Серологические реакции

                     2СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

   СЕРОЛОГИЯ - раздел иммунологии,  изучающий взаимодействие АГ

и АТ в пробирочных реакциях (in vitro).

   Серологические реакции - реакции с использованием АГ или  АТ

(проводящиеся in vitro).

   Серологическими методами  (в диагностике инфекционных заболе-

ваний) называют совокупность пробирочных реакций,  основанных на

АГ-АТ-взаимодействии. /2640к/99/

   1) Направленны на выявление в сыворотке крови и  других  жид-

костях организма АТ к АГ возбудителей инфекционных болезней.

   2) Проброчные реакции,  имеющие целью обнаружение в сыворотке

крови и  других  субстратах  растворимых  микробных АГ с помощью

стандартных иммунных сывороток.

   Серологические реакции проводятся с использованием

   1) АГ для поиска АТ

   2) АТ для поиска АГ

    4+ 0 /?/ 4 IN VIVO (кожные пробы, РН in vivo ...)

      4- серопрофилактика (введение АГ, АТ)

    4В серологчиеские методы не входят реакции,  которые ставят на

 4людях или животных (реакция Шика,  Дика), и серологическая иден-

 4тификация культур микроорганизмов (это один из этапов  бактерио-

 4логического метода.

              КЛАССИФИКАЦИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

   1. Двухкомпонентные

      - простые (РА,РП)

        -- розеточные тесты (РОК)

        -- цитофлюоресцентные методы

      - сложные (РН /гемадсорбции,  токсина, ...,РТГА,РНГА, ре-

акция прямой имунофлюоресценции, реакции адгезии).

   Реакции адгезии отличаются взаимодействием частиц, например,

клетки, с серологически активной поверхностью,  в т.ч. с другой

клеткой. /2260к/

   2. Трехкомпонентные

      - простые

        -- реакция бактериолиза,

        -- реакция коагглютинации

      - сложные

        -- реакция непрямой иммунофлюоресценции,

        -- РИА,

        -- РЭМА,

        -- литические  тесты  (РСК,  определение  АОК с помощью

           эритроцитарных АГ-ов),

        -- использование  электронного  парамагнитного  и ядер-

           но-магнитного резонанса) /7271/87/,

   Материал для серологических реакций:

   - сыворотка  крови  (парные  сыворотки).  Заморозка в течение

10-14 дней.

   - ликвор,

   - моча,

   - фильтрат испражнений,

   - промывные воды бронхов, полости рта, глотки, носа /2640к/,

     желудка.

   - Слизь (шейки матки, ... - здесь АТ порой больше, чем вы сы-

воротке)

   Учет серологических реакций осуществляется видуально, иногда

с помощью лупы и редко - микроскопа. /2640к/99/

   При оценке серологических реакций применяют 3 главных крите-

рия  /2640к/99/:

   - наличие и интенсивность реакции (в плюсах и др.),

   - диагностический титр,  заранее отработанный для всех забо-

леваний,

   - нарастание титра АТ в течение болезни в 4 и более раза.

   В процессе оценки серологических реакций часто возникает не-

обходимость дифференцировки

   1) специфической реакции (на видовые и типовые антигены) от

      группоспецифической (на межвидовые  АГ)  [Группоспец.  АГ

      Salm. - табл.]

       4-- дифференцировка по моноспецифическим антисывороткам,

       4-- по скорости нарастания титра АТ, которая выше к специ-

          4фическим АГ, 0

       4-- по реакции адсорбции АТ избытком антигена

       4-- по  легкости диссоциации ИК под влиянием диссоцирующих

          4факторов 0

   2) ИО на текущую инфекцию от ИО на перенесенное ранее заболе-

вание и иммунизацию. /2640к/99/

      5-- Оценивают по темпу нарастания АТ.

   При постановке любой серологической  реакции  параллельно  с

опытом ставятся  _контроли на каждый компонент реакции .:

   - микробная культура не должна образовывать хлопья при  ана-

логичном встряхивании;

   - сыворотка  и  антисыворотка  не  должны  быть  с  хлопьями

(хлопья  появляются в процессе хранения белков в связи с посте-

пенным оголением углеводных компонентов;  углеводные компоненты

белков,  будучи жесткими разветвленными структурами, "запутыва-

ются друг в друге", обуславливая агрегацию белков);

   - эритроциты не должны быть лизированы;

   - сыворотка морской свинки,  используемая как источник комп-

лемента, должна лизировать эритроциты (т.е.  работать): компле-

мент + ЭБ --- лизис;

   - диагностикум не должен содержать хлопьев и пр.

   - при поиске АГ обязательно используется параллельно  музей-

ный АГ, который должен однозначно выявляться при проведении ме-

тодики (это значит,  что все компоненты реакции "работают", ме-

тодика поставлена правильно).

                    3РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ /РА/

    РА - реакции склеивания микробов,  частиц латекса или эрит-

роцитов /реакция гемагглютинации  -  РГА/.  АГ-несущие  частицы

склеиваются антителами и выпадают в видимый осадок.

    1Титром сыворотки 0  считают  максимальное  разведение,  дающее

агглютинацию АГ.

                                        ┌            ┐

          0   0    0   0    0       =   │   0    0   │

       \ / \ /  \ / \ /  \ / \ /        │\ /  \ / \ /│

        │   │    │   │    │   │         │ │    │   │ │

                                        └            ┘n

   0 - клетка

 >── - молекула антитела

   1)  _ 2Прямая РА

   В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглю-

тинируют корпускулярные АГ (агглютиногены).

   -  1Зернистая 0 агглютинация происходит при склеивании микробов,

содержащих О-антиген.

   -  1Хлопьевидная 0 агглютинация происходит с бактериями, имеющи-

ми жгутики (Н-антигены).

   а)  2Прямая реакция агглютинации (РА)

      -  _Ориентировочная РА . (на предметном стекле)

    1Постановка реакции:

        │Микробная суспензия

        │+ антисыворотка к микробу

    1Результат: 0 - хлопья (агглютинаты)

    5Для определения  микробного  вида (серотипирования) на пред-

 5метное стекло наносится 1 капля (0,05мл) диагностической  сыво-

 5ротки,  разведенной  физиологическим раствором 1:25.  На вторую

 5половину  стекла  наносится  капля  физиологического   раствора

 5(контроль).  К каждой капле добавляется равный объем испытуемой

 5культуры.Слегка покачивая стекло,  наблюдать за течением  реак-

 5ции:  феномен  агглютинации  проявляется  выпадением  хлопьев и

 5просветлением жидкости в капле.  В контроле микробная  культура

 5должна остаться мутной и гомогенной. 0

      -  _Развернутая РА . проводится в ряду пробирок или лунок для

        раститровки сыворотки больного (определения титра АТ)

    1Постановка реакции:

        │Сыворотка больного,  содержащая  АТ к микробу --- рас-

        │                     титровка

        │+ микробная  суспензия  (равное количество во все про-

        │  бирки или лунки

    1Результат: 0 - хлопья (агглютинаты) микробов

     5Для определения  антител  в сыворотке крови больного поста-

 5вить в штатив 7 пробирок и налить в каждую из них по 0,5 мл фи-

 5зиологического раствора.  Добавить в первую пробирку 0,5 мл сы-

 5воротки больного,  разведенную в 50 раз,  перемешать. 0,5 мл из

 5первой пробирки перелить во вторую,  перемешать; из второй про-

 5бирки 0,5 мл перелить в третью и т.д. Из последней пробирки вы-

 5лить для равенства объемов 0,5 мл в банку с дезраствором.В каж-

 5дую пробирку добавляют по 2 капли антигена  или  диагностикума.

 5Оформить  2  контроля - контроль антигена (для исключения спон-

 5танной агглютинации) и контроль сыворотки в исходном разведении

 51:50.

                        5Рабочая схема РА:

 5──────────────────────────────────────────────────────────────

  5Ингредиенты │              Ряд пробирок

              5│------------------------------------------------

              5│  1  │  2  │  3  │  4  │  5  │    6    │   7

 5──────────────────────────────────────────────────────────────

 51. Физраствор  0,5   0,5   0,5   0,5   0,5      -       0,5

 52. Сыворотка   0,5   0,5   0,5   0,5   0,5     0,5      0,5

    5больного 1:50

    5Полученные

    5титры      1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600   1:50      -

 53. Диагнос-

    5тикум в

    5каплях       2     2     2     2     2       -        2

        5Инкубация в термостате 2 часа при 370С, затем при

        5необходимости 24 часа при комнатной температуре.

    5Учет результатов реакции проводят через 24 часа по следующей

 5схеме:

    5++++ полная агглютинация,  жидкость  прозрачная,  выраженный

         5осадок;

    5+++  жидкость слегка опалесцирует, но осадок хорошо выражен;

    5++ или  + сомнительная реакция,  жидкость равномерно мутная,

         5осадок отсутствует. 0

    5-    отрицательная реакция,  жидкость равномерно мутная,

         5осадок отсутствует.

    5Титром агглютинирующей сыворотки считается то ее  максималь-

 5ное разведение,  при  котором  еще происходит реакция не менее,

 5чем на три плюса.

    5Артефакты:

    5- наличие   СРБ,   агглютинирующего  микробы  (стафилококки,

 5стрептококки)

    5- наличие перекрестных антигенов

   б)  2Прямая реакция гемагглютинации (РГА)

      - вирусами (эритроцитов любого вида животного)

      - при смешивании двух разногруппных проб крови (определе-

        ние групп крови)

    1Постановка реакции:

        │Субстанция, склеивающая эритроциты (сыворотка, вирусы)

        │+ эритроциты --- хлопья

    1Результат: 0 - хлопья (означают присутствие АТ)

    1Варианты постановки:

      -  _Ориентировочная РА . (на предметном стекле)

      -  _Развернутая РА . проводится в ряду пробирок или лунок для

        раститровки сыворотки больного (определения титра АТ)

    5Материал с вирусом титруют от 1/10 до 1/1280.  0,5мл данного

 5материала смешивают с 0,5мл 1-2% эритроцитов. Инкубируют 30 ми-

 5нут при 37оС или 45 минут при комнатной температуре. Титром ви-

 5руса считается его наибольшее разведение,  при котором наблюда-

 5ется агглютинация эритроцитов.

    5Прямая гемагглютинация, вызываемая бактериями, коррелирует с

 5их способностью прикрепляться к клеткам макроорганизма, отража-

 5ет вирулентные свойства. (Предложен метод селекции наиболее ак-

 5тивных клеток из культуры путем их адсорбции на  эритроцитах  с

 5последующим высевом на плотные среды.)-[11ц301-81]

   2)  _ 2Непрямая РА

   =  2РНГА (РПГА 0; РНГА=РПГА 2) (реакция пассивной 0  2или 0  2непрямой ге-

      2магглютинации)

    1Варианты постановки:

      -  _Ориентировочная РА . (на предметном стекле)

      -  _Развернумая РА . проводится в ряду пробирок или лунок для

        раститровки сыворотки больного (определения титра АТ)

                   ┌               ┐

                   │   .0.   .0.   │

                   │\ /   \ /   \ /│

                   │ │     │     │ │

                   └               ┘n

   К носителю (эритроцитам, стафилококку, частицам латекса /ла-

текс-агглютинация/ и пр.  химическим способом "пришивают" анти-

гены, ампулируют и выпускают в биотехнологической промышленнос-

ти как диагностикумы.

    1Постановка реакции:

        │Сыворотка больного --- раститровка

        │+ диагностикум в каждую лунку ---

    1Результат: 0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть),

              - "пуговка" (РА нет)

   Последняя ячейка с положительной пробой ("зонтиком") означа-

ет титр АТ.

    5Сорбция на  носителе либо АГ (РНГА=РПГА),  либо АТ (обратная

 5РПГА).

    5Реакция ставится в двух вариантах.  Антиген (РПГА) или анти-

 5тела (РНГА) связываются с крупным носителем с последующим выяв-

 5лением уровня специфических иммуноглобулинов или антигена.

    5Исследуемый антиген  "сшивается"  танином или глютаровым ди-

 5альдегидом с эритроцитами или частицами латекса.

    5Сыворотка больного, прогретая 30 минут при 56оС, раститровы-

 5вается (0,5мл)  и смешивается с 2 каплями эритроцитарного диаг-

 5ностикума.

   3)  _ 2Проба Кумбса . 0 (непрямая пассивная гемагглютинация;

                    антиглобулиновый тест)

   Для постановки этой реакции необходима антиглобулиновая  сы-

воротка, которую  получают путем иммунизации кролика иммуногло-

булинами человека.

   Используется для определения неполных (функционально однова-

лентных)  антител,  например,  "ро"-антител к эритроцитам плода

при резус-конфликте, ряд аутоантител, АТ к некоторым микробам и

пр. Эритроциты плода в условиях in vivo не агглютинируют, одна-

ко при обработке их in vitro антисывороткой к гамма-фракции ан-

тител человека происходит РА на стекле (= _ориентировочная .  реак-

ция  Кумбса).  К сыворотке добавляется антиген (резус-фактор) и

затем антисыворотка против гамма-глобулинов, что вызовет агглю-

тинацию загруженных эритроцитов.   _Развернутая . реакция Кумбса (в

ряду пробирок или лунок) применяется для определения титра цир-

кулирующих неполных антител в сыворотке больного.

              ┌                              ┐

              │       0             0        │

              │    \ /  \ /      \ / \ / -АТ 41 0│

              │     │    │        │   │      │

              │  \ /        \ /         \ /  │

              │   │          │           │   │

              │   АТ 42 0        АТ 42 0         АТ 42 0 │

              └                              ┘n

    1Постановка реакции:

        │Сыворотка (АТ 41 0) --- раститровка

        │+ эритроциты (с Rh-антигеном)

        │+ антисыворотка к Fc-фрагменту  Ig G (АТ 42 0).

    1Результат: 0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть),

              - "пуговка" (РА нет)

   Последняя ячейка с положительной пробой ("зонтиком") означа-

ет титр АТ.

   4)  _ 2Реакция коагглютинации 0  2(РКОА 0, РКА 2)

    1Варианты постановки:

      -  _Ориентировочная РА . (на предметном стекле) --- хлопья

      -  _Развернумая РА . проводится в ряду пробирок или лунок для

        раститровки сыворотки больного (определения титра АТ)

 L[+]

                     ┌       │      ┐

                     │     ┌─┴─┐ 4  0   │

                     │ 0> 4── 0┤St.├ 4─ 0─<0│

                     │     └─┬─┘ 4  0   │

                     │       │      │

                     └              ┘n

   К носителю - клеткам инактивированного золотистого  стафило-

кокка  (Staphylococcus  aureus),  несущего на своей поверхности

белок А (функциональный аналог FcR)  добавляют  необходимые  АТ

(антисыворотку)  и  после  инкубации  -  исследуемую жидкость с

предполагаемыми АГ-ми.

    1Постановка реакции:

        │Стафилококковый диагностикум

        │+ АГ

    1Результат: 0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть),

              - "пуговка" (РА нет)

   Последняя ячейка с положительной пробой ("зонтиком") означа-

ет титр АТ.

    5Реакция Ко-агглютинации  (РКА) предложена в 1973г.  Kronvall

 5для постановки диагноза пневмококковой инфекции. Сейчас она ис-

 5пользуется для диагностики эшерихиозов,  коклюша, менингококко-

 5вой, стрептококковой инфекции,  сальмонеллезов и шигеллезов,  а

 5также для   обнаружения   некоторых   бактериальных   токсинов.

 5/2119к/85/

    5Реакция пригодна для идентификации различных антигенов путем

 5агглютинации стафилококков, сенсибилизированных антителами про-

 5тив детерминант бактериальной, вирусной или неинфекционной при-

 5роды. /2111к/

    5Например, для  индикации  шигелл зонне в молоке,  кефире и в

              5материалах от людей.  Для определения чувствитель-

 5ности РКОА ставили с 10-кратными разведениями 1 млрд. микробной

 5взвеси шигелл Зонне.  Чувствительность РКОА  составила  108-109

 5микробных тел в 1 мл взвеси. /2111к/

    5Стафилококковый реагент  выпускается Ленинградским НИИЭМ им.

 5Пастера и  используется его 2%  взвесь.  Для сенсибилизации ис-

 5пользуются сыворотки с титром антител в РПГА не  ниже  1:12800.

 5/2111к/

    5На предметное стекло капают 2 капли по 0,1 мл  диагностикума

 5и испытуемый материал.  Положительным результатом считалось об-

 5разование агглютината с полным просветлением смеси. (Контроль -

 5с физраствором  и реакция с заведомо инфицированным материалом.)

               4Определение энтеротоксина в реакции

                         4коагглютинации

    4Культуру сальмонелл осаждают  (8000  об./мин.;20  минут),  к

 4осадку микробов добавляют 0,5 мл дистиллированной воды, готовят

 4лизат, вновь центрифугируют (8000 об./мин.;20 минут) и с  надо-

 4садком (супернатантом) проводят реакцию. /1804к/88/

    4В реакции используют диагностикум - золотистый стафилококк с

 4"пришитыми" к нему антителами к токсину. 2-3 капли реагента + 1

 4капля супернатанта культуры сальмонелл больного --- РА  (оценка

 4+, ++, +++, ++++ после 3-минутного покачивания). /1804к/88/

   5)  _ 2РТГА (реакция торможения гемагглютинации)

   Гемагглютинин (НА) вирусов заблокирован  антителами  (первые

ячейки с " _пуговками ." = РА нет):

 L[+]

   ┌                                             ┐

   │           ┌───┐             ┌───┐           │

   │ ──<0>──   │Эр.│   ──<0>──   │Эр.│   ──<0>── │

   │           └───┘ 7  0            └───┘           │агглютинации

   └                                             ┘эритроцитов

                                                  нет

       0 - вирус                                  (=торможение

  >── - антитела                                  агглютинации)

   При "следовых" количествах антител к гемагглютитину (НА) или

их отсутствии  гемагглютинин  ("клей  для эритроцитов") вирусов

остается "открытым" (не закрыт антителами) и происходит  склеи-

вание эритроцитов (последние ячейки с " _зонтиками ." = РА есть):

 L[+]

                     ┌             ┐

                     │ ┌───┐ ┌───┐ │

                     │0│Эр.│0│Эр.│0│

                     │ └───┘ └───┘ │

                     └             ┘n

   а) Определение  титра АТ к определенному вирусу (добавляется

антисыворотка к НА /гемагглютинин видоспецифичен/ данного виру-

са).

    1Постановка реакции:

        │Сыворотка больного --- раститровка

        │+ суспензия музейных инактивированных вирусов

        │  (или диагностикум)

        │+ эритроциты любого вида животного

    1Результат: 0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть, АТ нет

              - "пуговка" (РА нет, АТ есть

   Последняя ячейка с положительной пробой ("пуговкой") означа-

ет титр АТ.

   б) Определение типа вируса,  допустим, гриппа (А, А или С) у

больного по выделенной культуре

    1Постановка реакции:

         3 ряда лунок в иммунологической планшете:

        │Антисыворотка к вирусу гриппа типа А --- раститровка

        │Антисыворотка к вирусу гриппа типа В --- раститровка

        │Антисыворотка к вирусу гриппа типа С --- раститровка

        │+ Вирус-содержащий материал от больного (культура, но-

        │  совая жидкость) во все 3 ряда

        │  (Или наоборот, раститровка в 3 рядах вирусов + АТ,

        │  если нужно сориентироваться в количестве вирусов)

        │+ эритроциты любого вида животного

    1Результат: 0 - ряд с "пуговками"  означает тип вируса.

    5- Сыворотку титруют (1/10-1/2560) - 0,25мл;

    5- добавляется вирус в четырехкратном титре (разведение  в  4

 5раза от исходного титра)

    5- инкубируют 30 минут при 37оС

    5- добавляют 0,5мл 1-2% взвеси эритроцитов

    5- инкубируют 30 минут при 37оС или 45  минут  при  комнатной

 5температуре.

   в) Определение типа вируса,  допустим, гриппа (А, А или С) у

больного по наличию антител в сыворотке крови

    1Постановка реакции:

         3 ряда лунок в иммунологической планшете:

        │Сыворотка больного --- раститровка в 3 рядах

        │+ Музейный вирус типа А (в первый  ряд)

        │+ Музейный вирус типа В (во второй ряд)

        │+ Музейный вирус типа С (в третий  ряд)

        │+ эритроциты любого вида животного

    1Результат: 0 - ряд с наибольшим количеством "пуговок" означает

                наибольший титр АТ у больного  к  данному  типу

                вируса,  что  предположительно  говорит о соот-

                ветствующем гриппе (для доказательства оценива-

                ют титр  АТ в динамике с интервалом в 2 недели;

                при увеличении титра минимум в 4 раза можно го-

                ворить об острой инфекции и соответствующем за-

                болевании).

                      3РЕАКЦИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ

   Реакции иммобилизации  основаны на способности специфических

АТ,  циркулирующих в сыворотке больных,  подавлять  подвижность

различных микроорганизмов.

   На практике нашли применение реакции  иммобилизации  бледной

трепонемы и холерного вибриона.

                    3РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РП)

   - реакции взаимодействия между антигеном и антисывороткой  с

образованием видимого  "осадка" (преципитата) - преципитирующих

иммунных комплексов (ПИК).   5МАТ (моноклональные АТ) одновалент-

 5ные, поэтому в РП пока не используются. 0

          ┌───────────────── РП ────────────────────┐

   _В жидкой фазе .                                _В агарозе . (1%)

- реакции кольце-               - в т.ч. электрофоретические

  преципитации                    (в этом случае агароза варится

- нефелометрия                    на веронал-мединаловом буфере

                                  (ВМБ, рН 8,6)

   Механизм взаимодействия антигенов и антител:

        АГ          │        АГ=АТ        │        АТ

                       (пропорциональное

                    количество АГ и АТ;1:1)

                    │   │   │   │   │   │ │

                    │                     │

 ┌───┐   о    о     │  / \ / \ / \ / \ / \│   Y    Y      ┌───┐

 │АГ │ о   о        │ о   о   о   о   о   │     Y       Y │АТ │

 └───┘ 7  0      о      │  \ / \ / \ / \ / \ /│  Y            └───┘

        о        о  │   │   │   │   │   │ │          Y

                              ПИК

                     (преципитирующие ИК,

                      преципитат)

   1)  _ 2Реакция кольцепреципитации

   │─│

   │ │- АГ

   │ │

   │=│- зона преципитации (помутнения) в пробирке или капилляре

   │ │

   │ │ - Антисыворотка

   └─┘

   а)  _Определение С-реактивного белка . (СРБ): капилляр наполови-

ну заполняют антисывороткой к СРБ и дополняют сывороткой  боль-

ного. Капилляр вставляют в пластелиновую пробку и оставляют  до

утра.  Помутнение  на границе раздела свидетельствует о наличии

СРБ в кровотоке (количество СРБ  пропорционально  интенсивности

деструктивных процессов в организме).

    5Треть капилляра заполняют антисывороткой и через этот же ко-

 5не 0ц 5 треть  - исследуемой сывороткой.  Капилляр покачивают 12-15

 5раз для смешивания ингредиентов и устанавливают вертикально  на

 5пластилиновый штатив.  оставляют 24 часа при комнатной темпера-

 5туре. Помутнение на границе раздела свидетельствует  о  наличии

 5СРБ  в  кровотоке (количество СРБ пропорционально интенсивности

 5деструктивных процессов в организме).

    5Результат оценивают по высоте преципитата  в  капилляре.

   б)  _Диагностика сибирской язвы

   Прокипяченый инфицированный материал

   + антисыворотка (медленно наносить;  по стенке пробирки сте-

     кает под слой АГ)

   Инкубация несколько минут. Зона помутнения свидетельствует о

присутствии АГ в материале.

   2)  _ 2Нефелометрические, тербидиметрические методы

   Принцип нефелометрии заключается в измерении количества све-

та, рассеиваемого частицами (ПИК) в жидкой среде.  Для  нефело-

метри  оптимальны  растворы  низкой  концентрации (в отличие от

турбидиметрии, для которой оптимальны растворы высокой концент-

рации,  поскольку  в  этом случае измеряется потеря проходящего

света).

    5Чувствительность метода - 100 мкг/мл  антител  или  антигена

 5при исследовании  цельной сыворотки и 1 мкг/мл при исследовании

 5чистых растворов.  Данным методом можно проводить до 120 анали-

 5зов в  час.  Время  образования ИК можно значительно сократить,

 5если ее проводить в 4% полиэтиленгликоле с М. 6000Д.

   3)  _ 2Метод преципитации в геле по Оухтерлоню

   Стекла или чашки Петри заливают 1-2%  агаром  или  агарозой.

После застывания агара вырезают по трафарету лунки. В одни лун-

ки вносят исследуемые сыворотки (препараты), в другие, располо-

женные напротив - соответствующие антисыворотки. Пластины инку-

бируют во влажной камере в течение 24-48 часов.

   Варианты постановки:

   - 2 лунки (диаметром 3-5 мм) на расстоянии 3-5  мм  друг  от

     друга (одна с АТ, другая с АГ);

   - в центре лунка с антисывороткой,  вокруг лунки  с  разными

пробами АГ-содержащего материала (или наоборот,  в центре - АГ,

по периферии - АТ);

   - бороздка (или полоска пропитанной фильтровальной  бумагой,

наложенной на агарозу) с антисывороткой (АТ-ми), по бокам лунки

с АГ или бляшки  микробов,  синтезирующих  токсин  (определение

токсигенности дифтерийной палочки).

   4)  _ 2Метод преципитации в геле по Манчини

       _ 2(метод радиальной иммунодиффузии - РИД)

           /   \---- зона преципитации

          │  о--│---- лунка с точно дозированным количеством

           \ 4--- 0/     сыворотки

   Метод количественного определения антигенов основан на изме-

рении диаметра кольца преципитации,  образующегося при внесении

исследуемой сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в кото-

ром предварительно диспергирована  моноспецифическая  антисыво-

ротка. В  слое  агара пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм

на расстоянии 15мм одна от другой.  В лунки первого ряда вносят

с помощью  микрошприца  по 2мкл антигена (или стандартной сыво-

ротки) в разведениях 1/1,  1/2, 1/4, 1/8. Лунки следующих рядов

заполняются  испытуемыми  препаратами.  Пластины  инкубируют во

влажной камере в течение 24 часов (пластины с анти-Ig  M  сыво-

роткой  -  48 часов).  По окончании инкубации измеряют диаметры

колец преципитации.  Концентрацию антигена определяют по калиб-

ровочной кривой.

   Например, определение концентрации Ig M,G,A в сыворотке кро-

ви больных.

   5)  _ 2Ракетный электрофорез 0  2(электроиммунодиффузия)

1/4   о===                    о - лунки с точно дизированным

1/2   о======                     количеством сыворотки

1/1   о==========           === - зоны преципитации

     2-             +  0              (измеряется длина зон, мм)

  Катод          Анод

 1/1, 1/2, 1/4 - разведения стандартной сыворотки (т.е.

                 сыворотки с известным количеством антител)

                 Ставятся для построения калибровочной кривой.

   В 1966г. Laurell разработал метод, сочетающий иммунодиффузию

с электрофорезом.  Антиген движется в геле агарозы,  содержащем

антисыворотку.  Для  электрофоретических  реакций  преципитации

агарозу расплавляют в веронал-мединаловом буфере (рН 8,6) в во-

дяной бане,  остужают до 52 5о 0С, смешивают с антисывороткой и за-

ливают на стекло.

   После застывания  (через 5 минут) вдоль кромки слоя геля де-

лают ряд лунок, в которые помещают исследуемый материал. В слое

геля  создают  электрическое  поле,  благодаря которому антиген

входит в гель. Зона преципитации приобретает вид "ракеток". Вы-

сота "ракеты", образующейся в результате реакции, прямо пропор-

циональна концентрации антигена (она измеряется от верхней гра-

ницы лунки до высоты пика).

   6)  _ 2Противоточный  или встречный электрофорез . 0 (экспресс-диаг-

      ностика вирусных и др. инфекций)

    4Встречный ИЭФ  (иммуноэлектрофорез)  был применен Бендарид в

 41969г. Электрическое поле усиливает способность  к  взаимодейс-

 4твию низкореактогенных  АГ  и АТ.  Чувствительность метода в 10

 4раз превышает чувствительность метода двойной иммунодиффузии по

 4Оухтерлони. /2400к/

   Основное условие метода - наличие  электрофоретической  под-

вижности АГ.

               ┌─────────────────────────────────┐

           2- 0    │      0     │   0         0      │    2+

        Катод  │     АТ        АГ        АТ      │   Анод

               │           ПИК                   │

               └─────────────────────────────────┘

   В две лунки геля заливают антиген и антитела,  пластину ста-

вят в камеру для электрофореза и включают напряжение.  Электри-

ческим полем значительно ускоряется движение компонентов и  ре-

акция преципитации проходит за 30-40 минут. Экспресс-диагности-

ка

   7)  _ 2Иммуноэлектрофорез (ИЭФ)

           ┌───────────────────────────────────────┐ +

           │   █   █   █   █   █   █   █   █   █   │

           │   █   █   █   █   █   █   █   █   █   │

           │   █   █   █   █   █   █   █   █   █   │

           │ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о │

           │   █   █   █   █   █   █   █   █   █   │

           │   █   █   █   █   █   █   █   █   █   │

           │   █   █   █   █   █   █   █   █   █   │

           └───────────────────────────────────────┘ -

    1Постановка реакции:

   │- В лунки заливается исследуемая смесь веществ,

   │  пластина с агарозой ставится в электрофоретическую камеру

   │  на ночь для разгонки белков.

   │- Вынимается агароза из бороздок. В них заливается антисыво-

   │  ротка (удобнее чередовать антицельную сыворотку с моноспе-

   │  цифической к искомому компоненту). Ночь во влажной камере.

    1Результат: 0 оценивается степень чистоты  препарата  по  коли-

              честву  "лишних"  дуг зон преципитации примесей с

              антицельной сывороткой (если препарат получали из

              крови).

    5В геле,  приготовленном на  веронал-мединаловом  буфере  (рН

 58,6), по  трафарету  делаются бритвой полоски и лунки.  Гель из

 5лунок вынимается (из бороздок нет) и лунки заполняют смесью ан-

 5тигенов или исследуемой сывороткой.  Пластина ставится в прибор

 5для электрофореза и в течение ночи проводится разгонка исследуе-

 5мых белков.  На следующий день освобождаются от геля бороздки и

 5заполняются моноспецифическими и полиспецифическими (часто  ан-

 5тицельной) антисыворотками.  Пластина  оставляется  на  ночь во

 5влажной камере для реакции преципитации.

    58)  _Перекрестный электрофорез

    5Смесь исследуемых  белков  разгоняется  поперек  пластины  в

 5электрическом поле, затем к полоске геля с разделенными белками

 5приливается расплавленный  гель  с антисывороткой к исследуемым

 5компонентам и разгонка  проводится  в  продольном  направлении.

 5Формируются широкие  отдельные  зоны  преципитации  исследуемых

 5компонентов белков.

                       3РЕАКЦИЯ ФЛОККУЛЯЦИИ

                  ┌            ┐

                  │   0    0   │   - хлопья флоккулята

                  │\ /  \ / \ /│     (помутнение в пробирке)

                  │ │    │   │ │

                  └            ┘n

   0 - молекула антигена (токсина или др.)

 >── - молекула антитела

    5В результате взаимодействия токсина или анатоксина  с  анти-

 5токсической сывороткой  выпадают  хлопья  флоккулята.  Наиболее

 5ранняя флоккуляция наблюдается в пробирке,  где антиген и анти-

 5тело содержатся в эквивалентных соотношениях.

    5Одна флокуллирующая единица токсина (Lf - Limes flocculatio-

 5nis) в 1 мл определяется минимальным количеством токсина,  даю-

 5щим начальную флоккуляцию с 1 международной единицей (МЕ) сыво-

 5ротки.

    52мл токсина (20 Lf в 1 мл) смешивают в пробирках  с  разными

 5количествами сыворотки (0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 мл), инкубируют

 530 минут при 45оС до выпадения хлопьев в  одной  из  них.  Если

 5флоккуляция произошла в 3 пробирке,  значит,  в 0,4мл сыворотки

 5находится 40МЕ.   Следовательно,   1мл    сыворотки    содержит

 540:0,4=100 МЕ. 0

                   3РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ

              (ИФМ - иммуно-флюоресцентный метод)

   1)  _Прямой  метод .  иммунофлюоресценции  (по Кунсу) основан на

взаимодействии антител,  меченых флюорохромом, с антигеном, ко-

торый находится на клетке, в клетке или в тканях.

   В качестве  флюорохрома  используют

   - флюоресцеинизотиоционат (ФИТЦ),  дающий зеленое свечение в

     УФ-ых лучах;

   - тетраметилродаминизотиоцианат  (ТРИТЦ)  с оранжево-красным

     свечением. /2551к/

   ┌────────────────────────┐     4Y

   │    1┌┬┬┐ 0                 │    │ - АТ

   │    1└┴ 4Y 1┘ 0                 │    * - метка флюорохрома (светя-

   │     │*                 │        щаяся в темном поле зрения

   └────────────────────────┘        люминесцентного микроскопа)

 Предметное стекло с препаратом

 4(после промывки от несвязавшихся АТ)

    1Постановка реакции:

   │Фиксированный мазок

   │+ диагностическая сыворотка с АТ-ми, мечеными ФИТЦ.

   │Отмывка от несвязавшихся антител.

   │Люминесцентная микроскопия  (при  положительном  результате

   │ видно свечение.

    5Материал (препарат ткани,  микроорганизмов или антигена) на-

 5носится на стекло,  фиксируется 15 минут в спирте или в пламени

 5горелки, обрабатывается флуоресцирующей сывороткой (15-30 минут

 5при комнатной температуре),  промывается 15 минут физиологичес-

 5ким раствором;  проводится люминесцентная микроскопия.  Отсутс-

 5твие свечения свидетельствует об отсутствии антигена на  препа-

 5рате.

    5Для получения флуоресцирующих антител к раствору  иммуногло-

 5булинов добавляют раствор  флуоресцетина  изотиоцианата натрия

 5(можно 5-диметиламино-1-нафталинсульфонилхлорид и  изотиоцианат

 5лизамин родамина В 200).

   2)  _Непрямой метод

   ┌────────────────────────┐     4Y 0         >─── - АТ 42 0 (меченые

   │    1┌┬┬┐ 0                 │    │ - АТ 41 0          флюорохромом)

   │    1└┴ 4Y 1┘ 0                 │             * - метка флюорохрома

   │     │>───*             │

   └────────────────────────┘

 Предметное стекло с препаратом

 4(после промывки от несвязавшихся АТ)

    1Постановка реакции:

    _1 вариант

   │Фиксированный мазок больного (микробы больного)

   │+  _диагностическая сыворотка . (обычные АТ; первого порядка),

   │  допустим, кролика.

   │  Отмывка от несвязавшихся антител.

   │+ Антисыворотка против иммуноглобулинов кролика с АТ-ми

   │  (второго порядка), меченными ФИТЦ.

   │  Отмывка от несвязавшихся антител.

   │Люминесцентная микроскопия  (при  положительном  результате

   │видно свечение.

    _2 вариант

   │Фиксированные мазки музейных микробов (диагностикума),

   │+ (раститрованная)  _сыворотка больного

   │  Отмывка от несвязавшихся антител.

   │+ Антисыворотка против иммуноглобулинов (АТ второго  поряд-

   │  ка), меченными ФИТЦ.

   │  Отмывка от несвязавшихся антител.

   │Люминесцентная микроскопия  (при  положительном  результате

   │видно свечение.

    5Антисыворотку к  иммуноглобулинам кролика получают иммуниза-

 5цией барана иммуноглобулинами кролика.

    5Метод иммунной  флюоресценции  применяют  для  идентификации

 5риккетсий и других бактерий,  вирусов,  а также для определения

 5рецепторов и АГ-ов животных клеток человека и животных.

                  3ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)

                       ELISA-МЕТОД=РЭМА

             (Enzyme-linked immunosorbent assay =

                реакция энзим-меченных атомов)

    5Метод независимо  разработали  в  начале 70-х годов шведские

 5исследователи Энгвалл и Перлманн, голландские ван Веемен и Шуур

 5и американские исследователи под руководством Рубинстайна.

   К настоящему времени созданы многочисленные модификации  ба-

зовой методики  и наибольшее распространение получил гетероген-

ный ИФА на твердой фазе ( _твердофазный  ИФА .).  Коммерческие  МАТ

(или АГ) фиксируют на лукнах пластиковых панелей,  реже иммоби-

лизуют на бусах или нитроцеллюлозных мембранах. /2400к/

   Лунка иммунологической  планшеты  с  "пришитыми"  антигенами

(диагностические планшеты)

   │                │

   │                │  >── - АТ 41 0 (антитело первого порядка)

   │АГ>── 4Y 0          │ 4  Y

   │     │*         │  │   - АТ 42 0 (молекула АТ второго порядка,

   │                │            меченая пероксидазой хрена)

   └────────────────┘  *   - пероксидаза (ПХ) хрена

                             Н 42 0О 42 ─────  0Н 42 0О + [O]

                                    5ПХ 0         радикал кислорода

   + раствор Н 42 0О 42 0 и красителя (хромогена),

   изменяющего цвет в присутствии радикалов кислорода (орто-фе-

   нилендиамин) --- спектрофотометрия (под вертикальным лучом)

   После каждого  этапа обработки планшета промывается физраст-

вором или буфером.

    5ИФМ можно определить белки,  содержащиеся в количестве  нес-

 5кольких нанограммов в 1 мл. В качестве ферментных меток исполь-

 5зуют пероксидазу хрена,  глюкозоксидазу, бета-галактозидазу или

 5щелочную фосфатазу. 0

     5Этапы:

    5Первым этапом  является связывание моноспецифических антител

 5(или антигена,  если искомым белком является антитело) на твер-

 5дом субстрате, обычно на стенках пластиковой пробирки или план-

 5шеты. Связывание происходит путем физической адсорбции белка на

 5гидрофобной поверхности. 0

    5- Полистироловая  (полистереновых)  планшетка обрабатывается

 5антигеном для их сорбции (или антителами).

    5- Добавляется альбумин (забиваются все свободные сайты  свя-

 5зывания, чтобы не было затем неспецифической сорбции антител). 0

    5- Обработка антителами или сывороткой  больного,  содержащей

 5предполагаемую разновидность антител.

    5- Добавляется антисыворотка,  меченная ПХ (пероксидазой хре-

 5на).

    5- Приливается реактив АВТS  или  др.,  который  окрашивается

 5после воздействия пероксидазы. Можно использовать смесь переки-

 5си водорода и хромогена (ортофенилдиамина,  изменяющего окраску

 5в зависимости от количества радикальных форм кислорода от свет-

 5ло-желтой до коричневой).

    5- О наличии и количестве АТ судят по изменению цвета  и  ин-

 5тенсивности окраски  раствора.  Измерение интенсивности окраски

 5на спектрофотометре /СФ/. 0

    5[ИФМ можно проводить двумя путями - по непрямому (описанному

 5выше) и конкурентному типу.  В первом случае конкурентные отно-

 5шения отсутствуют: исследуемая биологическая жидкость реагирует

 5с твердофазными антителами,  после чего на удаляется из и в ре-

 5акцию вводят меченые ферментом  антитела,  которые  связываются

 5уже  иммобилизованным  антигеном.  В этом случае ферментативная

 5активность прямо пропорциональна количеству антигена в исследу-

 5емом материале.  Во втором случае антиген,  меченный ферментом,

 5конкурирует с немеченым исследуемым антигеном за выделенные  на

 5твердой фазе антитела, и ферментативная активность обратно про-

 5порциональна количеству антигена в исследуемом образце.]

    5В качестве твердой фазы используют вещества различного хими-

 5ческого состава -  полистирен,  полипропилен,  поливинил,  гели

 5декстрана, агарозы,  полиакриламида, целлюлозы, нитроцеллюлозы,

 5нейлон.

             3РАДИОИММУННЫЙ МЕТОД /АНАЛИЗ/ (РИМ=РИА)

              РИСТ - радиоиммуносорбентный метод

   Ставится аналогично ИФА,  но с использованием антител, мече-

ных радиоактивным изотопом.

   │                │

   │                │  >── - АТ 41 0 (антитело первого порядка)

   │АГ>── 4Y 0          │ 4  Y

   │     │*         │  │   - АТ 42 0 (молекула АТ второго порядка,

   │                │            меченая изотопом)

   └────────────────┘  *   - радиоактивная метка --- счетчик

                             радиоактивности

    Работа проводится в радиоизотопных лабораториях.

    Используются антитела,  меченные радиоактивным элементом  -

иодом ( 5125 0I,   5131 0I) или др. - с последующим измерением радиоак-

тивности.  Если  предыдущие  иммунохимические  методы  способны

улавливать  концентрацию  белка не ниже 1 мкг/мл,  то с помощью

РИМ можно определить концентрации,  измеряемые  в  пикограммах,

поэтому  метод РИА считается одним из подходящих количественных

методов иммунохимического анализа.

   Учет реакции  проводят  по убыванию или по возрастанию ради-

оактивности (в зависимости от методики РИА) с помощью специаль-

ных счетчиков бета- или гамма-излучения. Метод высокочувствите-

лен, но постепенно вытесняется  иммунофлюоресцентным  анализом.

/2551к/

                         3ИММУНОБЛОТТИНГ

                     и дот-микросвязывание

    1Постановка методики:

   │- Вертикальный электрофорез пробы в течение ночи

   │- Снятие отпечатка на нитроцеллюлозную бумагу (полоски

   │  или цельную)

   │- Инкубация полосок бумаги в растворе антисыворотки к иско-

   │  мому антигену. Промывка от несвязавшихся АТ.

   │- Инкубация  в растворе противовидовой антисыворотки (раст-

   │  воре АТ второго порядка), меченых ПХ (пероксидазой хрена)

   │- +  раствор Н 42 0О 42 0 и красителя,  изменяющего цвет в присутс-

      твии радикалов кислорода. Присутствие АГ расценивается по

      наличию окрашенных красителем пятен на бумаге.

    5Метод основан на разделении полипептидов в ПААГ (полиакрила-

 5мидном геле)  и  анализе  разделения иммунохимическими методами

 5после переноса разделенных белков на нитроцеллюлозную мембрану,

 5на которой белки доступны для любого вида твердофазного иммуно-

 5анализа (иммуноферментного или радиоиммунного).

    5Этапы:

    51. Электрофорез исследуемой смеси пептидов и маркеров с  из-

 5вестной молекулярной массой в ПААГ.

    52. Окраска геля нитратом серебра.

    53. Перенос следов белка на нитроцеллюлозную бумагу или мемб-

 5рану на  основе  нейлона  (отпечаток геля) с получением реплики

 5электрофореграммы. Процесс  переноса  называется блоттингом,  а

 5полученный отпечаток - блотом или блотограммой. 0

    54. Обработка  бумаги в полиэтиленовом пакете в антисыворотке

 5к исследуемым антигенам. Промывка.

    55. Обработка антителами к фракции иммуноглобулинов,  связан-

 5ных с пероксидазой или с биотином (ИФМ).

    56. Окраска авидин-пероксидазой или диаминбензидином с добав-

 5лением перекиси водорода. Промывка. Высушивание. 0

   .

                   3РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ /РН/

    _ 21) РН вирусов в цветной пробе (в культуре ткани).

              Допустим, у больного грипп типа В:

                 │   │       │   │       │   │

                 │   │       │РН │       │   │

                 ├───┤       ├───┤       ├───┤

                 │ В │       │ В │       │ В │

                 └───┘       └───┘       └───┘

               + АТ к А    + АТ к В    + АТ к С

           (+ антисыворотка  - " -    (+ антисыворотка

           к вирусу типа А)    │      к вирусу типа С)

                               │

                      Во второй пробирке

                      произойдет нейтра-

                      лизация вируса (РН).

                      Добавленные клетки

                      останутся живыми.

    1Постановка методики:

   │Вирусная культура

   │+ антисыворотка к белкам адгезии вирусов (НА)

   │  --- инактивация вируса (неспособность проникать  в клетки

   │  для репродукции)

   │+ культура клеток --- гибели нет (метаболизм клеток продол-

   │  жается, среда закисляется и окраска среды 199 меняется на

   │  желтую.

   При выявлении одного,  допустим,  из 3 типов вирусов  гриппа

(А,В,С) в 3 пробирки добавляют исследуемую культуру вируса (ал-

лантоисную жидкость куриного эмбриона), затем в каждую пробирку

свою антисыворотку (против А,  против В, против С) и после пре-

динкубации - культуру клеток в среде 199. В двух из трех проби-

рок АТ не свяжут вирусы,  вирусы проникнут в клетки; клетки по-

гибнут, метаболизм прекратиться (среда перестанет желтеть и ос-

танется исходной - малиновой).

    _ 22) РН вирусов в культуре ткани . 0 или курином эмбрионе по нейт-

рализации ЦПД.

   Ставится аналогично, но наблюдается не изменение цвета пита-

тельной среды, а (чаще под микроскопом) отсутствие ЦПД (цитопа-

тогенного действия вируса) - образование многоклеточного синци-

тия, гигантских многоядерных клеток, появление включений, вези-

куляция клеток и пр.

    _ 23) РН токсина антитоксической сывороткой

   а) in vitro

   - Реакция флоккуляции (хлопьеобразования)

   б) in vivo

    1-  0Например,  определение типа токсина Clostridium  botulinum

при ботулизме.  Клостридии  ботулизма  способны продуцировать 7

серотипов токсина - А,В,С,D,E,G,F,  из которых в  нашей  стране

встречаются чаще токсин типа А, типа В и типа Е.

   Допустим, человек отравился токсином Е:

            │   │            │   │            │   │

            │   │            │   │            │ РН│

            ├───┤            ├───┤            ├───┤

            │ Е │            │ Е │            │  2Е 0 │

            └───┘            └───┘            └───┘

          + АТ к А         + АТ к В          + АТ к  2Е

              │                │                │

       мышь погибнет     мышь погибнет     мышь выживет

   Токсин-содержащий материал разливают по 3 пробиркам и добав-

ляют в первую - антисыворотку к токсину А,

    во вторую - антисыворотку к токсину В,

     в третью - антисыворотку к токсину Е.

В 3 пробирке произойдет образование ИК, т.е. нейтрализация ток-

сина (РН). Для выявления данной пробирки содержимое вводят трем

мышкам. Третья мышь выживет.

    1Минимальной летальной  дозой  токсина 0  считается  количество

токсина. которое при подкожном введении  морской  свинке  весом

250г вызывает ее гибель в течение 4-5 дней.

   4) Феномен гашения сыпи (in vivo), например, при диагностике

скарлатины.

   Для диагностики скарлатины в область наиболее обильной  сыпи

вводят антисыворотку  к эритрогенному токсину;  если у больного

скарлатина, то сыпь в месте инъекции пропадает.

   5) РН для определения напряженности антитоксического иммуни-

тета к дифтерийному токсину (проба Шика),  скарлатинозному ток-

сину  (проба  Дика) в здоровом организме.

   В область предплечья внутрикожно вводят  определенное  коли-

чество соответствующего токсина (1/40 DLM).  При наличии в ога-

низме антитоксинов произойдет нейтрализация токсина  и  реакция

будет отрицательной. При отсутствии антитоксинов (антитоксичес-

ких АТ) в организме возникает воспалительная реакция (покрасне-

ние) на месте введения токсина. /2551к/

   Подкожное введение эритрогенного токсина иммунным лицам при-

водит к нейтрализации токсина (покраснения не будет).

              3РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)

    _ 5Реакции иммунного лизиса . используются в нескольких вариантах

    51) Для определения АТ к эритроцитам барана (ЭБ)

    52) Для определения HLA на В-лимфоцитах (лимфоциты  +  МАТ  к

 5определенному АГ  системы  HLA  + комплемент --- лизис клеток +

 5гемсистема - ЕА (эритроциты /Е/ барана,  нагруженные антителами

 5/А/ к ним /ЕА/). 6-12 ячеек из 100 будут с целыми эритроцитами,

 5остальные - с лизированными (ИК нет, нет активации комплемента,

 5нет  потребления  комплемента,  свободный  комплемента лизирует

 5ЭБ). РСК.

    53) Для определения титра АТ к любому АГ (РСК).

    4В реакциях иммунного лизиса специфические АТ взаимодействуют

 4с различными клетками,  в том числе с бактериями и простейшими,

 4что  приводит  к активации системы комплемента по классическому

 4пути и последующему лизису клеток.  Среди них известны  реакции

 4гемолиза и вибриолиза. /2400к/98/ 0

    5Реакция гемолиза  считается  активной при использовании АТ к

 5эритроцитам барана. При пассивной реакции иммунного лизиса про-

 5изводят  адсорбцию антигена на эритроцитах барана с последующим

 5добавлением искомых антител к АГ-ну и комплемента. 0

                2Определение титра антител по РСК

                2(реакции связывания  комплемента)

  1/10  1/100 5    01/1000 5 и т.д. (раститровка)

 = 10 5-1 0 = 10 5-2  0 10 5-3 0  5   010 5-4   0 10 5-5   0 10 5-6 0   10 5-7 0  5  0 10 5-7

 │   │  │   │  │   │  │   │  │   │  │   │  │   │  │   │  │   │

 │   │  │   │  │   │  │   │  │   │  │   │  │   │  │   │  │   │

 ├───┤  ├───┤  ├───┤  ├───┤  ├───┤  ├───┤  ├───┤  ├───┤  ├───┤

 │ о │  │ о │  │ о │  │ о │  │ - │  │ - │  │ - │  │ - │  │   │

 └───┘  └───┘  └───┘  └───┘  └───┘  └───┘  └───┘  └───┘  └───┘

 \________________________/  \_________________________/ Контроли

   Эритроциты барана целы    Эритроциты барана лизированы

 (муть или осевшие на дне)

    1Постановка методики:

   │- Раститровка сыворотки для определения титра АТ

   │+ АГ (музейная культура микробов, лекарственный препарат,

   │  анатоксин и пр. --- ИК в первых пробирках по убывающей

   │+ комплемент (сыворотка морской свинки) --- связывание ИК с

   │  C1q.  Инкубация 15 минут.

   │+ ЕА (гемсистема;  другой вид ИК). Инкубация 15 минут.

   │  --- Лизиса в первых пробирках нет, т.к. C1q весь связан с

   │  первым типом ИК.

   ┌────┐               ┌────┐

   │ АГ │               │ ЭБ │

   └──┬─┘  ┌────┐       └──┬─┘

      ├────┤ С  │          │   --- гемолиза эритроцитов нет

   ┌──┴─┐  └────┘       ┌──┴─┐     (положительная РСК)

   │ АТ │               │ АТ │

   └────┘               └────┘

     ИК                   ИК       [С- комплемент]

   ┌────┐               ┌────┐

   │ АГ │               │ ЭБ │

   └────┘       ┌────┐  └──┬─┘

                │ С  ├─────┤   --- гемолиз эритроцитов

   ┌────┐       └────┘  ┌──┴─┐     (отрицательная РСК)

   │ АТ │               │ АТ │

   └────┘               └────┘

 ИК нет или мало          ИК

 (антител к искомому

 АГ нет или мало)

    1Примечание 0:

   - Сыворотка  больного предварительно инактивируется от собс-

твенного комплемента (56 5о 0 20 минут), поскольку активность комп-

лемента у разных больных разная (сбои в результатах).

   - Предварительно отрабатывается рабочая доза АГ (не влияющая

сама по себе на реакции активации комплементарного каскада).

   - Подбирается рабочая доза комплемента (избыток  недопустим,

так как C1q будет оставаться и на ИК второго порядка).

   51. Приготовление 5% суспензии эритроцитов барана (Е):

      50,5 мл осадка отмытых эритроцитов + 9,5 мл физраствора.

   52. Определение  титра  гемолитической  сыворотки  (антител /А/

 5к эритроцитам барана):

    5Титром гемолитической сыворотки считается максимальное  раз-

 5ведение в объеме 0,5 мл, при котором наблюдается полный гемолиз

 50,5мл 3%  взвеси эритроцитов барана в присутствии 0,5мл компле-

 5мента (1:10).  Пробы выдерживаются при температуре 370С в тече-

 5ние 1 часа.

   53. Приготовление рабочего раствора  гемолитической  сыворотки

 5(1:3):

    5Например, исходный титр 1:2700;  2700 :  3 = 900, т.е. сыво-

 5ротку необходимо  развести  в 900 раз (взять 1/900 часть от ко-

 5нечного объема).  Если надо  10 мл  гемсистемы,  то нужно взять

 510:900=1/90мл=0,011мл исходной гемолитической сыворотки.

    54. Приготовление гемолитической системы (индикаторной систе-

 5мы для комплемента):

    5Смешиваются равные объемы 5%  суспензии эритроцитов барана и

 5гемолитической сыворотки  (1:6);  при этом сыворотка при непре-

 5рывном встряхивании выливается в суспензию  эритроцитов,  а  не

 5наоборот. Смесь встряхивается 5 минут и инкубируется 30 минут в

 5термостате. Отмывается.

    55. Определение рабочей дозы комплемента:

    5В качестве источника комплемента можно использовать сыворот-

 5ку здоровых доноров (при этом комплемент сыворотки  инактивиру-

 5ется прогреванием в течение 30 минут при 560С) или лиофилизиро-

 5ванную сыворотку морской свинки.

    5Титр комплемента - то наименьшее количество комплемента, ко-

 5торое будучи смешанным  с  0,5мл  гемолитической  сыворотки  (в

 5трехкратном титре),  гемолизирует 0,5мл 3% взвеси эритроцитов в

 5течение 30 минут.

    5Для титрования  пользуются  основным разведением комплемента

 51:10 и разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5мл.  Затем в каж-

 5дую пробирку  добавляют физраствор до 1,5мл и 1 мл гемолитичес-

 5кой системы.  Инкубируют 30 минут при 370С  и  определяют  титр

 5комплемента. Параллельно ставится два контроля - контроль гемо-

 5литической сыворотки (с физраствором) и контроль комплемента.

    5Определив титр комплемента,  высчитываем рабочую дозу, кото-

 5рая представляет собой титр комплемента, увеличенный на 20-30%,

 5так как комплемент в опыте подавляется антигеном.

    56. Определение рабочей дозы антигена:

    5Раститровывают антиген в конечном объеме 1мл, затем добавляют

 5комплемент, штатив встряхивают и оставляют на 1 час при 370С. К

 5смеси приливают  по  1мл  гемолитической системы и инкубируют 1

 5час.

     5Титром считается наименьшая доза,  при которой прекращается

 5задержка гемолиза,  т.е.  отсутствует его комплементарное дейс-

 5твие. Для постановки РСК берут рабочую дозу антигена, составля-

 5ющую примерно 1/2 - 2/3 ее титра во избежание  комплементарного

 5действия при постановке реакции.

    57. Постановка реакции РСК.

    5- Раститровывают сыворотку больного,  предварительно прогре-

 5тую при 520С в течение 20  минут  для  инактивации  собственной

 5системы комплемента.

    5- Добавляют рабочую дозу антигена,

    5- комплемента и инкубируют 10-30 минут при 370С.

    5- Затем вносится гемолитическая система и штатив инкубирует-

 5ся еще 30 минут при 370С.

    5Задержка гемолиза свидетельствует о наличии  антител  к  ис-

 5пользуемому антигену в  сыворотке больного.

    5Учет РСК с парными сыворотками. (титром специфических в дан-

 5ному антигену антител считается титр последнего разведения  сы-

 5воротки, полностью тормозящего гемолитическую реакцию.)

    5Титром гемолизина  считается наибольшее разведение гемолизи-

 5на, с которым получается полный гемолиз 0,5мл  взвеси  бараньей

 5крови в присутствии комплемента.

   Реакция Вассермана  (РСК) используется для диагностики сифи-

лиса. Антигеном служит экстракт пораженного органа  или  другой

аналогичный материал.

                 II.  _ 2ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

                2ЦЕПНАЯ ПОЛИМЕРАЗНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)

    5- Не  серологическая  (без использования АГ и АТ),  но также

 5гибридизации фрагментов ДНК и РНК. 0  5высокоспецифическая диагнос-

 5тическая реакция.

   ПЦР - чрезвычайно чувствительный метод, теоретически для по-

лучения результата достаточно иметь в среде одну молекулу  ДНК.

/2400к/

    5ПЦР была разработана Мюллесом в 1983г.  на основе технологии

   Методы ДНК-гибридизации и ЦПР используются для  геносистема-

тики и идентификации патогенных микроорганизмов. /2287к/96/

    1Основа метода 0 - катализируемое ДНК-полимеразой  многократное

образование копий (амплификация) определенного участка ДНК.

    1Этапы метода:

   │- термическое разделение 2-нитевой молекулы ДНК  на отдель-

   │  ные цепочки (30-40с. при 93-95 5о 0С),

   │- охлаждение среды и

   │- внесение праймеров,  комплементарных нуклеотидным  после-

   │  довательностям обеих цепочек.

   Для запуска реакции используют синтетические  _ 1праймеры . 0 - оли-

гонуклеотиды, состоящие из 10-20 нуклеотидов, взаимодействующие

с окончаниями  последовательностей  и образующие последователь-

ности в 50-1000 оснований. Затем в среду вносят термостабильную

полимеразу (tag-полимеразу  /от  вида  бактерии Thermus aquati-

cus/), что запускает образование  вторичных  копий  цепей  ДНК,

после чего образующиеся 2-нитевые молекулы ДНК снова подогрева-

ют. Образующиеся отдельные цепочки остужают,  вносят праймеры и

снова повторяют процедуру прогрева и охлаждения. /2400к/

   После 30-80 циклов накопления копий ДНК проводят их  иденти-

фикацию методом электрофореза. /2400к/

    5Для подтверждения принадлежности  ДНК  возбудителю  молекулы

 5можно подвергнуть  рестрикции специфическими эндонуклеазами или

 5провести реакцию ДНК-гибридизации. /2400к/

    5ПЦР позволяют  анализировать геномную ДНК или РНК-транскрип-

 5ты, выделенные из единственной клетки.  И хотя  эти  методы  не

 5требуют большого  количества  клеток,  их ограничения связаны с

 5доступностью специфических праймеров и их,  как правило, приме-

 5няли для  выявления  уже  известных  или  родственных им генов.

    5Такое ограничение  было преодолено после разработки методов,

 5позволивших амплифицировать весь спектр мРНК. В них использова-

 5лась природная  особенность всех мРНК нести поли(А+)-последова-

 5тельность на 3'-конце. Комплементарная ДНК (кДНК), полученная с

 5мРНК в реакции обратной транскрипции, приобретала таким образом

 5сайт связывания одного из праймеров  для  амплификации  в  ЦПР.

 5Другой  сайт  был  образован  путем  добавления гомополимерного

 5хвоста с помощью терминальной трансферазы. Однако все эти мето-

 5ды использовали стадию экстракции ДНК, что затрудняло их приме-

 5нение в отношении небольшого количества клеток. /2286к/96/ 0

   ┌──── 76 0  ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

   │       ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

   │        │

   │        │ термическая денатурация ДНК (95 5о 0)

   │       ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

   │

   │       ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

   │        │

   │        │ Отжиг праймеров

   │       ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

   │       ┴┴┴┴┴┴

   │                                         ┬┬┬┬┬┬ - праймер

   │       ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

   │        │

   │        │ Синтез комплементарных нитей ДНК при охлаждении

   │       ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

   │        2┴┴┴┴┴┴ 0┴┴┴┴┴┴┴┴┴

   │                        ┴  ┴  ┬ ┬

   │                                 ┬┬┬┬┬┬┬┬ 2┬┬┬┬┬┬

   │       ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

   │        │

   │        │ Завершение первого цикла

   │       ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

   │       ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

   │        +

   └─────  ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

и т.д.     ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

    5Этот недостаток был преодолен в работе Brady,  в которой все

 5стадии синтеза кДНК были проведены в одной первичной  клеточной

 5суспензии без единой экстракции. /2286к/96/

    5В последнее время стали пользоваться  большой  популярностью

 5магнитные бусы  фирмы "Dynal".  Последовательности олиго(дТ)25,

 5ковалентно сшитые с бусами,  позволяют легко выделять  мРНК  из

 5общего пула РНК или лизата клеток. /2286к/96/  (...)

    5Все стадии синтеза кДНК проводятся на магнитных бусах.  Воз-

 5можность работы с ДНК,  находящейся на магнитных бусах, в соче-

 5тании с ПЦР позволяет применять данный подход  к  малому  коли-

 5честву исходного материала. /2286к/96/

   Преимуществом метода является также возможность быстро полу-

чать вторые  цепи  кДНК  на  уже синтезированных первых цепях с

олиго(дЦ)-хвостами. Такие матрицы хорошо хранятся в буфере  при

4 5о 0С. /2286к/96/