться при проведении ме-
тодики (это значит, что все компоненты реакции "работают", ме-
тодика поставлена правильно).
3РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ /РА/
РА - реакции склеивания микробов, частиц латекса или эрит-
роцитов /реакция гемагглютинации - РГА/. АГ-несущие частицы
склеиваются антителами и выпадают в видимый осадок.
1Титром сыворотки 0 считают максимальное разведение, дающее
агглютинацию АГ.
┌ ┐
0 0 0 0 0 = │ 0 0 │
\ / \ / \ / \ / \ / \ / │\ / \ / \ /│
│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
└ ┘n
0 - клетка
>── - молекула антитела
1) _ 2Прямая РА
В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглю-
тинируют корпускулярные АГ (агглютиногены).
- 1Зернистая 0 агглютинация происходит при склеивании микробов,
содержащих О-антиген.
- 1Хлопьевидная 0 агглютинация происходит с бактериями, имеющи-
ми жгутики (Н-антигены).
а) 2Прямая реакция агглютинации (РА)
- _Ориентировочная РА . (на предметном стекле)
1Постановка реакции:
│Микробная суспензия
│+ антисыворотка к микробу
1Результат: 0 - хлопья (агглютинаты)
5Для определения микробного вида (серотипирования) на пред-
5метное стекло наносится 1 капля (0,05мл) диагностической сыво-
5ротки, разведенной физиологическим раствором 1:25. На вторую
5половину стекла наносится капля физиологического раствора
5(контроль). К каждой капле добавляется равный объем испытуемой
5культуры.Слегка покачивая стекло, наблюдать за течением реак-
5ции: феномен агглютинации проявляется выпадением хлопьев и
5просветлением жидкости в капле. В контроле микробная культура
5должна остаться мутной и гомогенной. 0
- _Развернутая РА . проводится в ряду пробирок или лунок для
раститровки сыворотки больного (определения титра АТ)
1Постановка реакции:
│Сыворотка больного, содержащая АТ к микробу --- рас-
│ титровка
│+ микробная суспензия (равное количество во все про-
│ бирки или лунки
1Результат: 0 - хлопья (агглютинаты) микробов
5Для определения антител в сыворотке крови больного поста-
5вить в штатив 7 пробирок и налить в каждую из них по 0,5 мл фи-
5зиологического раствора. Добавить в первую пробирку 0,5 мл сы-
5воротки больного, разведенную в 50 раз, перемешать. 0,5 мл из
5первой пробирки перелить во вторую, перемешать; из второй про-
5бирки 0,5 мл перелить в третью и т.д. Из последней пробирки вы-
5лить для равенства объемов 0,5 мл в банку с дезраствором.В каж-
5дую пробирку добавляют по 2 капли антигена или диагностикума.
5Оформить 2 контроля - контроль антигена (для исключения спон-
5танной агглютинации) и контроль сыворотки в исходном разведении
51:50.
5Рабочая схема РА:
5──────────────────────────────────────────────────────────────
5Ингредиенты │ Ряд пробирок
5│------------------------------------------------
5│ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7
5──────────────────────────────────────────────────────────────
51. Физраствор 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,5
52. Сыворотка 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
5больного 1:50
5Полученные
5титры 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:50 -
53. Диагнос-
5тикум в
5каплях 2 2 2 2 2 - 2
5Инкубация в термостате 2 часа при 370С, затем при
5необходимости 24 часа при комнатной температуре.
5Учет результатов реакции проводят через 24 часа по следующей
5схеме:
5++++ полная агглютинация, жидкость прозрачная, выраженный
5осадок;
5+++ жидкость слегка опалесцирует, но осадок хорошо выражен;
5++ или + сомнительная реакция, жидкость равномерно мутная,
5осадок отсутствует. 0
5- отрицательная реакция, жидкость равномерно мутная,
5осадок отсутствует.
5Титром агглютинирующей сыворотки считается то ее максималь-
5ное разведение, при котором еще происходит реакция не менее,
5чем на три плюса.
5Артефакты:
5- наличие СРБ, агглютинирующего микробы (стафилококки,
5стрептококки)
5- наличие перекрестных антигенов
б) 2Прямая реакция гемагглютинации (РГА)
- вирусами (эритроцитов любого вида животного)
- при смешивании двух разногруппных проб крови (определе-
ние групп крови)
1Постановка реакции:
│Субстанция, склеивающая эритроциты (сыворотка, вирусы)
│+ эритроциты --- хлопья
1Результат: 0 - хлопья (означают присутствие АТ)
1Варианты постановки:
- _Ориентировочная РА . (на предметном стекле)
- _Развернутая РА . проводится в ряду пробирок или лунок для
раститровки сыворотки больного (определения титра АТ)
5Материал с вирусом титруют от 1/10 до 1/1280. 0,5мл данного
5материала смешивают с 0,5мл 1-2% эритроцитов. Инкубируют 30 ми-
5нут при 37оС или 45 минут при комнатной температуре. Титром ви-
5руса считается его наибольшее разведение, при котором наблюда-
5ется агглютинация эритроцитов.
5Прямая гемагглютинация, вызываемая бактериями, коррелирует с
5их способностью прикрепляться к клеткам макроорганизма, отража-
5ет вирулентные свойства. (Предложен метод селекции наиболее ак-
5тивных клеток из культуры путем их адсорбции на эритроцитах с
5последующим высевом на плотные среды.)-[11ц301-81]
2) _ 2Непрямая РА
= 2РНГА (РПГА 0; РНГА=РПГА 2) (реакция пассивной 0 2или 0 2непрямой ге-
2магглютинации)
1Варианты постановки:
- _Ориентировочная РА . (на предметном стекле)
- _Развернумая РА . проводится в ряду пробирок или лунок для
раститровки сыворотки больного (определения титра АТ)
┌ ┐
│ .0. .0. │
│\ / \ / \ /│
│ │ │ │ │
└ ┘n
К носителю (эритроцитам, стафилококку, частицам латекса /ла-
текс-агглютинация/ и пр. химическим способом "пришивают" анти-
гены, ампулируют и выпускают в биотехнологической промышленнос-
ти как диагностикумы.
1Постановка реакции:
│Сыворотка больного --- раститровка
│+ диагностикум в каждую лунку ---
1Результат: 0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть),
- "пуговка" (РА нет)
Последняя ячейка с положительной пробой ("зонтиком") означа-
ет титр АТ.
5Сорбция на носителе либо АГ (РНГА=РПГА), либо АТ (обратная
5РПГА).
5Реакция ставится в двух вариантах. Антиген (РПГА) или анти-
5тела (РНГА) связываются с крупным носителем с последующим выяв-
5лением уровня специфических иммуноглобулинов или антигена.
5Исследуемый антиген "сшивается" танином или глютаровым ди-
5альдегидом с эритроцитами или частицами латекса.
5Сыворотка больного, прогретая 30 минут при 56оС, раститровы-
5вается (0,5мл) и смешивается с 2 каплями эритроцитарного диаг-
5ностикума.
3) _ 2Проба Кумбса . 0 (непрямая пассивная гемагглютинация;
антиглобулиновый тест)
Для постановки этой реакции необходима антиглобулиновая сы-
воротка, которую получают путем иммунизации кролика иммуногло-
булинами человека.
Используется для определения неполных (функционально однова-
лентных) антител, например, "ро"-антител к эритроцитам плода
при резус-конфликте, ряд аутоантител, АТ к некоторым микробам и
пр. Эритроциты плода в условиях in vivo не агглютинируют, одна-
ко при обработке их in vitro антисывороткой к гамма-фракции ан-
тител человека происходит РА на стекле (= _ориентировочная . реак-
ция Кумбса). К сыворотке добавляется антиген (резус-фактор) и
затем антисыворотка против гамма-глобулинов, что вызовет агглю-
тинацию загруженных эритроцитов. _Развернутая . реакция Кумбса (в
ряду пробирок или лунок) применяется для определения титра цир-
кулирующих неполных антител в сыворотке больного.
┌ ┐
│ 0 0 │
│ \ / \ / \ / \ / -АТ 41 0│
│ │ │ │ │ │
│ \ / \ / \ / │
│ │ │ │ │
│ АТ 42 0 АТ 42 0 АТ 42 0 │
└ ┘n
1Постановка реакции:
│Сыворотка (АТ 41 0) --- раститровка
│+ эритроциты (с Rh-антигеном)
│+ антисыворотка к Fc-фрагменту Ig G (АТ 42 0).
1Результат: 0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть),
- "пуговка" (РА нет)
Последняя ячейка с положительной пробой ("зонтиком") означа-
ет титр АТ.
4) _ 2Реакция коагглютинации 0 2(РКОА 0, РКА 2)
1Варианты постановки:
- _Ориентировочная РА . (на предметном стекле) --- хлопья
- _Развернумая РА . проводится в ряду пробирок или лунок для
раститровки сыворотки больного (определения титра АТ)
L[+]
┌ │ ┐
│ ┌─┴─┐ 4 0 │
│ 0> 4── 0┤St.├ 4─ 0─<0│
│ └─┬─┘ 4 0 │
│ │ │
└ ┘n
К носителю - клеткам инактивированного золотистого стафило-
кокка (Staphylococcus aureus), несущего на своей поверхности
белок А (функциональный аналог FcR) добавляют необходимые АТ
(антисыворотку) и после инкубации - исследуемую жидкость с
предполагаемыми АГ-ми.
1Постановка реакции:
│Стафилококковый диагностикум
│+ АГ
1Результат: 0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть),
- "пуговка" (РА нет)
Последняя ячейка с положительной пробой ("зонтиком") означа-
ет титр АТ.
5Реакция Ко-агглютинации (РКА) предложена в 1973г. Kronvall
5для постановки диагноза пневмококковой инфекции. Сейчас она ис-
5пользуется для диагностики эшерихиозов, коклюша, менингококко-
5вой, стрептококковой инфекции, сальмонеллезов и шигеллезов, а
5также для обнаружения некоторых бактериальных токсинов.
5/2119к/85/
5Реакция пригодна для идентификации различных антигенов путем
5агглютинации стафилококков, сенсибилизированных антителами про-
5тив детерминант бактериальной, вирусной или неинфекционной при-
5роды. /2111к/
5Например, для индикации шигелл зонне в молоке, кефире и в
5материалах от людей. Для определения чувствитель-
5ности РКОА ставили с 10-кратными разведениями 1 млрд. микробной
5взвеси шигелл Зонне. Чувствительность РКОА составила 108-109
5микробных тел в 1 мл взвеси. /2111к/
5Стафилококковый реагент выпускается Ленинградским НИИЭМ им.
5Пастера и используется его 2% взвесь. Для сенсибилизации ис-
5пользуются сыворотки с титром антител в РПГА не ниже 1:12800.
5/2111к/
5На предметное стекло капают 2 капли по 0,1 мл диагностикума
5и испытуемый материал. Положительным результатом считалось об-
5разование агглютината с полным просветлением смеси. (Контроль -
5с физраствором и реакция с заведомо инфицированным материалом.)
4Определение энтеротоксина в реакции
4коагглютинации
4Культуру сальмонелл осаждают (8000 об./мин.;20 минут), к
4осадку микробов добавляют 0,5 мл дистиллированной воды, готовят
4лизат, вновь центрифугируют (8000 об./мин.;20 минут) и с надо-
4садком (супернатантом) проводят реакцию. /1804к/88/
4В реакции используют диагностикум - золотистый стафилококк с
4"пришитыми" к нему антителами к токсину. 2-3 капли реагента + 1
4капля супернатанта культуры сальмонелл больного --- РА (оценка
4+, ++, +++, ++++ после 3-минутного покачивания). /1804к/88/
5) _ 2РТГА (реакция торможения гемагглютинации)
Гемагглютинин (НА) вирусов заблокирован антителами (первые
ячейки с " _пуговками ." = РА нет):
L[+]
┌ ┐
│ ┌───┐ ┌───┐ │
│ ──<0>── │Эр.│ ──<0>── │Эр.│ ──<0>── │
│ └───┘ 7 0 └───┘ │агглютинации
└ ┘эритроцитов
нет
0 - вирус (=торможение
>── - антитела агглютинации)
При "следовых" количествах антител к гемагглютитину (НА) или
их отсутствии гемагглютинин ("клей для эритроцитов") вирусов
остается "открытым" (не закрыт антителами) и происходит склеи-
вание эритроцитов (последние ячейки с " _зонтиками ." = РА есть):
L[+]
┌ ┐
│ ┌───┐ ┌───┐ │
│0│Эр.│0│Эр.│0│
│ └───┘ └───┘ │
└ ┘n
а) Определение титра АТ к определенному вирусу (добавляется
антисыворотка к НА /гемагглютинин видоспецифичен/ данного виру-
са).
1Постановка реакции:
│Сыворотка больного --- раститровка
│+ суспензия музейных инактивированных вирусов
│ (или диагностикум)
│+ эритроциты любого вида животного
1Результат: 0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть, АТ нет
- "пуговка" (РА нет, АТ есть
Последняя ячейка с положительной пробой ("пуговкой") означа-
ет титр АТ.
б) Определение типа вируса, допустим, гриппа (А, А или С) у
больного по выделенной культуре
1Постановка реакции:
3 ряда лунок в иммунологической планшете:
│Антисыворотка к вирусу гриппа типа А --- раститровка
│Антисыворотка к вирусу гриппа типа В --- раститровка
│Антисыворотка к вирусу гриппа типа С --- раститровка
│+ Вирус-содержащий материал от больного (культура, но-
│ совая жидкость) во все 3 ряда
│ (Или наоборот, раститровка в 3 рядах вирусов + АТ,
│ если нужно сориентироваться в количестве вирусов)
│+ эритроциты любого вида животного
1Результат: 0 - ряд с "пуговками" означает тип вируса.
5- Сыворотку титруют (1/10-1/2560) - 0,25мл;
5- добавляется вирус в четырехкратном титре (разведение в 4
5раза от исходного титра)
5- инкубируют 30 минут при 37оС
5- добавляют 0,5мл 1-2% взвеси эритроцитов
5- инкубируют 30 минут при 37оС или 45 минут при комнатной
5температуре.
в) Определение типа вируса, допустим, гриппа (А, А или С) у
больного по наличию антител в сыворотке крови
1Постановка реакции:
3 ряда лунок в иммунологической планшете:
│Сыворотка больного --- раститровка в 3 рядах
│+ Музейный вирус типа А (в первый ряд)
│+ Музейный вирус типа В (во второй ряд)
│+ Музейный вирус типа С (в третий ряд)
│+ эритроциты любого вида животного
1Результат: 0 - ряд с наибольшим количеством "пуговок" означает
наибольший титр АТ у больного к данному типу
вируса, что предположительно говорит о соот-
ветствующем гриппе (для доказательства оценива-
ют титр АТ в динамике с интервалом в 2 недели;
при увеличении титра минимум в 4 раза можно го-
ворить об острой инфекции и соответствующем за-
болевании).
3РЕАКЦИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ
Реакции иммобилизации основаны на способности специфических
АТ, циркулирующих в сыворотке больных, подавлять подвижность
различных микроорганизмов.
На практике нашли применение реакции иммобилизации бледной
трепонемы и холерного вибриона.
3РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РП)
- реакции взаимодействия между антигеном и антисывороткой с
образованием видимого "осадка" (преципитата) - преципитирующих
иммунных комплексов (ПИК). 5МАТ (моноклональные АТ) одновалент-
5ные, поэтому в РП пока не используются. 0
┌───────────────── РП ────────────────────┐
_В жидкой фазе . _В агарозе . (1%)
- реакции кольце- - в т.ч. электрофоретические
преципитации (в этом случае агароза варится
- нефелометрия на веронал-мединаловом буфере
(ВМБ, рН 8,6)
Механизм взаимодействия антигенов и антител:
АГ │ АГ=АТ │ АТ
(пропорциональное
количество АГ и АТ;1:1)
│ │ │ │ │ │ │
│ │
┌───┐ о о │ / \ / \ / \ / \ / \│ Y Y ┌───┐
│АГ │ о о │ о о о о о │ Y Y │АТ │
└───┘ 7 0 о │ \ / \ / \ / \ / \ /│ Y └───┘
о о │ │ │ │ │ │ │ Y
ПИК
(преципитирующие ИК,
преципитат)
1) _ 2Реакция кольцепреципитации
│─│
│ │- АГ
│ │
│=│- зона преципитации (помутнения) в пробирке или капилляре
│ │
│ │ - Антисыворотка
└─┘
а) _Определение С-реактивного белка . (СРБ): капилляр наполови-
ну заполняют антисывороткой к СРБ и дополняют сывороткой боль-
ного. Капилляр вставляют в пластелиновую пробку и оставляют до
утра. Помутнение на границе раздела свидетельствует о наличии
СРБ в кровотоке (количество СРБ пропорционально интенсивности
деструктивных процессов в организме).
5Треть капилляра заполняют антисывороткой и через этот же ко-
5не 0ц 5 треть - исследуемой сывороткой. Капилляр покачивают 12-15
5раз для смешивания ингредиентов и устанавливают вертикально на
5пластилиновый штатив. оставляют 24 часа при комнатной темпера-
5туре. Помутнение на границе раздела свидетельствует о наличии
5СРБ в кровотоке (количество СРБ пропорционально интенсивности
5деструктивных процессов в организме).
5Результат оценивают по высоте преципитата в капилляре.
б) _Диагностика сибирской язвы
Прокипяченый инфицированный материал
+ антисыворотка (медленно наносить; по стенке пробирки сте-
кает под слой АГ)
Инкубация несколько минут. Зона помутнения свидетельствует о
присутствии АГ в материале.
2) _ 2Нефелометрические, тербидиметрические методы
Принцип нефелометрии заключается в измерении количества све-
та, рассеиваемого частицами (ПИК) в жидкой среде. Для нефело-
метри оптимальны растворы низкой концентрации (в отличие от
турбидиметрии, для которой оптимальны растворы высокой концент-
рации, поскольку в этом случае измеряется потеря проходящего
света).
5Чувствительность метода - 100 мкг/мл антител или антигена
5при исследовании цельной сыворотки и 1 мкг/мл при исследовании
5чистых растворов. Данным методом можно проводить до 120 анали-
5зов в час. Время образования ИК можно значительно сократить,
5если ее проводить в 4% полиэтиленгликоле с М. 6000Д.
3) _ 2Метод преципитации в геле по Оухтерлоню
Стекла или чашки Петри заливают 1-2% агаром или агарозой.
После застывания агара вырезают по трафарету лунки. В одни лун-
ки вносят исследуемые сыворотки (препараты), в другие, располо-
женные напротив - соответствующие антисыворотки. Пластины инку-
бируют во влажной камере в течение 24-48 часов.
Варианты постановки:
- 2 лунки (диаметром 3-5 мм) на расстоянии 3-5 мм друг от
друга (одна с АТ, другая с АГ);
- в центре лунка с антисывороткой, вокруг лунки с разными
пробами АГ-содержащего материала (или наоборот, в центре - АГ,
по периферии - АТ);
- бороздка (или полоска пропитанной фильтровальной бумагой,
наложенной на агарозу) с антисывороткой (АТ-ми), по бокам лунки
с АГ или бляшки микробов, синтезирующих токсин (определение
токсигенности дифтерийной палочки).
4) _ 2Метод преципитации в геле по Манчини
_ 2(метод радиальной иммунодиффузии - РИД)
/ \---- зона преципитации
│ о--│---- лунка с точно дозированным количеством
\ 4--- 0/ сыворотки
Метод количественного определения антигенов основан на изме-
рении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении
исследуемой сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в кото-
ром предварительно диспергирована моноспецифическая антисыво-
ротка. В слое агара пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм
на расстоянии 15мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят
с помощью микрошприца по 2мкл антигена (или стандартной сыво-
ротки) в разведениях 1/1, 1/2, 1/4, 1/8. Лунки следующих рядов
заполняются испытуемыми препаратами. Пластины инкубируют во
влажной камере в течение 24 часов (пластины с анти-Ig M сыво-
роткой - 48 часов). По окончании инкубации измеряют диаметры
колец преципитации. Концентрацию антигена определяют по калиб-
ровочной кривой.
Например, определение концентрации Ig M,G,A в сыворотке кро-
ви больных.
5) _ 2Ракетный электрофорез 0 2(электроиммунодиффузия)
1/4 о=== о - лунки с точно дизированным
1/2 о====== количеством сыворотки
1/1 о========== === - зоны преципитации
2- + 0 (измеряется длина зон, мм)
Катод Анод
1/1, 1/2, 1/4 - разведения стандартной сыворотки (т.е.
сыворотки с известным количеством антител)
Ставятся для построения калибровочной кривой.
В 1966г. Laurell разработал метод, сочетающий иммунодиффузию
с электрофорезом. Антиген движется в геле агарозы, содержащем
антисыворотку. Для электрофоретических реакций преципитации
агарозу расплавляют в веронал-мединаловом буфере (рН 8,6) в во-
дяной бане, остужают до 52 5о 0С, смешивают с антисывороткой и за-
ливают на стекло.
После застывания (через 5 минут) вдоль кромки слоя геля де-
лают ряд лунок, в которые помещают исследуемый материал. В слое
геля создают электрическое поле, благодаря которому антиген
входит в гель. Зона преципитации приобретает вид "ракеток". Вы-
сота "ракеты", образующейся в результате реакции, прямо пропор-
циональна концентрации антигена (она измеряется от верхней гра-
ницы лунки до высоты пика).
6) _ 2Противоточный или встречный электрофорез . 0 (экспресс-диаг-
ностика вирусных и др. инфекций)
4Встречный ИЭФ (иммуноэлектрофорез) был применен Бендарид в
41969г. Электрическое поле усиливает способность к взаимодейс-
4твию низкореактогенных АГ и АТ. Чувствительность метода в 10
4раз превышает чувствительность метода двойной иммунодиффузии по
4Оухтерлони. /2400к/
Основное условие метода - наличие электрофоретической под-
вижности АГ.
┌─────────────────────────────────┐
2- 0 │ 0 │ 0 0 │ 2+
Катод │ АТ АГ АТ │ Анод
│ ПИК │
└─────────────────────────────────┘
В две лунки геля заливают антиген и антитела, пластину ста-
вят в камеру для электрофореза и включают напряжение. Электри-
ческим полем значительно ускоряется движение компонентов и ре-
акция преципитации проходит за 30-40 минут. Экспресс-диагности-
ка
7) _ 2Иммуноэлектрофорез (ИЭФ)
┌───────────────────────────────────────┐ +
│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │
│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │
│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │
│ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о │
│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │
│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │
│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │
└───────────────────────────────────────┘ -
1Постановка реакции:
│- В лунки заливается исследуемая смесь веществ,
│ пластина с агарозой ставится в электрофоретическую камеру
│ на ночь для разгонки белков.
│- Вынимается агароза из бороздок. В них заливается антисыво-
│ ротка (удобнее чередовать антицельную сыворотку с моноспе-
│ цифической к искомому компоненту). Ночь во влажной камере.
1Результат: 0 оценивается степень чистоты препарата по коли-
честву "лишних" дуг зон преципитации примесей с
антицельной сывороткой (если препарат получали из
крови).
5В геле, приготовленном на веронал-мединаловом буфере (рН
58,6), по трафарету делаются бритвой полоски и лунки. Гель из
5лунок вынимается (из бороздок нет) и лунки заполняют смесью ан-
5тигенов или исследуемой сывороткой. Пластина ставится в прибор
5для электрофореза и в течение ночи проводится разгонка исследуе-
5мых белков. На следующий день освобождаются от геля бороздки и
5заполняются моноспецифическими и полиспецифическими (часто ан-
5тицельной) антисыворотками. Пластина оставляется на ночь во
5влажной камере для реакции преципитации.
58) _Перекрестный электрофорез
5Смесь исследуемых белков разгоняется поперек пластины в
5электрическом поле, затем к полоске геля с разделенными белками
5приливается расплавленный гель с антисывороткой к исследуемым
5компонентам и разгонка проводится в продольном направлении.
5Формируются широкие отдельные зоны преципитации исследуемых
5компонентов белков.
3РЕАКЦИЯ ФЛОККУЛЯЦИИ
┌ ┐
│ 0 0 │ - хлопья флоккулята
│\ / \ / \ /│ (помутнение в пробирке)
│ │ │ │ │
└ ┘n
0 - молекула антигена (токсина или др.)
>── - молекула антитела
5В результате взаимодействия токсина или анатоксина с анти-
5токсической сывороткой выпадают хлопья флоккулята. Наиболее
5ранняя флоккуляция наблюдается в пробирке, где антиген и анти-
5тело содержатся в эквивалентных соотношениях.
5Одна флокуллирующая единица токсина (Lf - Limes flocculatio-
5nis) в 1 мл определяется минимальным количеством токсина, даю-
5щим начальную флоккуляцию с 1 международной единицей (МЕ) сыво-
5ротки.
52мл токсина (20 Lf в 1 мл) смешивают в пробирках с разными
5количествами сыворотки (0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 мл), инкубируют
530 минут при 45оС до выпадения хлопьев в одной из них. Если
5флоккуляция произошла в 3 пробирке, значит, в 0,4мл сыворотки
5находится 40МЕ. Следовательно, 1мл сыворотки содержит
540:0,4=100 МЕ. 0
3РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ
(ИФМ - иммуно-флюоресцентный метод)
1) _Прямой метод . иммунофлюоресценции (по Кунсу) основан на
взаимодействии антител, меченых флюорохромом, с антигеном, ко-
торый находится на клетке, в клетке или в тканях.
В качестве флюорохрома используют
- флюоресцеинизотиоционат (ФИТЦ), дающий зеленое свечение в
УФ-ых лучах;
- тетраметилродаминизотиоцианат (ТРИТЦ) с оранжево-красным
свечением. /2551к/
┌────────────────────────┐ 4Y
│ 1┌┬┬┐ 0 │ │ - АТ
│ 1└┴ 4Y 1┘ 0 │ * - метка флюорохрома (светя-
│ │* │ щаяся в темном поле зрения
└────────────────────────┘ люминесцентного микроскопа)
Предметное стекло с препаратом
4(после промывки от несвязавшихся АТ)
1Постановка реакции:
│Фиксированный мазок
│+ диагностическая сыворотка с АТ-ми, мечеными ФИТЦ.
│Отмывка от несвязавшихся антител.
│Люминесцентная микроскопия (при положительном результате
│ видно свечение.
5Материал (препарат ткани, микроорганизмов или антигена) на-
5носится на стекло, фиксируется 15 минут в спирте или в пламени
5горелки, обрабатывается флуоресцирующей сывороткой (15-30 минут
5при комнатной температуре), промывается 15 минут физиологичес-
5ким раствором; проводится люминесцентная микроскопия. Отсутс-
5твие свечения свидетельствует об отсутствии антигена на препа-
5рате.
5Для получения флуоресцирующих антител к раствору иммуногло-
5булинов добавляют раствор флуоресцетина изотиоцианата натрия
5(можно 5-диметиламино-1-нафталинсульфонилхлорид и изотиоцианат
5лизамин родамина В 200).
2) _Непрямой метод
┌────────────────────────┐ 4Y 0 >─── - АТ 42 0 (меченые
│ 1┌┬┬┐ 0 │ │ - АТ 41 0 флюорохромом)
│ 1└┴ 4Y 1┘ 0 │ * - метка флюорохрома
│ │>───* │
└────────────────────────┘
Предметное стекло с препаратом
4(после промывки от несвязавшихся АТ)
1Постановка реакции:
_1 вариант
│Фиксированный мазок больного (микробы больного)
│+ _диагностическая сыворотка . (обычные АТ; первого порядка),
│ допустим, кролика.
│ Отмывка от несвязавшихся антител.
│+ Антисыворотка против иммуноглобулинов кролика с АТ-ми
│ (второго порядка), меченными ФИТЦ.
│ Отмывка от несвязавшихся антител.
│Люминесцентная микроскопия (при положительном результате
│видно свечение.
_2 вариант
│Фиксированные мазки музейных микробов (диагностикума),
│+ (раститрованная) _сыворотка больного
│ Отмывка от несвязавшихся антител.
│+ Антисыворотка против иммуноглобулинов (АТ второго поряд-
│ ка), меченными ФИТЦ.
│ Отмывка от несвязавшихся антител.
│Люминесцентная микроскопия (при положительном результате
│видно свечение.
5Антисыворотку к иммуноглобулинам кролика получают иммуниза-
5цией барана иммуноглобулинами кролика.
5Метод иммунной флюоресценции применяют для идентификации
5риккетсий и других бактерий, вирусов, а также для определения
5рецепторов и АГ-ов животных клеток человека и животных.
3ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)
ELISA-МЕТОД=РЭМА
(Enzyme-linked immunosorbent assay =
реакция энзим-меченных атомов)
5Метод независимо разработали в начале 70-х годов шведские
5исследователи Энгвалл и Перлманн, голландские ван Веемен и Шуур
5и американские исследователи под руководством Рубинстайна.
К настоящему времени созданы многочисленные модификации ба-
зовой методики и наибольшее распространение получил гетероген-
ный ИФА на твердой фазе ( _твердофазный ИФА .). Коммерческие МАТ
(или АГ) фиксируют на лукнах пластиковых панелей, реже иммоби-
лизуют на бусах или нитроцеллюлозных мембранах. /2400к/
Лунка иммунологической планшеты с "пришитыми" антигенами
(диагностические планшеты)
│ │
│ │ >── - АТ 41 0 (антитело первого порядка)
│АГ>── 4Y 0 │ 4 Y
│ │* │ │ - АТ 42 0 (молекула АТ второго порядка,
│ │ меченая пероксидазой хрена)
└────────────────┘ * - пероксидаза (ПХ) хрена
Н 42 0О 42 ───── 0Н 42 0О + [O]
5ПХ 0 радикал кислорода
+ раствор Н 42 0О 42 0 и красителя (хромогена),
изменяющего цвет в присутствии радикалов кислорода (орто-фе-
нилендиамин) --- спектрофотометрия (под вертикальным лучом)
После каждого этапа обработки планшета промывается физраст-
вором или буфером.
5ИФМ можно определить белки, содержащиеся в количестве нес-
5кольких нанограммов в 1 мл. В качестве ферментных меток исполь-
5зуют пероксидазу хрена, глюкозоксидазу, бета-галактозидазу или
5щелочную фосфатазу. 0
5Этапы:
5Первым этапом является связывание моноспецифических антител
5(или антигена, если искомым белком является антитело) на твер-
5дом субстрате, обычно на стенках пластиковой пробирки или план-
5шеты. Связывание происходит путем физической адсорбции белка на
5гидрофобной поверхности. 0
5- Полистироловая (полистереновых) планшетка обрабатывается
5антигеном для их сорбции (или антителами).
5- Добавляется альбумин (забиваются все свободные сайты свя-
5зывания, чтобы не было затем неспецифической сорбции антител). 0
5- Обработка антителами или сывороткой больного, содержащей
5предполагаемую разновидность антител.
5- Добавляется антисыворотка, меченная ПХ (пероксидазой хре-
5на).
5- Приливается реактив АВТS или др., который окрашивается
5после воздействия пероксидазы. Можно использовать смесь переки-
5си водорода и хромогена (ортофенилдиамина, изменяющего окраску
5в зависимости от количества радикальных форм кислорода от свет-
5ло-желтой до коричневой).
5- О наличии и количестве АТ судят по изменению цвета и ин-
5тенсивности окраски раствора. Измерение интенсивности окраски
5на спектрофотометре /СФ/. 0
5[ИФМ можно проводить двумя путями - по непрямому (описанному
5выше) и конкурентному типу. В первом случае конкурентные отно-
5шения отсутствуют: исследуемая биологическая жидкость реагирует
5с твердофазными антителами, после чего на удаляется из и в ре-
5акцию вводят меченые ферментом антитела, которые связываются
5уже иммобилизованным антигеном. В этом случае ферментативная
5активность прямо пропорциональна количеству антигена в исследу-
5емом материале. Во втором случае антиген, меченный ферментом,
5конкурирует с немеченым исследуемым антигеном за выделенные на
5твердой фазе антитела, и ферментативная активность обратно про-
5порциональна количеству антигена в исследуемом образце.]
5В качестве твердой фазы используют вещества различного хими-
5ческого состава - полистирен, полипропилен, поливинил, гели
5декстрана, агарозы, полиакриламида, целлюлозы, нитроцеллюлозы,
5нейлон.
3РАДИОИММУННЫЙ МЕТОД /АНАЛИЗ/ (РИМ=РИА)
РИСТ - радиоиммуносорбентный метод
Ставится аналогично ИФА, но с использованием антител, мече-
ных радиоактивным изотопом.
│ │
│ │ >── - АТ 41 0 (антитело первого порядка)
│АГ>── 4Y 0 │ 4 Y
│ │* │ │ - АТ 42 0 (молекула АТ второго порядка,
│ │ меченая изотопом)
└────────────────┘ * - радиоактивная метка --- счетчик
радиоактивности
Работа проводится в радиоизотопных лабораториях.
Используются антитела, меченные радиоактивным элементом -
иодом ( 5125 0I, 5131 0I) или др. - с последующим измерением радиоак-
тивности. Если предыдущие иммунохимические методы способны
улавливать концентрацию белка не ниже 1 мкг/мл, то с помощью
РИМ можно определить концентрации, измеряемые в пикограммах,
поэтому метод РИА считается одним из подходящих количественных
методов иммунохимического анализа.
Учет реакции проводят по убыванию или по возрастанию ради-
оактивности (в зависимости от методики РИА) с помощью специаль-
ных счетчиков бета- или гамма-излучения. Метод высокочувствите-
лен, но постепенно вытесняется иммунофлюоресцентным анализом.
/2551к/
3ИММУНОБЛОТТИНГ
и дот-микросвязывание
1Постановка методики:
│- Вертикальный электрофорез пробы в течение ночи
│- Снятие отпечатка на нитроцеллюлозную бумагу (полоски
│ или цельную)
│- Инкубация полосок бумаги в растворе антисыворотки к иско-
│ мому антигену. Промывка от несвязавшихся АТ.
│- Инкубация в растворе противовидовой антисыворотки (раст-
│ воре АТ второго порядка), меченых ПХ (пероксидазой хрена)
│- + раствор Н 42 0О 42 0 и красителя, изменяющего цвет в присутс-
твии радикалов кислорода. Присутствие АГ расценивается по
наличию окрашенных красителем пятен на бумаге.
5Метод основан на разделении полипептидов в ПААГ (полиакрила-
5мидном геле) и анализе разделения иммунохимическими методами
5после переноса разделенных белков на нитроцеллюлозную мембрану,
5на которой белки доступны для любого вида твердофазного иммуно-
5анализа (иммуноферментного или радиоиммунного).
5Этапы:
51. Электрофорез исследуемой смеси пептидов и маркеров с из-
5вестной молекулярной массой в ПААГ.
52. Окраска геля нитратом серебра.
53. Перенос следов белка на нитроцеллюлозную бумагу или мемб-
5рану на основе нейлона (отпечаток геля) с получением реплики
5электрофореграммы. Процесс переноса называется блоттингом, а
5полученный отпечаток - блотом или блотограммой. 0
54. Обработка бумаги в полиэтиленовом пакете в антисыворотке
5к исследуемым антигенам. Промывка.
55. Обработка антителами к фракции иммуноглобулинов, связан-
5ных с пероксидазой или с биотином (ИФМ).
56. Окраска авидин-пероксидазой или диаминбензидином с добав-
5лением перекиси водорода. Промывка. Высушивание. 0
.
3РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ /РН/
_ 21) РН вирусов в цветной пробе (в культуре ткани).
Допустим, у больного грипп типа В:
│ │ │ │ │ │
│ │ │РН │ │ │
├───┤ ├───┤ ├───┤
│ В │ │ В │ │ В │
└───┘ └───┘ └───┘
+ АТ к А + АТ к В + АТ к С
(+ антисыворотка - " - (+ антисыворотка
к вирусу типа А) │ к вирусу типа С)
│
Во второй пробирке
произойдет нейтра-
лизация вируса (РН).
Добавленные клетки
останутся живыми.
1Постановка методики:
│Вирусная культура
│+ антисыворотка к белкам адгезии вирусов (НА)
│ --- инактивация вируса (неспособность проникать в клетки
│ для репродукции)
│+ культура клеток --- гибели нет (метаболизм клеток продол-
│ жается, среда закисляется и окраска среды 199 меняется на
│ желтую.
При выявлении одного, допустим, из 3 типов вирусов гриппа
(А,В,С) в 3 пробирки добавляют исследуемую культуру вируса (ал-
лантоисную жидкость куриного эмбриона), затем в каждую пробирку
свою антисыворотку (против А, против В, против С) и после пре-
динкубации - культуру клеток в среде 199. В двух из трех проби-
рок АТ не свяжут вирусы, вирусы проникнут в клетки; клетки по-
гибнут, метаболизм прекратиться (среда перестанет желтеть и ос-
танется исходной - малиновой).
_ 22) РН вирусов в культуре ткани . 0 или курином эмбрионе по нейт-
рализации ЦПД.
Ставится аналогично, но наблюдается не изменение цвета пита-
тельной среды, а (чаще под микроскопом) отсутствие ЦПД (цитопа-
тогенного действия вируса) - образование многоклеточного синци-
тия, гигантских многоядерных клеток, появление включений, вези-
куляция клеток и пр.
_ 23) РН токсина антитоксической сывороткой
а) in vitro
- Реакция флоккуляции (хлопьеобразования)
б) in vivo
1- 0Например, определение типа токсина Clostridium botulinum
при ботулизме. Клостридии ботулизма способны продуцировать 7
серотипов токсина - А,В,С,D,E,G,F, из которых в нашей стране
встречаются чаще токсин типа А, типа В и типа Е.
Допустим, человек отравился токсином Е:
│ │ │ │ │ │
│ │ │ │ │ РН│
├───┤ ├───┤ ├───┤
│ Е │ │ Е │ │ 2Е 0 │
└───┘ └───┘ └───┘
+ АТ к А + АТ к В + АТ к 2Е
│ │ │
мышь погибнет мышь погибнет мышь выживет
Токсин-содержащий материал разливают по 3 пробиркам и добав-
ляют в первую - антисыворотку к токсину А,
во вторую - антисыворотку к токсину В,
в третью - антисыворотку к токсину Е.
В 3 пробирке произойдет образование ИК, т.е. нейтрализация ток-
сина (РН). Для выявления данной пробирки содержимое вводят трем
мышкам. Третья мышь выживет.
1Минимальной летальной дозой токсина 0 считается количество
токсина. которое при подкожном введении морской свинке весом
250г вызывает ее гибель в течение 4-5 дней.
4) Феномен гашения сыпи (in vivo), например, при диагностике
скарлатины.
Для диагностики скарлатины в область наиболее обильной сыпи
вводят антисыворотку к эритрогенному токсину; если у больного
скарлатина, то сыпь в месте инъекции пропадает.
5) РН для определения напряженности антитоксического иммуни-
тета к дифтерийному токсину (проба Шика), скарлатинозному ток-
сину (проба Дика) в здоровом организме.
В область предплечья внутрикожно вводят определенное коли-
чество соответствующего токсина (1/40 DLM). При наличии в ога-
низме антитоксинов произойдет нейтрализация токсина и реакция
будет отрицательной. При отсутствии антитоксинов (антитоксичес-
ких АТ) в организме возникает воспалительная реакция (покрасне-
ние) на месте введения токсина. /2551к/
Подкожное введение эритрогенного токсина иммунным лицам при-
водит к нейтрализации токсина (покраснения не будет).
3РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)
_ 5Реакции иммунного лизиса . используются в нескольких вариантах
51) Для определения АТ к эритроцитам барана (ЭБ)
52) Для определения HLA на В-лимфоцитах (лимфоциты + МАТ к
5определенному АГ системы HLA + комплемент --- лизис клеток +
5гемсистема - ЕА (эритроциты /Е/ барана, нагруженные антителами
5/А/ к ним /ЕА/). 6-12 ячеек из 100 будут с целыми эритроцитами,
5остальные - с лизированными (ИК нет, нет активации комплемента,
5нет потребления комплемента, свободный комплемента лизирует
5ЭБ). РСК.
53) Для определения титра АТ к любому АГ (РСК).
4В реакциях иммунного лизиса специфические АТ взаимодействуют
4с различными клетками, в том числе с бактериями и простейшими,
4что приводит к активации системы комплемента по классическому
4пути и последующему лизису клеток. Среди них известны реакции
4гемолиза и вибриолиза. /2400к/98/ 0
5Реакция гемолиза считается активной при использовании АТ к
5эритроцитам барана. При пассивной реакции иммунного лизиса про-
5изводят адсорбцию антигена на эритроцитах барана с последующим
5добавлением искомых антител к АГ-ну и комплемента. 0
2Определение титра антител по РСК
2(реакции связывания комплемента)
1/10 1/100 5 01/1000 5 и т.д. (раститровка)
= 10 5-1 0 = 10 5-2 0 10 5-3 0 5 010 5-4 0 10 5-5 0 10 5-6 0 10 5-7 0 5 0 10 5-7
│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤
│ о │ │ о │ │ о │ │ о │ │ - │ │ - │ │ - │ │ - │ │ │
└───┘ └───┘ └───┘ └───┘ └───┘ └───┘ └───┘ └───┘ └───┘
\________________________/ \_________________________/ Контроли
Эритроциты барана целы Эритроциты барана лизированы
(муть или осевшие на дне)
1Постановка методики:
│- Раститровка сыворотки для определения титра АТ
│+ АГ (музейная культура микробов, лекарственный препарат,
│ анатоксин и пр. --- ИК в первых пробирках по убывающей
│+ комплемент (сыворотка морской свинки) --- связывание ИК с
│ C1q. Инкубация 15 минут.
│+ ЕА (гемсистема; другой вид ИК). Инкубация 15 минут.
│ --- Лизиса в первых пробирках нет, т.к. C1q весь связан с
│ первым типом ИК.
┌────┐ ┌────┐
│ АГ │ │ ЭБ │
└──┬─┘ ┌────┐ └──┬─┘
├────┤ С │ │ --- гемолиза эритроцитов нет
┌──┴─┐ └────┘ ┌──┴─┐ (положительная РСК)
│ АТ │ │ АТ │
└────┘ └────┘
ИК ИК [С- комплемент]
┌────┐ ┌────┐
│ АГ │ │ ЭБ │
└────┘ ┌────┐ └──┬─┘
│ С ├─────┤ --- гемолиз эритроцитов
┌────┐ └────┘ ┌──┴─┐ (отрицательная РСК)
│ АТ │ │ АТ │
└────┘ └────┘
ИК нет или мало ИК
(антител к искомому
АГ нет или мало)
1Примечание 0:
- Сыворотка больного предварительно инактивируется от собс-
твенного комплемента (56 5о 0 20 минут), поскольку активность комп-
лемента у разных больных разная (сбои в результатах).
- Предварительно отрабатывается рабочая доза АГ (не влияющая
сама по себе на реакции активации комплементарного каскада).
- Подбирается рабочая доза комплемента (избыток недопустим,
так как C1q будет оставаться и на ИК второго порядка).
51. Приготовление 5% суспензии эритроцитов барана (Е):
50,5 мл осадка отмытых эритроцитов + 9,5 мл физраствора.
52. Определение титра гемолитической сыворотки (антител /А/
5к эритроцитам барана):
5Титром гемолитической сыворотки считается максимальное раз-
5ведение в объеме 0,5 мл, при котором наблюдается полный гемолиз
50,5мл 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии 0,5мл компле-
5мента (1:10). Пробы выдерживаются при температуре 370С в тече-
5ние 1 часа.
53. Приготовление рабочего раствора гемолитической сыворотки
5(1:3):
5Например, исходный титр 1:2700; 2700 : 3 = 900, т.е. сыво-
5ротку необходимо развести в 900 раз (взять 1/900 часть от ко-
5нечного объема). Если надо 10 мл гемсистемы, то нужно взять
510:900=1/90мл=0,011мл исходной гемолитической сыворотки.
54. Приготовление гемолитической системы (индикаторной систе-
5мы для комплемента):
5Смешиваются равные объемы 5% суспензии эритроцитов барана и
5гемолитической сыворотки (1:6); при этом сыворотка при непре-
5рывном встряхивании выливается в суспензию эритроцитов, а не
5наоборот. Смесь встряхивается 5 минут и инкубируется 30 минут в
5термостате. Отмывается.
55. Определение рабочей дозы комплемента:
5В качестве источника комплемента можно использовать сыворот-
5ку здоровых доноров (при этом комплемент сыворотки инактивиру-
5ется прогреванием в течение 30 минут при 560С) или лиофилизиро-
5ванную сыворотку морской свинки.
5Титр комплемента - то наименьшее количество комплемента, ко-
5торое будучи смешанным с 0,5мл гемолитической сыворотки (в
5трехкратном титре), гемолизирует 0,5мл 3% взвеси эритроцитов в
5течение 30 минут.
5Для титрования пользуются основным разведением комплемента
51:10 и разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5мл. Затем в каж-
5дую пробирку добавляют физраствор до 1,5мл и 1 мл гемолитичес-
5кой системы. Инкубируют 30 минут при 370С и определяют титр
5комплемента. Параллельно ставится два контроля - контроль гемо-
5литической сыворотки (с физраствором) и контроль комплемента.
5Определив титр комплемента, высчитываем рабочую дозу, кото-
5рая представляет собой титр комплемента, увеличенный на 20-30%,
5так как комплемент в опыте подавляется антигеном.
56. Определение рабочей дозы антигена:
5Раститровывают антиген в конечном объеме 1мл, затем добавляют
5комплемент, штатив встряхивают и оставляют на 1 час при 370С. К
5смеси приливают по 1мл гемолитической системы и инкубируют 1
5час.
5Титром считается наименьшая доза, при которой прекращается
5задержка гемолиза, т.е. отсутствует его комплементарное дейс-
5твие. Для постановки РСК берут рабочую дозу антигена, составля-
5ющую примерно 1/2 - 2/3 ее титра во избежание комплементарного
5действия при постановке реакции.
57. Постановка реакции РСК.
5- Раститровывают сыворотку больного, предварительно прогре-
5тую при 520С в течение 20 минут для инактивации собственной
5системы комплемента.
5- Добавляют рабочую дозу антигена,
5- комплемента и инкубируют 10-30 минут при 370С.
5- Затем вносится гемолитическая система и штатив инкубирует-
5ся еще 30 минут при 370С.
5Задержка гемолиза свидетельствует о наличии антител к ис-
5пользуемому антигену в сыворотке больного.
5Учет РСК с парными сыворотками. (титром специфических в дан-
5ному антигену антител считается титр последнего разведения сы-
5воротки, полностью тормозящего гемолитическую реакцию.)
5Титром гемолизина считается наибольшее разведение гемолизи-
5на, с которым получается полный гемолиз 0,5мл взвеси бараньей
5крови в присутствии комплемента.
Реакция Вассермана (РСК) используется для диагностики сифи-
лиса. Антигеном служит экстракт пораженного органа или другой
аналогичный материал.
II. _ 2ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
2ЦЕПНАЯ ПОЛИМЕРАЗНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)
5- Не серологическая (без использования АГ и АТ), но также
5гибридизации фрагментов ДНК и РНК. 0 5высокоспецифическая диагнос-
5тическая реакция.
ПЦР - чрезвычайно чувствительный метод, теоретически для по-
лучения результата достаточно иметь в среде одну молекулу ДНК.
/2400к/
5ПЦР была разработана Мюллесом в 1983г. на основе технологии
Методы ДНК-гибридизации и ЦПР используются для геносистема-
тики и идентификации патогенных микроорганизмов. /2287к/96/
1Основа метода 0 - катализируемое ДНК-полимеразой многократное
образование копий (амплификация) определенного участка ДНК.
1Этапы метода:
│- термическое разделение 2-нитевой молекулы ДНК на отдель-
│ ные цепочки (30-40с. при 93-95 5о 0С),
│- охлаждение среды и
│- внесение праймеров, комплементарных нуклеотидным после-
│ довательностям обеих цепочек.
Для запуска реакции используют синтетические _ 1праймеры . 0 - оли-
гонуклеотиды, состоящие из 10-20 нуклеотидов, взаимодействующие
с окончаниями последовательностей и образующие последователь-
ности в 50-1000 оснований. Затем в среду вносят термостабильную
полимеразу (tag-полимеразу /от вида бактерии Thermus aquati-
cus/), что запускает образование вторичных копий цепей ДНК,
после чего образующиеся 2-нитевые молекулы ДНК снова подогрева-
ют. Образующиеся отдельные цепочки остужают, вносят праймеры и
снова повторяют процедуру прогрева и охлаждения. /2400к/
После 30-80 циклов накопления копий ДНК проводят их иденти-
фикацию методом электрофореза. /2400к/
5Для подтверждения принадлежности ДНК возбудителю молекулы
5можно подвергнуть рестрикции специфическими эндонуклеазами или
5провести реакцию ДНК-гибридизации. /2400к/
5ПЦР позволяют анализировать геномную ДНК или РНК-транскрип-
5ты, выделенные из единственной клетки. И хотя эти методы не
5требуют большого количества клеток, их ограничения связаны с
5доступностью специфических праймеров и их, как правило, приме-
5няли для выявления уже известных или родственных им генов.
5Такое ограничение было преодолено после разработки методов,
5позволивших амплифицировать весь спектр мРНК. В них использова-
5лась природная особенность всех мРНК нести поли(А+)-последова-
5тельность на 3'-конце. Комплементарная ДНК (кДНК), полученная с
5мРНК в реакции обратной транскрипции, приобретала таким образом
5сайт связывания одного из праймеров для амплификации в ЦПР.
5Другой сайт был образован путем добавления гомополимерного
5хвоста с помощью терминальной трансферазы. Однако все эти мето-
5ды использовали стадию экстракции ДНК, что затрудняло их приме-
5нение в отношении небольшого количества клеток. /2286к/96/ 0
┌──── 76 0 ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ │
│ │ термическая денатурация ДНК (95 5о 0)
│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
│
│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ │
│ │ Отжиг праймеров
│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
│ ┴┴┴┴┴┴
│ ┬┬┬┬┬┬ - праймер
│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ │
│ │ Синтез комплементарных нитей ДНК при охлаждении
│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
│ 2┴┴┴┴┴┴ 0┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ ┴ ┴ ┬ ┬
│ ┬┬┬┬┬┬┬┬ 2┬┬┬┬┬┬
│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ │
│ │ Завершение первого цикла
│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ +
└───── ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
и т.д. ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
5Этот недостаток был преодолен в работе Brady, в которой все
5стадии синтеза кДНК были проведены в одной первичной клеточной
5суспензии без единой экстракции. /2286к/96/
5В последнее время стали пользоваться большой популярностью
5магнитные бусы фирмы "Dynal". Последовательности олиго(дТ)25,
5ковалентно сшитые с бусами, позволяют легко выделять мРНК из
5общего пула РНК или лизата клеток. /2286к/96/ (...)
5Все стадии синтеза кДНК проводятся на магнитных бусах. Воз-
5можность работы с ДНК, находящейся на магнитных бусах, в соче-
5тании с ПЦР позволяет применять данный подход к малому коли-
5честву исходного материала. /2286к/96/
Преимуществом метода является также возможность быстро полу-
чать вторые цепи кДНК на уже синтезированных первых цепях с
олиго(дЦ)-хвостами. Такие матрицы хорошо хранятся в буфере при
4 5о 0С. /2286к/96/